专利名称：一种利用鳞片组培快速繁殖欧洲水仙的方法
技术领域：
本发明涉及一种用鳞片组织培养、快速繁殖欧洲水仙的新方法，属于农业技术领 域。
背景技术：
欧洲水仙(Narcissus pseudonarcissus L.)又叫洋水仙，是从欧洲引入我国的水仙新品种的统称，为石蒜科水仙属多年生草本植物。欧洲水仙与中国水仙相比，具有花大色 艳、应用广泛等特点，其花径是中国水仙的3 5倍，而且花色鲜艳，极受国内市场欢迎。20 世纪80年代后，进行较大规模的引入，主要用于春季花展，少量盆栽作为年宵花使用。欧洲 水仙是优良的园林地被花卉，可以盆栽观赏和切花使用，既可观花也可观叶，应用前景十分 广阔，可作为新兴花卉产业化种类。目前，国内栽培的欧洲水仙种球主要靠国外引进，每球5-10元不等，成本较高。欧 洲水仙一般通过分蘖的子球进行繁殖，每个母鳞茎可分蘖2 4鳞茎。但是，由于病毒感染， 导致水仙分球繁殖率较低，且易产生退化，鳞茎变小，开花能力下降。为此，我们探寻出能够 加速其繁殖的组织培养的方法，为水仙的繁殖生产提供一定的技术参考。目前国内已有利 用欧洲水仙鳞叶间腋芽，做为外植体的组织培养快繁的报道，但用鳞片做外植体的组织培 养及快速繁殖尚未见报道。欧洲水仙鳞茎含有大量的鳞片，利用鳞片做外植体，既可节约成 本，又能大大提高繁殖系数，是一种节本、高效、适宜生产上大规模扩繁的一种快繁技术。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种繁殖速度快，不受季节影响，节本、高效，能实 现种苗工厂化和规模化生产的欧洲水仙组织培养快速繁殖方法。具体内容本发明提供一种欧洲水仙组培快繁的新方法，包括以下步骤。(1)、外植体选择与消毒外植体的选择是决定能否顺利进行愈伤组织诱导分化的 关键。选择无病虫害、生长健壮且生长1 2年的欧洲水仙鳞茎，经5 9°C低温贮藏4 8 周，去除鳞茎最外2层干皱的鳞片和基部残余老根，按常规放入洗衣粉水中浸泡5min，流水 冲洗30min后，置于70 75% (体积百分比)的酒精中浸泡1 2min，用无菌水冲洗3 5次后，去除上部1/3鳞叶，再放入0. 1 0. 2% (质量百分比)HgCl2溶液中浸泡10-15min, 再用无菌水冲洗3 5次，做为诱导培养的备用材料。在超净工作台中，将处理好的鳞茎， 先去掉鳞茎盘，再将鳞叶切割成(5 10)mmX (10 15)mm的块状。(2)、愈伤组织诱导培养在无菌条件下，将切好的块状鳞片接种到下列诱导培养 基中。MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0. 5 2. 5mg · Γ12，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0. 1 1. Omg · Γ1蔗糖25 358·!^
琼脂5_0~6.0g.L-1pH5.6 6.0在温度25士3°C、光照度1000 15001x、光照时间10 12h/d的条件下，培养 20 30d后，鳞片周围开始产生愈伤组织，诱导率达90%以上。(3)、不定芽或小鳞茎分化培养将步骤(2)获得的愈伤组织切成相同大小的块 状，接种到下列分化培养基中。MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1. 0 3. Omg · Γ1萘乙酸(NAA)0. 1 ~ 0. 5mg ‘ L-1蔗糖25 358·!^琼脂5. 0 6. Og · L-1pH5. 6 6.0在温度25士3°C、光照度1500 30001x、光照时间10 12h/d的条件下，培养 25 45d后，在愈伤组织周围分化大量的不定芽或小鳞茎，诱导分化率达90%以上。(4)、继代增殖培养将步骤(3)获得的不定芽或小鳞茎分切成单芽或2 3个一 组，转入下列继代增殖培养基中。MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1. 0 2. Omg · Γ1萘乙酸(NAA)0. 1 0. 5mg · L-1蔗糖20 30g · Γ1琼脂5. 0 6. Og · L-1pH5. 6 6. 0在温度25士3°C、光照度1000 20001x、光照时间10 12h/d的条件下，培养 30 50d后，可使不定芽或小鳞茎增殖3 8倍。将增殖所获得的无叶不定芽或小鳞茎再 进行重复继代，获得大量带叶的繁殖材料。(5)、壮苗培养为进一步提高种苗的质量，提高生根率和炼苗成活率，需增加壮苗 环节步。将步骤(4)获得的带叶片的不定芽分割为1 2芽一组，转入下列壮苗培养基中。MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0. 5 1. 5mg · Γ1萘乙酸(NAA)0. 3 1. Omg · L-1蔗糖20 30g · Γ1琼脂5. 0 6. Og · L-1pH5. 6 6. 0在温度25士3°C、光照度1000 20001x、光照时间10 12h/d的条件下，培养 20 35d后，可使基部小鳞茎快速膨大，长出1 3片叶子，叶色浓绿，生长健壮。(6)、生根培养将步骤(5)获得的带1 2片叶子、株高1. 0 2. Ocm的无根小鳞
茎，转入下列生根培养基中。MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0. 1 0. 5mg · Γ1
萘乙酸(NAA)0· 3 1. Omg · Γ1蔗糖20 30g · Γ1琼脂5. 0 6. Og · L-1pH5. 6 6. 0在温度25士3°C、光照度1000 20001x、光照时间10 12h/d的条件下，培养20 35d后，可使小鳞茎长出2 6条白色根，生根率可达90%以上，生根苗高2. 5 4. Ocm,具2 4片叶子，叶色浓绿，生长健壮。(7)、炼苗移栽将步骤(6)中获得的生根苗，经过室内炼苗3 5d后，置于室内散 射光处，2 3d后打开瓶盖，使小鳞茎上部暴露于空气中。3 4d后将鳞茎从培养瓶中取 出，挑选生根数达3条以上、根长达2. 0cm、直径> 6mm的幼苗，用水冲洗根部残留的培养基， 移栽到蛭石泥炭土 园土= 1 1 2的混合基质(经过高压灭菌)中，浇足水后，保持 温度20 25°C，湿度85 90%，放置于阴凉处，每周浇水1次。35 45d后，小鳞茎炼苗 成活率可达95%以上，生根达5条以上，叶片3 5个，此时即可移栽成活，移栽成活率可达 95%以上。有益效果1、本发明一旦实现规模化生产，则将迅速带动欧洲水仙产业的发展，将打破欧洲 水仙种球完全依赖进口的局面，对降低欧洲水仙种球的价格具有革命性的作用。2、选取欧洲水仙鳞片作为外植体，既节约了成本，又提高了鳞茎的利用率。3、通过外植体选取、诱导、分化、增殖、壮苗、生根、移栽等关键技术的研究，成功地 构建了欧洲水仙的组织培养体系，使诱导增殖倍数最高达10倍，生根率达95%以上，移栽 成活率达95%以上，对提高欧洲水仙种球的繁殖速度、缩短生产周期以及提高种球的品质 有极大的促进作用。4、本发明还能应用于欧洲水仙种质资源的保存，在较小空间下实现大量种质资源 的保存。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但实施例仅是示例性的，对本发明 不构成任何限制。本领域的技术人员应该理解的是在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，而这些修改和替换均落入本发明的 保护范围内。以下实施例所采用的欧洲水仙为园艺栽培品种“Dutch Master”，所用植物组织培 养的培养基的配制方法，均按常规植物组织培养培养基的配制方法配制，无特殊要求。实施例一欧洲水仙组织培养及快繁方法，按以下次序的几个步骤进行1、外植体部位的选择与灭菌2年生的欧洲水仙鳞茎，在5°C下贮藏40d。选用外观 健壮的鳞茎，在常温下剥去最外层干枯鳞片和基部残余老根，按常规放入洗衣粉水中浸泡 5min，流水冲洗30min后置于70% (体积百分比)的酒精中浸泡lmin，用无菌水冲洗4次后 去除上部1/3鳞叶，再放入0. 1% (质量百分比)HgCl2溶液中浸泡lOmin，再用无菌水冲洗4 次做为初代培养的备用材料。将处理好的鳞茎先去掉鳞茎盘，再将鳞片切割成IOmmXlOmm的块状。2、愈伤组织诱导培养将鳞片下部接种到愈伤组织诱导培养基 (MS+6-BA1.5mg'^+2,4-0 0. 5mg 化―1+蔗糖 25g/L+琼脂 5. 6g/L，pH 5.8)中进行培养。培 养温度25士3°C，光照度ΙΟΟΟΙχ，光照时间12h/d。培养30d鳞片周围产生成熟愈伤组织。3、小鳞茎和不定芽分化培养将培养好的愈伤组织切成相同大小的块状，接种到 分化培养基上(MS+6-BA 2. 5mg · I^+NAAO. 3mg · Γ1+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 5. 8)中 进行培养。培养温度25士3°C，光照度20001x，光照时间12h/d。培养30d后，小鳞茎和不定 芽的诱导分化率达95%，增值可达6倍，分化出大量的不定芽。
4、继代增殖培养将诱导分化的小鳞茎或不定芽分切成2 3个一组，转接到继代 增殖培养基(MS+6-BA2. Omg · L^+NAAO. 3mg · Γ1+ 蔗糖 25g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 5. 8)中进 行增殖。培养温度25士3°C，光照度15001x，光照时间12h/d。培养30d后，可使小鳞茎和不 定芽均大量增殖，增殖高达8倍。将增殖所获得的不定芽或小鳞茎分切为单芽或1 2个 一组，接入相同的继代增殖培养基中，在相同的培养环境中进行培养，可获得大量的无根不 定芽，继代产生的小鳞茎通常无叶或有1片叶。5、壮苗培养将步骤4所获得的带叶小鳞茎，分切为1 2个一组，转入壮苗培养 基(MS+6-BA1. 5mg 'L^+NAAO. 5mg 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5. 8g/L，pH 5. 8)中进行培养。培 养温度25士3°C，光照度15001x，光照时间12h/d。培养30d后，可使基部小鳞茎快速膨大， 小鳞茎直径平均为0. 50cm，有1 3个叶片，叶色浓绿，生长健壮。6、生根培养将步骤5所获得的无根小鳞茎，接种到生根培养基(MS+6-BA 0. 2mg · L^+NAAO. 3mg · L-1+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5. 8g/L，pH 5. 8)中诱导生根，30d 后小鳞茎 的生根率达95%以上，生根数2 5条。7、炼苗移栽将步骤6所获得生根苗，经过室内炼苗3d后，置于室内散射光处，3d 后打开瓶盖，使小鳞茎上部暴露于空气中。3 4d后将鳞茎从培养瓶中取出，挑选生根数达 3条以上的鳞茎，用水冲洗根部残留的培养基，移栽到蛭石泥炭土 园土 = 1 1 2的 混合基质(经过高压灭菌)中，移栽时应避免将小鳞茎完全埋入基质中，只需将根茎盘以下 埋入基质即可。浇足水后，保持温度25°C，湿度85%，放置于阴凉处，每周浇水1次，35d后 小鳞茎炼苗成活率可达95%以上，生根4条以上，叶片3 5个，此时即可移栽成活，移栽成 活率可达98%。实施例二此欧洲水仙组织培养及快繁方法，除以下区别特征外，其余步骤和方法均与实施 例一相同。第1步骤所用的外植体为2年生的欧洲水仙鳞茎，经过9°C低温处理45d，选用鳞 茎的内层下部鳞片。第2步骤的愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2. Omg · 1^+2，4-D 0. 3mg · Γ1+蔗糖 30g/L+琼脂5. 6g/L，pH5. 8，培养温度25°C，光照时间12h/d，光照强度ΙΟΟΟΙχ，培养30d，愈 伤组织诱导率为98%。第3步骤的不定芽或小鳞茎分化培养基为MS+6-BA 2. Omg · L^+NAAO. 2mg · L—1+蔗 糖30g/L+琼脂5. 6g/L，pH 5. 8，培养温度25°C，光照度20001x，光照时间12h/d，培养35d， 诱导分化率为96%。
第4步骤的继代增殖培养基为MS+6-BA 1. 5mg · L^+NAAO. 3mg · L—1+蔗糖25g/L+ 琼脂5. 6g/L，pH 5. 8，光照度15001x，培养温度25°C，光照度15001x，光照时间12h/d，培养 30d，增殖倍数为10倍。第5步骤的壮苗培养基为MS+6-BA 1. Omg · L^+NAAO. 5mg · L—1+蔗糖20g/L+琼脂 5. 8g/L, pH 5.8，培养温度251，光照度15001x，光照时间12h/d，培养25d，成苗率达90 % 以上。
第6步骤的生根培养基为MS+6-BA 0. 3mg · L^+NAAO. 5mg · L—1+蔗糖20g/L+琼脂 5. 8g/L，pH 5. 8，培养温度25°C，光照度15001x,光照时间12h/d，培养30d,生根率达100%。
权利要求
一种高效、节本的欧洲水仙组织培养快速繁殖方法，该方法包括以下7个步骤①外植体选择和处理鳞茎低温处理后清洗干净，酒精和HgCl2消毒，剥开鳞片，切成小块。②愈伤组织诱导将步骤①中经处理的无菌鳞片接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养。③不定芽或小鳞茎分化将步骤②中培养得到的愈伤组织切成适当大小的块状，接种到分化培养基中进行培养。④继代增殖培养将步骤③中诱导分化的小鳞茎或不定芽分切成2～3个一组，转接到继代增殖培养基中进行增殖培养。⑤壮苗培养将步骤④中获得的带叶小鳞茎分切为1～2个一组，转入壮苗培养基中进行培养。⑥生根培养将步骤⑤中获得的无根小鳞茎接种到生根培养基中进行生根诱导。⑦炼苗移栽将步骤⑥中获得的生根苗经过室内炼苗后，从培养瓶中取出，移栽入适宜的基质中，一定时间后将移栽成活的幼苗移植于大田。
2.根据权利1所述，欧洲水仙通过组织培养进行快速繁殖的方法，其特征在于，选用 1 2年生鳞茎作为繁殖材料，且需在5 9°C的条件下处理30-60d。
3.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养的外植体选取方法，其特征在于，选用鳞片组织 作为愈伤组织诱导的外植体。
4.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养的外植体消毒方法，其特征在于，种球用70 75% (体积百分比)的酒精中浸泡1 2min，用无菌水冲洗3 5次后去除上部约1/3鳞 叶，再放入0. 1 0.2% (质量百分比)HgCl2溶液中浸泡10 15min，再用无菌水冲洗3 5次。
5.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养的外植体切割方法，其特征在于，将鳞片切割为 (5 10)mmX (10 15)mm 的块状。
6.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养中愈伤组织诱导的方法，其特征在于，培养基为 MS+6-BA0. 5 2. 5mg · L-1+2，4-D 0· 1 1. Omg · L-1+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 5. 0 6. Og/ L，pH 5. 6 6.0，培养温度25士3°C，光照度1000 15001x，光照时间10 12h/d，培养 20 30d。
7.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养中诱导不定芽或小鳞茎分化的方法，其特征在 于，培养基为 MS+6-BA1. 0 3. Omg 'L^+NAAO. 1 0. 5mg Γ1+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 5. 0 6. Og/L，pH 5. 6 6. 0，培养温度25士3°C，光照度1500 30001x，光照时间10 12h/d， 培养25 45d。
8.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养中继代增殖的方法，其特征在于，培养基为 MS+6-BA 1. 0 2. Omg · L_1+NAA 0. 1 0. 5mg · L-1+ 蔗糖 20 30g/L+ 琼脂 5. 0 6. Og/L, pH 5. 6 6. 0，培养温度25士 3°C，光照度1000 20001x，光照时间10 12h/d，培养30 50d。
9.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养中壮苗的方法，其特征在于，培养基为MS+6-BA 0. 5 1. 5mg · L_1+NAA0. 3 1. Omg · L-1+ 蔗糖 20 30g/L+ 琼脂 5. 0 6. Og/L, pH 5. 6 6.0，培养温度25士3°C，光照度1000 20001x，光照时间10 12h/d，培养20 35d。
10.根据权利1所述，欧洲水仙组织培养中生根的方法，其特征在于，培养基为 MS+6-BA0. 1 0. 5mg · I^+NAAO. 3 1. Omg · L-1+ 蔗糖 20 30g/L+ 琼脂 5. 0 6. Og/L, pH 5. 6 6. 0，培养温度25士3°C，光照度1000 20001x，光照时间10 12h/d，培养20 35d 后。
11.根据权利1所述，欧洲水仙组培苗炼苗移栽的方法，其特征在于，组培瓶不开盖室 内放置3 5d后，置于室内散射光处，2 3d后打开瓶盖，使生根苗上部暴露于空气中，3 4d后将小苗从培养瓶中取出，用水冲洗根部残留的培养基后移栽至基质中。基质配方为蛭 石泥炭土 园土 = 1:1:2。基质需经过高压灭菌。移栽时应避免将小鳞茎完全埋入 基质中，只需将根茎盘以下埋入基质即可。浇足水后，保持温度20 25 °C，湿度85 90 %， 放置于阴凉处，每周浇水1次。35 45d后将移栽成活的幼苗移植于大田。
全文摘要
本发明涉及一种欧洲水仙鳞片组培快繁方法以1～2年生的欧洲水仙的鳞片为外植体，经过诱导、分化、继代增殖、壮苗、生根和移栽等步骤，最终形成商品化的欧洲水仙种苗。本发明的方法针对性强，适用性好，操作简单易行，可使诱导增殖倍数高达10倍，生根率达95％以上，移栽成活率达95％以上，适宜在工厂化生产中应用。
文档编号A01H4/00GK101816286SQ20091026441
公开日2010年9月1日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者吴文龙, 李海燕, 李维林, 王小敏, 闾连飞 申请人:江苏省中国科学院植物研究所