专利名称：：一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法
技术领域：
：本发明涉及植物脱毒组培快繁
技术领域：
，尤其涉及一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法。
背景技术：
：浙贝母(Frj'"'"arj'a^朋&2^77Miq.)是百合科贝母属植物，其干燥鳞茎是著名中药材"浙八味"之一，是化痰止咳、治疗气管炎、感冒等呼吸道疾病的常用良药。浙贝母原产象山县，故又称象贝母。据传清康熙年间，象山农民开始将贝母从野生转入家种。一直以来，浙贝母以磐安、鄞州为主产地，约占全国浙贝母总产量的70%，江苏、江西、上海、湖北和湖南省亦有栽培。随着种植业结构调整的深入，近年来浙江省浙贝母的栽培面积迅速扩大。但在人工栽培中，浙贝母生产由于采用大鳞茎作种，其繁殖系数极低，约为1.61.8倍，用种量极大，用种500kg/亩，种子地下休眠期长，约4个月。浙贝母如此低的繁殖系数和如此高的耗种量，导致生产用地和留种地面积的增加及生产成本增加。同时，长期的营养繁殖导致浙贝母种质严重退化，鳞茎产量和品质下降，已成为严重地阻碍了浙贝母产业的发展的重要问题之一。近年来的研究揭示，植物病毒的侵染也是引起浙贝母种质退化的主要原因之一。最近我们在浙江磐安县田间对浙贝母进行调査发现，绝大部分植株均表现花叶和斑驳等典型的马铃薯Y病毒科成员侵染症状。通过对该病毒病原的普通生物学、血清学特征和基因组全序列的研究，结果表明存在二种新病毒的复合侵染，一种是浙贝母花叶病毒(ThunbergfritillarymosaicVirus,TFMV)，另一种命名为贝母Y病毒(/^rj'^7Z32TvirusY，FVY)，该病毒病害普遍发生是引起浙贝母种质严重退化的重要原因之一；同时提出以田间浙贝母上发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达制备成病毒特异性抗血清，对浙贝母植株样品进行病毒ELISA检测的方法(WeiCBetal.(2005)ArchivesofVirology,150:1271-1280;ChenJetal.(2006)ArchivesofVirology,151:439-447;韦传宝等(2006).科技通报，22(4):506-509)。浙贝母茎尖脱毒组培培养研究到目前为止尚未见报道。因此建立浙贝母脱毒组培快繁技术体系，生产优质无病毒种球，为真正实现GAP栽培和规模化生产提供技术平台，具有较大的应用前景。
发明内容本发明目的是，针对现有浙贝母常规生产繁种技术中采用大鳞茎作种，繁殖系数极低，用种量极大，种子地下休眠期长，生产和留种地面积大，并有植物病毒侵染，导致品质差，产量低，生产成本高等缺陷；提供一种能大量、快速繁殖鳞茎，又能脱除鳞茎所带病毒并经特异检测，以确保无毒的浙贝母鳞茎脱毒、组培与检测的配套方法。本发明目的通过以下技术方案来实现一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，按如下步骤进行(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为1)基本培养基子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基;鳞茎生根培养基用1/2MS培养基；其中，蔗糖或白糖2040g/L，琼脂79g/L，pH5.65.8;2)子鳞茎诱导培养基MS+2，4-D0.51.5mg/L+ZTl3mg/L;3)子鳞茎增殖培养基MS+BAl3mg/L+NAA13mg/L+盐酸硫胺素(VB!)4mg/L;4)壮苗培养基MS+BA0.51.5mg/L+NAA0.51.5mg/L+盐酸硫胺素(VB!)4mg/L;5)鳞茎生长培养基MS+BA0.llmg/L+NAA0.1lmg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;6)鳞茎生根培养基1/2MS+NAA0.1lmg/L+盐酸硫胺素(VB!)4mg/L;(2)浙贝母脱毒组培鳞茎的培养1)外植体的选取、培育与处理①取浙贝母新生长的鳞茎、嫩茎或花梗，经灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料；②子鳞茎诱导培养将外植体材料在无菌条件下，切成0.30.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养12个月后，诱导形成子鳞茎；③子鳞茎增殖培养将诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养3045天增殖出子鳞茎；④壮苗培养将增殖的子鳞茎在4。C低温、光强20003000Lx，光照时间12h/d下处理l周，然后在培养条件下培养3045天长成苗高57cm的壮苗；⑤热处理将壮苗在35'C、光强20003000Lx，光照时间12h/d下处理24周后，供茎尖培养用；⑥茎尖培养:将热处理后的组培壮苗在40倍双筒解剖镜下，摘出0.20.5mm长带12个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体；2)子鳞茎诱导培养将外植体茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养12个月后，诱导形成子鳞茎；3)子鳞茎增殖培养将子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养3045天增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔3045天按同样方法进行子鳞茎再增殖；4)子鳞茎生长培养将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养3045天，使鳞茎长大到O.5lcm;5)生根培养:将长大的子鳞茎接种在生根培养基上，在培养条件下培养2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出35根根系；6)移栽待生根子鳞茎苗高生长至57cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养12个月至成苗。(3)、病毒ELISA检测将田间病株所携带的浙贝母花叶病毒(/riz^7h/ymosaicVirus,TFMV)和贝母Y病毒(尸r"j7Zg2yvirusY，FVY)，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备成病毒特异性抗血清后，对浙贝母脱毒组培鳞茎进行病毒ELISA检测。所述的培养基配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基；鳞茎生根培养基用1/2MS培养基；其中，琼脂7g/L，pH5.8;(2)子鳞茎诱导培养基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;(3)子鳞茎增殖培养基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L;(4)壮苗培养基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L;(5)鳞茎生长培养基白糖40g/L的MS十BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;(6)生根培养基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+盐酸硫胺素(VB:)4mg/L。所述的灭菌处理是将外植体的材料经75%酒精浸泡0.51.Omin，再用0.升汞水溶液浸泡1015min，最后用无菌水冲洗35次。所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为23±2°C，光照光强为20003000Lx，光照时间为12h/d。所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l:2:1配制而成。本发明的有益效果是1)本发明在探明造成浙贝母种球退化的原因，系由浙贝母花叶病毒(f力〃/z6er^/rj'"7Jar7mosaicVirus,TFMV)禾口贝母Y病毒(Frj'fJZsiyvirusY，FVY)混合感染致使发病的基础上，建立的浙贝母病毒(TFMV和FVY)外壳蛋白基因RT-PCR扩增、克隆、原核表达及高灵敏度ELISA检测体系，通过该检测技术应用，可保证脱毒子鳞茎中无病毒存在，为进一歩控制病毒病发生传播，浙贝母品种提纯复壮奠定了基础；2)建立的浙贝母脱毒组培快繁技术体系，脱毒效果好，鳞茎增殖快，其月增殖率可达4.5倍，其生根率达100%,移栽成活率达95%以上，适合工厂化育苗，可商品化生产，从而大大节省了传统方法的繁种用地，显著降低了浙贝母的生产成本；3)脱毒鳞茎可比常规未脱毒鳞茎增产1020%，按亩产量1000Kg计算，每亩可增产100200Kg，并显著提高了浙贝母的产品质量。具体实施方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。2，4-D:2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyaceticacid)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99.5%。ZT:玉米素(Zeatin)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99%。BA:6-节氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99.9%。NAA:a-萘乙酸(l-Naphthylaceticacid)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99.5%。盐酸硫胺素(VBt):美国进口国内分装，分析纯，纯度99%。水解酪蛋白(CH):sigma公司进口，分析纯。实施例1:一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，按如下步骤进行(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为1)基本培养基子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基;鳞茎生根培养基用1/2MS培养基；其中，琼脂7g/L，pH5.8;2)子鳞茎诱导培养基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;3)子鳞茎增殖培养基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L;4)壮苗培养基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+盐酸硫胺素眞)4mg/L;5)鳞茎生长培养基白糖40g/L的MS+BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;6)生根培养基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+盐酸硫胺素(跳)4mg/U(2)浙贝母脱毒组培鳞茎的培养1)外植体的选取、培育与处理①取浙贝母新生长的鳞茎，经75%酒精浸泡0.8min，再用0.1%升汞水溶液浸泡13min，最后用无菌水冲洗35次进行灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料；②子鳞茎诱导培养将外植体材料在无菌条件下，切成0.30.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，在温度23士2。C，光强2500Lx，光照时间12h/d的培养条件下培养12个月后，诱导形成子鳞茎；③子鳞茎增殖培养将诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在与步骤(2)-1)-②相同培养条件下培养3045天增殖出子鳞茎；④壮苗培养将增殖的子鳞茎在4。C低温、光强20003000Lx，光照时间12h/d下处理1周后，在与步骤(2)-1)-②相同培养条件下培养3045天长成苗高57cm的壮苗；⑤热处理将壮苗在35'C、光强20003000Lx，光照时间12h/d下处理3周后，供茎尖培养用；⑥茎尖培养:将热处理后的组培壮苗在40倍双筒解剖镜下，摘出0.20.5mm长带12个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体；2)子鳞茎诱导培养将茎尖外植体接种在子鳞茎诱导培养基上，在与步骤(2)-1)-②相同培养条件下培养12个月后，诱导形成子鳞茎；3)子鳞茎增殖培养将子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在与步骤(2)-l)-②相同培养条件下培养3045天增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔3045天按同样方法进行子鳞茎的再增殖；4)子鳞茎生长培养将增殖出的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在与步骤(2)-1)-②相同培养条件下培养3045天，使鳞茎长大到0.5lcm;5)生根培养将长大的子鳞茎接种在生根培养基上，在与步骤(2)-1)-②相同培养条件下培养2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；6)移栽待生根子鳞茎苗高生长至35cm、根长出5根以上时，移栽到由泥炭珍珠岩蛭石按体积l:2:l配制而成的基质中，培养12个月至成苗。(3)病毒ELISA检测1)、浙贝母病毒病原种类的鉴定①取病样取浙贝母花叶病害病样，-8(TC储存备用；②电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态；③病毒种类RT-PCR检测和鉴定对侵染浙贝母2种病毒的序列分别合成扩增各种病毒外壳蛋白基因的引物；以植物总RNA为模板，逆向引物(_)合成病毒第一链cDNA，进而以此cDNA为模板，采用TaKaRa公司LATaqTMPCR体系或￡T7agDNA聚合酶体系，对各种病毒逐一进行RT-PCR检测；2)病毒ELISA检测由于浙贝母通常含有本发明人鉴定明确的浙贝母花叶病毒(r力^2^T^/rWWafymosaicVirus,TFMV)禾口贝母Y病毒OW"War"irusY,FVY)2种病毒，而这2种病毒又难以分离纯化，从而将上述2种病毒外壳蛋白基因，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备成病毒特异性抗血清，作为浙贝母脱毒组培鳞茎的病毒ELISA检测之用。实施例2:本例中，其基本培养基的琼脂为9g/L，pH为5.6;子鳞茎诱导培养基为蔗糖20g/L的MS+2，4-DO.5mg/L+ZTlmg/L;子鳞茎增殖培养基为白糖30g/L的MS十BAlmg/L+NAA3mg/L+盐酸硫胺素(VB!)4mg/L;壮苗培养基为白糖20g/L的MS+BA1.5mg/L和NAA0.5mg/L+盐酸硫胺素(VB丄)4mg/L;鳞茎生长培养基为白糖20g/L的MS+BA0.lmg/L+NAAlmg/L+盐酸硫胺素(VBt)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;生根培养基为白糖30g/L的1/2MS+NAA0.lmg/L+盐酸硫胺素(VB!)4mg/L;取浙贝母新生长的嫩茎，经75%酒精浸泡0.5min，再用0.1%升汞水溶液浸泡10min，最后用无菌水冲洗35次进行灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料;将壮苗在35°C、光强20003000Lx，光照时间12h/d下进行处理热2周后，供茎尖培养用；以温度23土2°C，光强2000Lx，光照时间12h/d为培养条件；其余步骤，条件均同于实施例1。实施例3:本例中，其基本培养基的琼脂为8g/L，pH为5.7;子鳞茎诱导培养基为蔗糖40g/L的MS+2，4-D1.5mg/L+ZT3mg/L;子鳞茎增殖培养基为白糖20g/L的MS十BA3mg/L+NAAlmg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L;壮苗培养基为白糖30g/L的MS+BA0.5mg/L和NAAL5mg/L+盐酸硫胺素(VB丄)4mg/L;鳞茎生长培养基为白糖30g/L的MS+BAlmg/L+NAA0.lmg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;生根培养基为白糖40g/L的1/2MS+NAAlmg/L+盐酸硫胺素(VBi)4mg/L;取浙贝母新生长的花梗，经75%酒精浸泡1.0min，再用0.1%升汞水溶液浸泡15min，最后用无菌水冲洗35次进行灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料；将壮苗在35。C、光强20003000Lx，光照时间12h/d下进行热处理4周后，供茎尖培养用；以温度23士2°C，光强3000Lx，光照时间12h/d为培养条件；其余步骤，工艺、条件均同于实施例1。试验例(病毒检测)1、对照材料从田间采集的浙贝母病叶鳞茎为材料。2、处理材料以实施例l、2或3获得的脱毒组培鳞茎为材料。3、病毒ELISA检测由于浙贝母常含有2种病毒复合侵染，通常病毒难以分离纯化，从而应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用。4、检测结果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，其特征在于按如下步骤进行(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为1)基本培养基子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基；鳞茎生根培养基用1/2MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；2)子鳞茎诱导培养基MS+2，4-D0.5～1.5mg/L+ZT1～3mg/L；3)子鳞茎增殖培养基MS+BA1～3mg/L+NAA1～3mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；4)壮苗培养基MS+BA0.5～1.5mg/L+NAA0.5～1.5mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；5)鳞茎生长培养基MS+BA0.1～1mg/L+NAA0.1～1mg/L+盐酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L；6)鳞茎生根培养基1/2MS+NAA0.1～1mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；(2)浙贝母脱毒组培鳞茎的培养1)外植体的选取、培育与处理①取浙贝母新生长的鳞茎、嫩茎或花梗，经灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料；②子鳞茎诱导培养将外植体材料在无菌条件下，切成0.3～0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月后，诱导形成子鳞茎；③子鳞茎增殖培养将诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出子鳞茎；④壮苗培养将增殖的子鳞茎在4℃低温、光强2000～3000Lx，光照时间12h/d下处理1周，然后在培养条件下培养30～45天长成苗高5～7cm的壮苗；⑤热处理将壮苗在35℃、光强2000～3000Lx，光照时间12h/d下处理2～4周后，供茎尖培养用；⑥茎尖培养将热处理后的组培壮苗在解剖镜下，摘出0.2～0.5mm长带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体；2)子鳞茎诱导培养将外植体茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月后，诱导形成子鳞茎；3)子鳞茎增殖培养将子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；4)子鳞茎生长培养将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养30～45天，使鳞茎长大到0.5～1cm；5)生根培养将长大的子鳞茎接种在生根培养基上，在培养条件下培养20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出3～5根根系；6)移栽待生根子鳞茎苗高生长至5～7cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗。(3)、病毒ELISA检测将田间病株所携带的浙贝母花叶病毒(ThunbergfritillarymosaicVirus，TFMV)和贝母Y病毒(FritillaryvirusY，FVY)，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备成病毒特异性抗血清后，对浙贝母脱毒组培鳞茎进行病毒ELISA检测。2、按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基；鳞茎生根培养基用1/2MS培养基；其中，琼脂7g/L，pH5.8;(2)子鳞茎诱导培养基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;(3)子鳞茎增殖培养基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+盐酸硫胺素4mg/L;(4)壮苗培养基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+盐酸硫胺素4mg/L;(5)鳞茎生长培养基白糖40g/L的MS+BA0.5mg/L禾口NAA0.5mg/L+盐酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L;(6)生根培养基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+盐酸硫胺素4mg/L。3、按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的灭菌处理是将外植体材料经75%酒精浸泡0.51.Omin，再用0.1%升汞水溶液浸泡1015min，最后用无菌水冲洗35次。4、按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为23士2。C，光照光强为20003000Lx，光照时间为12h/d。5、按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l:2:1配制而成。全文摘要本发明涉及一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，属植物种苗繁殖
技术领域：
，专用于浙贝母脱毒苗的繁殖与病毒的检测。该方法包括培养基的配制；脱毒组培鳞茎的培养；病毒ELISA检测等步骤。具有脱毒效果好，病毒检测灵敏度高，可保证脱毒子鳞茎中无病毒存在，有效控制了病毒病的发生与传播；鳞茎增殖快，月增殖率可达4.5倍，适合工厂化育苗，大大节省了传统方法的繁种用地，显著降低了浙贝母的生产成本；可在浙贝母品种提纯复壮与开发中推广应用。文档编号A01H4/00GK101213937SQ200710306829公开日2008年7月9日申请日期2007年12月28日优先权日2007年12月28日发明者吕永平,刚徐,林林,汪一婷,牟豪杰,晔程,郑红英,陈剑平申请人:浙江省农业科学院