专利名称：枸骨根茎提取物制备方法及制剂以及在制备心血管药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种枸骨根活性组分的制备方法及其制剂的制备方法与其在制备制备心血管药物中的应用，该活性组分具有显著的扩张冠状动脉及抗心肌缺血再灌注损伤活性，可以用来制备冠状动脉性心脏病的药物。
背景技术：
枸骨根茎药材取自冬青科枸骨属植物枸骨根茎ahizome of Ilex cornuta (Lindl.))的干燥根和茎，根味苦，性凉，无毒，功能补肝肾，健腰膝，除风湿，凉血清热。主治肝肾不足，腰膝疾弱，关节疼痛，头风，牙痛。近年来国内外学者从枸骨属植物中分离鉴定出几种黄酮及其苷类和几十种五环三萜皂苷成分，这些皂苷主要为齐墩果烷型和乌苏烷型两种。陈小夏等通过缺血再灌注损伤模型，离体血管条，血液流变学实验，发现枸骨根茎的水提液能增加离体鼠心脏的冠脉流量，提高心脏的耐缺氧能力，对垂体后叶素引起的大鼠急性心肌缺血有保护作用，还能增加脑血流量。还有文献报道本属植物中所含的活性成分ilexoside具有较好的抗血小板凝集活性，降压作用，降脂和抗菌消炎作用。经过反复研究发现枸骨根茎中治疗冠状动脉性心脏病的活性组分主要由10种皂苷类成分和3种黄酮类成分组成，我们经过了系统研究，准备开发以该活性组分为主要成分的治疗冠状动脉性心脏病药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种枸骨根茎活性组分的制备方法及其制剂的制备方法，还提供枸骨根茎活性组分在制备冠状动脉性心脏病药物中的新用途。枸骨根茎活性组分的制备方法，其中将枸骨根茎药材，切断或粉碎成粗粉，用 6-12倍量水或乙醇加热回流提取2-3次，每次l_3h，过滤，合并滤液；上述滤液减压浓缩， 析胶，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，收集50-80%乙醇洗脱液，脱色，回收溶剂，干燥，即得枸骨根茎活性组分，枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分中皂苷类成分含量为70%以上。本发明中皂苷类成分含量的测定方法 “ 1、乌苏酸对照品溶液的制备
精密称取乌苏酸对照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0. lmg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。2、乌苏酸最大吸收波长的确定
精密吸取对照品溶液lml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸， 摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200 700nm波长范围内进行扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为 310nmo3、标准曲线的绘制
精密移取对照品溶液0. 3,0. 6,0. 9，1. 2，1. 5,1.8 mL各2份(一份做空白，一份做显色)，转移至IOmL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇， 显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在 200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，乌苏酸对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为 C=O. 021A+0. 016，R2=0. 999 (n=3)，线性范围为6. 2 31. 0 μ g/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好。4、样品中皂苷类成分含量测定方法
取枸骨根茎药材适量，粉碎，称取药材34. 90g,用10倍量70%乙醇(即350ml )，提取2 次，每次1. 5小时，所得溶液用中速滤纸过滤，浓缩至IOOml以下，转移至IOOml的容量瓶， 定容至刻度，即得0. 349g/ml的枸骨根茎提取物；移取枸骨根茎提取液1ml，转移至250ml 的容量瓶中，定容至刻度，即得1. 396mg/ml的枸骨根茎供试品溶液。精密吸取供试品溶液 lml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm处测定其吸收度。由标准曲线求得枸骨根茎有效组分样品中总皂苷浓度并计算含量。” 上述引号中的检测方法简称为枸骨皂苷检测法。在本发明下文中将多次引用枸骨皂苷检测法。本发明所述枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分，其提取方法为
枸骨根茎活性组分的制备方法，将枸骨根茎药材粉碎成粗粉，用0-95%乙醇浸泡 0. 5-2h,6"12倍量加热回流提取2-3次，每次l_3h，过滤，合并滤液；上述滤液于50-70°C 减压浓缩至0. 5-1. Og生药材/mL，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用6-12倍量蒸馏水、 20-40%乙醇洗脱，50-80%乙醇洗脱，洗脱流速为1. 0-2. Oml/min,收集50-80%乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于50-70°C减压浓缩至无乙醇味，浓缩液0-4°C冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量3-10%的聚酰胺，搅拌0. 5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌 0. 5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得枸骨根茎活性组分。其中大孔树脂可以选择各种型号的皂苷类吸附树脂，包括D4020型、NKA-9型、AB-8型、 ZTC型、DlOl型及ADS-F8型，优选DlOl型和DlOlC型大孔树脂。本发明枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分可以用于制备冠状动脉性心脏病治疗或用于冠状动脉性心脏病辅助治疗的药物，该活性组分可以作为活性成分与药物载体配制成药剂学上的各种制剂，枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体，该制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分中化学成分的HPLC标定1、混合对照品溶液的制备将10种皂苷类成分对照品，精密称定各约10 20mg，分别置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作为储备液，精密量取各储备液2mL，分别置于25 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇勻，作为每种对照品溶液；精密量取各储备液2mL， 置于同一个25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇勻，作为10种对照品溶液。2、供试品溶液的制备取枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分粉末约50mg， 精密称定，置于50mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，滤过，取续滤液IOmL作为供试品溶液。3、色谱条件色谱柱Diamonsil C18 色谱柱 6 mm X250 mm, 5μπι);流动相甲醇-水梯度洗脱(甲醇0 min为40%，90 min为90%，120 min为90%) ；UV检测波长 203 nm，流速1. 0 mL/min ；柱温35°C ；进样量 20ml ； ELSD 检测器:SHIMADZU ELSD-LT II 型检测器；检测温度40°C;ELSD载气高纯氮气载气压力0. 35MPa。8种对照品溶液液相色谱图(图1)和供试品溶液的液相色谱图(图2)其中1为3A -0- α -L-吡喃阿拉伯糖基坡模酸，2为3Α -0- α -L-吡喃阿拉伯糖基-19 α -羟基齐墩果酸，3为3 A -Q-β -D-吡喃葡萄糖基坡模酸，4为3 A -Q-β -D-吡喃葡萄糖基-19 α -羟基齐墩果酸U -D-葡萄糖苷， 5为Ζβ -0- α -L-吡喃阿拉伯糖基坡模酸-28-Α -D-葡萄糖苷，6为3 A _0_ α -L-吡喃阿拉伯糖基-19 α -羟基齐墩果酸-28-Α -D-葡萄糖苷，7为3 A -Q-β -D-吡喃葡萄糖基坡模酸-28-A -D-葡萄糖苷，8为3 A -O-A -D-吡喃葡萄糖基-19 α -羟基齐墩果酸普β -D-葡萄糖苷，9为3Α-O-A-D-吡喃葡萄糖(1 — 2)-a-L-阿拉伯糖基坡模酸-28-A-D-葡萄糖苷，10为3A-0-a -L-吡喃葡萄糖(1 — 2)-a-L-阿拉伯糖基-19 α -羟基齐墩果酸-28-A-D-葡萄糖苷。
图1是10种皂苷对照品液相色谱图； 图2是供试品溶液液相色谱图。
具体实施例实施例一、枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分制备方法，其中将枸骨根茎药材粉碎成粗粉，用50%乙醇浸泡0. 5h，12倍量加热回流提取3次，每次1. 5h,过滤，合并滤液。上述滤液于70°C减压浓缩至1. Og生药材/mL，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇萃取，减压回收正丁醇，残留物用水溶解并稀释至浓度为1. Og生药材/mL，滤过，滤液上DlOl大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总皂苷/g湿树脂，上样液总皂苷浓度10mg/ml、上样流速l.Oml/min、上样液pH值为7. 0，上样后依次用8倍量蒸馏水、30%乙醇洗脱，60%乙醇洗脱洗脱流速为1. 5ml/min,收集60%乙醇洗脱液。上述洗脱液于70°C减压浓缩至无乙醇味(相对密度为1. 10g/ml (50 60°C))，浓缩液0-4°C冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5%的聚酰胺，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液中再加入生药量1的活性炭，搅拌2h，静置 12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，进风温度为140°C，出风温度为90°C，收集喷干粉， 即得。经上述皂苷检测法检测，总皂苷含量为68%。实施例二、枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分制备方法，其中将枸骨根茎药材粉碎成粗粉，用50%乙醇浸泡0. 5h，12倍量加热回流提取3次，每次1. 5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70°C减压浓缩至1. Og生药材/mL，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇萃取，减压回收正丁醇，残留物用水溶解并稀释至浓度为1. Og生药材/mL，滤过，滤液上AB-8大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总皂苷/g湿树脂，上样液总皂苷浓度10mg/ml、 上样流速1. Oml/min、上样液pH值为7. 0，上样后依次用12倍量蒸馏水、20%乙醇洗脱，60% 乙醇洗脱洗脱流速为1. 5ml/min,收集60%乙醇洗脱液。上述洗脱液于70°C减压浓缩至无乙醇味(相对密度为1. 07g/ml (50 60°C))，浓缩液0-4°C冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5%的聚酰胺，搅拌池，静置12h，滤过，滤液中再加入生药量1的活性炭，搅拌池，静置 12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，进风温度为140°C，出风温度为90°C，收集喷干粉， 即得。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为75%。其余同实施例一。实施例三枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分制备方法，其中将枸骨根茎药材粉碎成粗粉，用50%乙醇浸泡0. 5h，12倍量加热回流提取3次，每次1. 5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70°C减压浓缩至1. Og生药材/mL，0-4°C冷藏过夜，析胶，滤过，滤液上 HPD-450大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总皂苷/g湿树脂，上样液总皂苷浓度10mg/ml、上样流速1. Oml/min、上样液pH值为7. 0，上样后依次用12倍量蒸馏水、20%乙醇洗脱，60%乙醇洗脱洗脱流速为1. 5ml/min,收集60%乙醇洗脱液。上述洗脱液于70°C减压浓缩至无乙醇味(相对密度为1.07g/ml (50 60°C))，浓缩液0-4°C冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5%的聚酰胺，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液中再加入生药量1的活性炭，搅拌2h，静置 12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，进风温度为140°C，出风温度为90°C，收集喷干粉， 即得。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为80%。其余同实施例一。实施例四-1、枸骨根茎活性组分的制备方法，其中将枸骨根茎药材粉碎成粗粉， 用10%乙醇浸泡0. 5h, 6倍量加热回流提取2次，每次lh，过滤，合并滤液；上述滤液于50°C 减压浓缩至0. 5g生药材/mL，0°C冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用6倍量蒸馏水、20%乙醇洗脱，50%乙醇洗脱，洗脱流速为1. Oml/min,收集50%乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于50°C减压浓缩至无乙醇味，浓缩液0°C冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5%的聚酰胺，搅拌0. 5h,静置4h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌0. 5h,静置4h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得枸骨根茎活性组分。经上述皂苷检测法检测，总皂苷含量为85%。其余同实施例一。实施例四_2、枸骨根茎活性组分的制备方法，其中将枸骨根茎药材粉碎成粗粉， 用95%乙醇浸泡2h，12倍量加热回流提取3次，每次池，过滤，合并滤液；上述滤液于70°C 减压浓缩至1. Og生药材/mL，4°C冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用12倍量蒸馏水、40%乙醇洗脱，70%乙醇洗脱，洗脱流速为2. Oml/min,收集70%乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于70°C减压浓缩至无乙醇味，浓缩液4°C冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量15%的聚酰胺，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得枸骨根茎活性组分。经皂苷检测法检测，总皂苷含量为 74%。其余同实施例一。实施例四_3、枸骨根茎活性组分的制备方法，其中将枸骨根茎药材粉碎成粗粉， 用50%乙醇浸泡lh，8倍量加热回流提取2. 5次，每次池，过滤，合并滤液；上述滤液于60°C减压浓缩至0. 7g生药材/mL，3°C冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用8倍量蒸馏水、30%乙醇洗脱，60%乙醇洗脱，洗脱流速为1. 5ml/min,收集60%乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于60°C减压浓缩至无乙醇味，浓缩液3°C冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量10%的聚酰胺，搅拌池，静置6h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌3h，静置6h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得枸骨根茎活性组分。经皂苷检测法检测，总皂苷含量为 75%。其余同实施例一。实施例五、枸骨根茎活性组分的制备方法，其中所述的大孔吸附树脂可以是 D4020型、NKA-9型、AB-8型、ZTC型、HPD型、DlOl型、DlOlC型及ADS-F8型吸附树脂中的一种或两种以上。其余同实施例四_1、2、3。实施例六、枸骨根茎活性组分的制备方法，其中所述的大孔吸附树脂可以是优选 DlOl型和DlOlC型大孔吸附树脂。其余同实施例四_1、2、3。实施例七、枸骨根茎活性组分在制备冠状动脉性心脏病治疗药物中的应用，其中 枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分中皂苷类成分含量为70%以上。其余同实施例
ο实施例八、所述枸骨根茎活性组分制成的制剂，其中该枸骨根茎活性组分与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂。其余同实施例四至七中的任意一项。实施例九、所述枸骨根茎活性组分制成的制剂，其中该枸骨根茎活性组分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。其余同实施例八。实施例十、所述的枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分，其中该制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。其余同实施例八。实施例i^一、用本发明实施例一或实施例二或实施例三或实施例四-1或实施例四-2或实施例四-3或实施例五或实施例六或实施例七中的方法制备的活性组分为原料， 进行下列制剂制备
1、片剂制备处方(50片)
成分重量(g)
本发明活性组分5.0
乳糖4.8
糊精9
微晶纤维素6
硬脂酸镁0. 2
按照常规片剂的操作方法，以上混合均勻，湿法制粒，最后加入硬脂酸镁混合均勻压制成每片500mg。2、胶囊制备处方(90粒)
成分重量(g)
本发明活性组分8
乳糖5糊精9
微晶纤维素5
按照常规片剂的操作方法，以上混合均勻，湿法制粒，灌装成胶囊，每粒300mgt;
3、巴布剂制备
处方 成分
本发明活性组分
聚丙烯酸酯月桂氮卓酮月桂酸丙二醇乙酸乙酯
重量(g) 2 18 0. 6 1. 8 5. 4 15
按照通常巴布剂的做作进行，将上述搅拌均勻，涂布于聚酯防粘层上，60度干燥2分钟后，覆盖聚氨基甲酯膜背衬层，切片即可。4、粉针剂制备处方
成分重量(g)
本发明活性组分0.05
盐酸适量
甘露醇50
按照常规冻干粉针的操作进行，将本发明活性组分加适量注射用水溶解，加入甘露醇， 定容至1000ml，调节PH值至4.0 — 5. 5之间，除菌过滤，冷冻干燥即得。5、水针剂的制备
枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分，溶于适量注射用水中，加入计量的注射用水溶性辅料，加0. 1-0. 5%的活性炭除去热原，调节PH至6. 0-7. 5，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量，灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封/轧盖，经检验合格后，包装即得。6、滴丸剂制备
处方 成分
本发明活性组分聚乙二醇6000 聚乙二醇4000 聚山梨酯80 乙醇制成
重量(g) 0. Ig IOg 20g 0. 3g Iml 1000 丸
制法将本发明枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分溶解于乙醇中，成为活性组分分散乙醇液，加入已熔融的聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚山梨酯80组成的基质中，充分搅拌至均勻，以二甲基硅油为冷却剂，15°C下滴制成丸，擦丸，干燥，即得。
实施例十二、用本发明实施例一中的方法制备的活性组分为原料，进行冠状动脉性心脏病治疗药效学研究。 1、DPPH法测定枸骨根茎提取物清除自由基的能力
将不同浓度的枸骨根茎提取物溶液100 μ 1和1 mM的DPPH试液100 μ 1于96孔酶标板中，每个浓度做3个平行孔。样品加入后震荡30 s，在37 °C和517 nm波长下测定其吸光值(Ap )；同时测定不加DPPH的样品空白吸收光值(Ac)和加DPPH但不加样品(以100 μ 1甲醇代替样品)的吸光值(A max)。自由基清除率(％) =[1_ ( Ap-Ac)/ A max] XlOO %。结果表明枸骨根茎提取物对自由基的清除率高达86. 35%。结果见表1。 表1清除自由基实验
权利要求
1.枸骨根茎提取物及其制备方法，其特征在于提取物中皂苷类成分含量为70%以上；提取物中皂苷类成分含量的测定方法如下A、乌苏酸对照品溶液的制备精密称取乌苏酸对照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0. lmg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用；B、乌苏酸最大吸收波长的确定精密吸取对照品溶液lml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸， 摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200 700nm波长范围内进行扫描；结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为 3IOnm ；C、标准曲线的绘制精密移取对照品溶液0. 3,0. 6,0. 9，1. 2，1. 5,1.8 mL各2份(一份做空白，一份做显色)，转移至IOmL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇， 显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在 200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度；以吸收度为纵坐标，乌苏酸对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为 C=O. 021A+0. 016，R2=0. 999 (n=3)，线性范围为6. 2 31. 0 μ g/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好；D、样品中皂苷类成分含量测定方法取枸骨根茎药材适量，粉碎，称取药材34. 90g，用10倍量70%乙醇(即350ml)，提取2 次，每次1. 5小时，所得溶液用中速滤纸过滤，浓缩至IOOml以下，转移至IOOml的容量瓶， 定容至刻度，即得0. 349g/ml的枸骨根茎提取物；移取枸骨根茎提取液1ml，转移至250ml 的容量瓶中，定容至刻度，即得1. 396mg/ml的枸骨根茎供试品溶液；精密吸取供试品溶液 Iml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm处测定其吸收度；由标准曲线求得枸骨根茎有效组分样品中总皂苷浓度并计算含量。
2.根据权利要求1所述的枸骨根茎提取物，其特征在于用于冠状动脉性心脏病治疗。
3.根据权利要求1所述的提取物，其制备方法为将枸骨根茎药材，切断或粉碎成粗粉， 用6-12倍量水或乙醇加热回流提取2-3次，每次l_3h，过滤，合并滤液；上述滤液减压浓缩，析胶，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，收集50-80%乙醇洗脱液，脱色，回收溶剂，干燥，即得枸骨根茎提取物，提取物中皂苷类成分含量为70%以上，提取物中皂苷类成分含量的测定方法如下A、乌苏酸对照品溶液的制备精密称取乌苏酸对照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0. lmg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用；B、乌苏酸最大吸收波长的确定精密吸取对照品溶液lml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸， 摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200 700nm波长范围内进行扫描；结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为 3IOnm ；C、标准曲线的绘制精密移取对照品溶液0. 3,0. 6,0. 9，1. 2，1. 5,1.8 mL各2份(一份做空白，一份做显色)，转移至IOmL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇， 显色组加入5ml的高氯酸，摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在 200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度；以吸收度为纵坐标，乌苏酸对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为C=0. 021A+0. 016，R2=0. 999 (n=3)，线性范围为6. 2 31. 0 μ g/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好；D、样品中皂苷类成分含量测定方法取枸骨根茎药材适量，粉碎，称取药材34. 90g，用10倍量70%乙醇(即350ml)，提取2 次，每次1. 5小时，所得溶液用中速滤纸过滤，浓缩至IOOml以下，转移至IOOml的容量瓶， 定容至刻度，即得0. 349g/ml的枸骨根茎提取物；移取枸骨根茎提取液1ml，转移至250ml 的容量瓶中，定容至刻度，即得1. 396mg/ml的枸骨根茎供试品溶液；精密吸取供试品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸， 摇勻，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却 15min,随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm 处测定其吸收度；由标准曲线求得枸骨根茎有效组分样品中总皂苷浓度并计算含量。
4.根据权利要求1或2或3所述的枸骨根茎活性组分的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂可以是D4020型、NKA-9型、AB-8型、HPD-450、ZTC型、DlOl型、DlOlC型及 ADS-F8型吸附树脂中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1或2或3所述的枸骨根茎活性组分的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂可以是优选DlOl型和DlOlC型大孔吸附树脂。
6.权利要求1或2或3或4或5所述枸骨根茎活性组分制成的制剂，其特征在于该枸骨根茎活性组分与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂，枸骨根茎活性组分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。
7.根据权利要求6所述的枸骨根茎冠状动脉性心脏病治疗活性组分制成的制剂，其特征在于该制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种枸骨根茎提取物及其制备方法、其制剂的制备方法与其在制备冠状动脉性心脏病治疗药物中的应用，该提取物中皂苷类活性组分具有显著的冠状动脉性心脏病治疗活性，可以用来制备冠状动脉性心脏病治疗药物。
文档编号G01N21/33GK102188462SQ20111010357
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者冯育林, 刘艳丽, 李笑然, 杨世林, 简晖, 罗颖颖, 许琼明, 陈兰英 申请人:江西本草天工科技有限责任公司