一种从三七茎叶中提取γ-氨基丁酸的方法
【专利摘要】本发明提供一种从三七茎叶中提取γ-氨基丁酸的制备方法。该方法采用三七茎叶为原料，经粉碎、浸提、醇沉、过滤、浓缩、纳滤和732阳离子树脂上柱等过程，获得纯化的γ-氨基丁酸。本项发明的γ-氨基丁酸的提取工艺操作简单，原料来源充足，成本低廉，适合产业化的发展。
【专利说明】—种从三七茎叶中提取Y-氨基丁酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用药用植物提取有效成分的方法，具体涉及一种从三七茎叶中提取Y-氨基丁酸的方法。
【背景技术】
[0002]Y-氨基丁酸(GABA )主要存在于动物脑、脊髓和肝脏中，是中枢神经系中有效的抑制性神经传递物质。Y -氨基丁酸具有降血压、安神、镇痛、调节激素分泌和改善记忆等作用，在医药领域已有广泛的应用。GABA除存在于动物体外，还广泛地存在于高等植物中，目前已经成功地开发了富含GABA的茶叶、桑叶、糙米、马铃薯等食品。
[0003]三七/--?:(Burk.) H.F.Chen是五加科人参属三七的根,具有活血化瘀、消肿止痛等功效，目前多用于防治中枢神经系统、循环系统等疾病。为扩大药材资源，以满足日益增加的需求量，科学工作者成功研究了三七其它部位的药用价值，而三七地上部分即三七茎叶成为三七的主要替代品。产量最高的三七茎叶具有充足的资源，适合产业化的发展，目前三七茎叶中的皂苷成分研究较多，对其它有效成分的研究较少。而Y-氨基丁酸作为三七茎叶中氨基酸的主要成分，未有文献报道。因此，开发一种从三七茎叶中有效提取高含量的Y -氨基丁酸的方法，并将其应用于食品及医药领域具有重要的意义。
[0004]目前，Y-氨基丁酸主要采用化学合成法、微生物发酵法以及植物富集法制备。化学合成法生产的Y-氨基丁酸纯品，由于不属于天然产物，不适合于食品工业的应用。而植物富集法较微生物发酵法，生产的Y -氨基丁酸纯度较高，且对生产环境要求较低，适合于生产富含GABA的功能性食品。现在已有一些植物富集方法申请了专利，例如中国专利200910040513.4 “桑叶Y _氨基丁酸的提取方法及其应用”,该技术采用干燥、粉碎、水浸提、超声-微波协同萃取制得粗提液，粗提液再经三级分离如S-8树脂去色素、G-10、732阳离子交换，纯化制得高纯度Y-氨基丁酸；该技术的三级分离方法成本较高，尤其是采用葡聚糖凝胶G-1O不适合于工业生产；`如何开发一种简单便捷、低成本、高纯度的Y-氨基丁酸的制备方法，对于Y-氨基丁酸的工业化生产具有重要意义。因此，本发明从药用植物三七茎叶中有效提取高纯度的Y -氨基丁酸，工艺操作简单，适合大规模生产。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种从三七茎叶中提取Y-氨基丁酸的方法，该方法操作简便、提取率闻。
[0006]本发明方法通过以下步骤实现:
(1)粉碎和提取
三七茎叶经粉碎后，用5~10倍茎叶质量的去离子水在50~70°C下浸提2~4 h，过滤后滤渣再重复提取2次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.02-1.05，用质量百分比浓度为95%的乙醇溶液进行醇沉，过滤，浓缩除去乙醇后，制得三七茎叶提取液；
(2)膜分离将上述三七茎叶提取液加入纳滤装置中纳滤，收集透过液；
(3)纯化:
将透过液浓缩后过预处理好的732阳离子树脂，采用柠檬酸缓冲液和氨水溶液依次洗脱，得到氨基酸粗样，然后，将含有Y -氨基丁酸的粗样用硅胶柱再次分离，洗脱溶剂系统为氯仿和甲醇混合液，洗脱液浓缩、干燥后得到白色粉末的Y -氨基丁酸。
[0007]本发明提供的Y-氨基丁酸的制备方法中，提取温度优选60°C。
[0008]本发明提供的Y-氨基丁酸的制备方法中，提取时间优选3 h。
[0009]本发明中纳滤膜为聚酰胺类的材质，截留分子量为200~500，操作压力为0.5~1.2 MPa，操作温度为25~40 °C。
[0010]本发明中将透过液上柱，流速为200~300，收集0.45和0.50 mo I/L氨水洗脱的
洗脱液，浓缩后得到氨基酸粗样。
[0011]本发明中将氨基酸粗样上柱，采用200~300目硅胶，收集甲醇:氯仿体积比为40:60和50:50的洗脱液，浓缩、干燥，得到Y-氨基丁酸的白色粉末。
[0012]本发明的优点是:
1、本发明的制备方法操作简便、提取率高、成本低、易于工业化生产；
2、本发明采用纳滤膜截留杂质，可以有效去除蛋白质、多糖以及皂苷类物质等，得到小分子物质氨基酸；
3、本发明采用三七废弃物茎叶为原料，从其中有效地提取高含量的Y-氨基丁酸。证实了三七茎叶含有丰富的Y-氨基丁酸，属于天然产物，可以应用于食品工业及医药领域。
[0013]【专利附图】
【附图说明】
图1 Y -氨基丁酸(GABA)对照品的高效液相色谱图；
图2三七茎叶提取物的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0014]下面通过附图和实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
[0015]实施例1:三七茎叶中Y -氨基丁酸的制备方法如下:
(1)三七茎叶粉碎、提取和醇沉
将三七茎叶500 g粉碎后，用10倍茎叶质量的去离子水在50°C下搅拌浸提4 h，抽滤，滤渣采用相同条件重复浸提2次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.03，然后在浓缩液中缓慢加入2倍浓缩液体积的质量百分比浓度为95%乙醇进行醇沉，静置3 h，过滤，浓缩除去乙醇后，制得三七茎叶提取液；
(2)分离和纯化:
首先取三七茎叶提取液，加入聚酰胺复合纳滤膜中纳滤，截留分子量为200，操作压力为1.2 MPa，操作温度为25 °C，收集透过液；将透过液浓缩后，调节溶液pH为3，过预处理好的732阳离子树脂(预处理是指将732阳离子树脂先用2 mol/L的HCl浸泡4 h后，用蒸馏水洗至中性，接着用2 mol/L的NaOH浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性，然后再用2 mol/L的HCl冲洗树脂并用蒸馏水洗至中性即可，下同)，用pH3、pH6的柠檬酸缓冲液和0.25,0.35、
0.45、0.50 mol/L氨水依次洗脱，流速控制在2 mL.mirf1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脱的洗脱液，浓缩后得到氨基酸粗样；然后，将含有Y-氨基丁酸的氨基酸粗样用硅胶开口柱再次分离(硅胶为200-300目)，溶剂系统氯仿和甲醇混合液，用体积比分别10:90，20:80,30:70, 40:60，50:50，100:0的混合液依次洗脱，收集甲醇:氯仿体积比为40:60和50:50的洗脱液，浓缩、干燥，得到白色粉末的Y-氨基丁酸，总收率为0.42%，Y-氨基丁酸的含量为97%。
[0016]实施例2:三七茎叶中Y -氨基丁酸的制备方法如下:
(1)三七茎叶粉碎、提取和醇沉
将三七茎叶500 g粉碎后，用8倍茎叶质量的去离子水在60°C下搅拌浸提3 h，抽滤，滤渣采用相同条件重复浸提2次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.05，然后在浓缩液中缓慢加入2倍浓缩液体积的质量百分比浓度为95%的乙醇进行醇沉，静置3 h，过滤，浓缩除去乙醇后，制得二七莖叶提取液；
(2)分离和纯化:
首先取三七茎叶提取液，加入聚酰胺复合纳滤膜中纳滤，截留分子量为300，操作压力为1.0 MPa，操作温度为30°C，收集透过液；将透过液浓缩后，调节溶液pH为3，过预处理好的732阳离子树脂，用pH3、pH6的柠檬酸缓冲液和0.25,0.35,0.45,0.50 mol/L氨水依次洗脱，流速控制在2 mL-min^1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脱的溶液，浓缩后得到氨基酸粗样；然后，将含有Y-氨基丁酸的氨基酸粗样用硅胶开口柱再次分离(硅胶为200-300目)，溶剂系统氯仿和甲醇混合液，用体积比分别为10:90，20:80，30:70，40:60，50:50，100:0的混合液依次洗脱，收集甲醇:氯仿体积比为40:60和50:50的洗脱液，浓缩、干燥，得到白色粉末的Y -氨基丁酸，总收率为0.44%，Y -氨基丁酸的含量为98%。
[0017]实施例3:三七茎叶中Y -氨基丁酸的制备方法如下:` (1)三七茎叶粉碎、提取和醇沉
将三七茎叶500 g粉碎后，用5倍茎叶质量的去离子水在70°C下搅拌浸提2 h，抽滤，滤渣采用相同条件重复浸提2次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.04，然后在浓缩液中缓慢加入2倍浓缩液体积的质量百分比浓度为95%乙醇进行醇沉，静置3 h，过滤，浓缩除去乙醇后，制得三七茎叶提取液；
(2)分离和纯化:
首先取三七茎叶提取液，加入聚酰胺复合纳滤膜中纳滤，截留分子量为500，操作压力为0.5 MPa，操作温度为40°C，收集透过液。将透过液浓缩后，调节溶液pH为3，过预处理好的732阳离子树脂，用pH3、pH6的柠檬酸缓冲液和0.25,0.35,0.45,0.50 mol/L氨水依次洗脱，流速控制在2 mL-min^1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脱的溶液，浓缩后得到氨基酸粗样；然后，将含有Y-氨基丁酸的氨基酸粗样用硅胶开口柱再次分离(硅胶为200-300目)，溶剂系统氯仿和甲醇混合液，用体积比分别10:90，20:80，30:70，40:60，50:50，100:0的混合液依次洗脱，收集甲醇:氯仿体积比为40:60和50:50的洗脱液，浓缩、干燥，得到白色粉末的Y-氨基丁酸，总收率为0.37%，Y-氨基丁酸的含量为97%。
[0018]实施例4 Y-氨基丁酸的纯度鉴定
将实施例1制备的三七茎叶中的Y-氨基丁酸采用高效液相色谱法测定其纯度，具体如下:
仪器:岛津高效液相色谱仪(包括在线脱气机D⑶-20A3R(C)、二元泵LC-20AB、自动进样器SIL-20A、柱温箱 CT0-20A、检测器 SPD-20A)，色谱柱:Thermo Scientific Hypersil GOLDC18 色谱柱(5 Mm, 250 mmX4.6 mm)。
[0019]柱前衍生化:
取400.0 μ?样品上清液和对照品溶液，加入200.0 μ? PITC:乙腈(25:1000，V/V)和400.0 PL三乙胺:乙腈(1.4:8.6，V/V)，涡旋振荡，静置2 11，加入2.0 mL正己烷萃取，涡旋振荡，静置待分层后吸取下层溶液，经0.45 Mffl滤膜过滤，取300.0 PL氮气吹干，加300.0μ?甲醇:水(1:1，V/V)复溶，待进液相检测。
[0020]色谱条件:
色谱柱:Thermo Scientific Hypersil GOLD C18 色谱柱。流动相 A 液为 0.05 mol*L_1醋酸钠缓冲盐:乙腈(95:5，V/V);流动相B液为乙腈。流动相均以0.45 Mm滤膜过滤，超声脱气后使用。在O~15 min内，由5%流动相B变化到10%流动相B，在15~20 min内，由10%流动相B变化到100%流动相B，继续用流动相B洗脱5 min。流速为1.0 mL-min^1,柱温为30 °C，紫外检测波长为254 nm，进样量为10.0 μ?。
[0021]线性考察:
精量取配置好的10.0 mmol-L-1 GABA对照品溶液，配制成5.0、1.0,0.8,0.4,0.2,0.1mmol-L-1的系列对照品溶液，按照样品衍生化步骤操作并用HPLC测定，以峰面积以GABA浓度(mmol.!/1)为横坐标，以GABA各浓度的峰面积(mAU*min)为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示，线性回归方程为Y=1.6X106X-1.1X105,r2=0.9996，最小检出限为0.001 mmol.L'
[0022]精密度试验:
取0.5 mmol-L-1 GABA对照品溶液连续5次进样检测，由相应峰面积经标准曲线方程计算其浓度，结果RSD值为0.26%。
[0023]回收率试验:
取已知含量的样品，加入一定质量的GABA对照品，按上述提取步骤及衍生化步骤进行操作，进液相检测，平均回收率为102.44%和98.37%，RSD值为0.21%和0.15% (见图2)。
【权利要求】
1.一种从三七茎叶中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于具体操作如下: (1)粉碎和提取 三七茎叶经粉碎后，用5~10倍茎叶质量的去离子水在50~70°C下浸提2~4 h，过滤后滤渣再重复提取2次，合并滤液，浓缩后，用质量百分比浓度为95%的乙醇溶液进行醇沉，过滤，浓缩除去乙醇后，制得三七茎叶提取液； (2)膜分离 将上述三七茎叶提取液加入纳滤装置中纳滤，收集透过液； (3)纯化 将透过液浓缩后过预处理好的732阳离子树脂，采用柠檬酸缓冲液和氨水溶液依次洗脱，洗脱液为氨基酸粗样，然后，将含有Y -氨基丁酸的氨基酸粗样用硅胶柱再次分离，洗脱溶剂系统为氯仿和甲醇混合液，洗脱液浓缩、干燥后得到白色粉末的Y-氨基丁酸。
2.根据权利要求1所述从三七茎叶中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于:纳滤膜为聚酰胺类的材质，截留分子量为200~500，操作压力为0.5~1.2 MPa，操作温度为25~40。。。
3.根据权利要求1所述从三七茎叶中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于:将透过液上柱，流速为2 mL-min^1,收集0.45和0.50 mol/L氨水洗脱的洗脱液，浓缩后得到氨基酸粗样。
4.根据权利要求1所述从三七茎叶中提取Y-氨基丁酸的方法，其特征在于:将氨基酸粗样上柱，采用200~300目硅胶，收集甲醇:氯仿体积比为40:60和50:50的洗脱液，浓缩、干燥，得到Y-氨基丁酸的白色粉末。
【文档编号】C07C229/08GK103755580SQ201410014639
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】崔秀明, 曲媛, 杨晶晶, 刘 英, 李琳, 李云军 申请人:昆明理工大学