专利名称：：一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法
技术领域：
：本发明涉及一种作物育种技术，特别是一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法。技术背景作物杂种优势是存在于自然界的一种普遍现象，它主要表现在杂种一代，与其双亲相比具有明显的优势。在过去数十年中，利用作物杂种优势显著地提高了农作物的产量和适应性；尤其是我国水稻杂种优势的成功利用，举世瞩目，成为上世纪农业研究领域最伟大的成就之一。长期以来，国内外育种家对水稻杂种优势的发掘和利用一直保持着极大兴趣。然而，由于水稻杂种优势性状表现出的特殊性和复杂性，使得杂种优势育种比常规育种存在着更加烦琐、复杂、耗时、费力、以及育种盲目性大、亲本改良效率很低等缺陷。于是，人们渴望找到一种高效率的水稻超强杂种优势亲本改良途径。显然，亲本和杂种产量预测是最关键的、最有效的技术手段。近年来，为了实现杂交稻亲本和杂种产量的有效预测，人们利用DNA分子标记技术，对杂种优势性状分子标记定位开展了大量的探索；结果显示获得的分子标记，对不同的亲本、不同的杂种相差甚远，难于在水稻杂种优势育种中得到应用。杂交稻育种实践经验显示亲本的单株产量对杂种一代优势有着重要影响，但在对亲本实施改良时，却很难对亲本的产量潜力进行评估，只能依赖于育种经验的积累和一些受时空、环境变化影响的表观性状进行判断，盲目性显而易见。时至今日还没有一种技术方法能有效、快速对亲本及杂种产量进行
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种能有效、快速对杂交稻亲本和杂种产量进行预测的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，包括以下步骤1)、合成寡核苷酸序列；2)、制备水稻的亲本和杂种的幼穗提取液；3)、提取液处理采用含有步骤l)所得寡核苷酸的处理液对上述每种提取液分别进行处理，得处理后的提取液；4)、样品PC財广增反应在上述每种处理后的提取液中分别加入步骤l)所得的寡核苷酸和TaqDNA聚合酶，进行PCR扩增两步反应；5)、PCR产物定量分析获得PCR产物的DNA含量；6)、亲本和杂种产量预测根据亲本和杂种的PCR产物的DNA含量进行预测，DNA含量越高其单株产量越低。作为本发明的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法的改进步骤l)中的寡核苷酸序列为5，GTTCTAACCTCTAACTGAACGT3，(TLS)或5，CCTATACCCTATACCCTATACCCTAA3，(TCX)。作为本发明的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法的进一步改进TCX链以及TLS链除3'端第13个碱基不可改变外，其余碱基容许有一定变化。作为本发明的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法的进一步改进步骤2)中的幼穗指的是长度小于l厘米的新鲜幼穗。作为本发明的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法的进一步改进步骤3)的处理过程为先置于19"C下保温13分钟，再加热至65'C保温3分钟；最后转入冰浴中，即得处理后的提取液。本发明的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，步骤2)所得的提取液如果存放-8(TC中可保存一年，但是一旦溶解后，不能再次冰冻；在步骤3)中要严格控制处理温度和处理时间，以获得最佳效果；在步骤4)中采用两种不同的退火温度，分两步进行PCR循环；在步骤5)中，为减少PCR反应液以及未反应引物对产物定量测定的干扰，能准确测定PCR反应产物的DNA含量，将PCR产物和DNA标样一道进行琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色，并紫外光下进行高清晰的数码照相，再根据图片定量分析；在步骤6)中，PCR产物的DNA含量与实际单株产量成反比例关系。本发明的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，具有如下优点1)本发明技术最重要的优点在于，它能对杂交稻亲本及杂种的单株产量作出相对预测，准确率可高达83%，大大提高育种效率。本发明预测的是相对产量，也就是说将一系列亲本和杂种一代进行预测，能将它们的产量潜力进行排序，从而得知哪一些产量潜力相对高。2)能大大减少亲本改良过程中群体庞大所带来的费力、费时。3)不受环境变化的影响，能有效减少环境导致的误差。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是PCR产物的DNA含量与实际单株产量的关系示意图。具体实施方式实施例l、一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，依次进行以下步骤1)、合成寡核苷酸序列通过上海生物工程技术服务有限公司(Sangon)合成2个寡核苷酸序列5，GTTCTMCCTCTAACTGAACGT3'(TLS)和5'TATACCCTATACCCTATACCCTAA3'(TCX)，并分别用去离子灭菌水溶解为20uM浓度。2)、制备水稻的幼穗提取液采用杂交稻亲本"协青早A"、"中9A"、"J413"、"明恢63"和"9308"，以及它们的六个杂种一代"协青早A/J413"、"协青早A/明恢63"、"协青早A/9308"、"中9A/J413"、"中9A/明恢63"和"中9A/9308"为材料。分别选取上述每种材料的23个小幼穗(小幼穗要求小于l厘米长)作为1种样品。对所得的11种样品分别作以下处理在0.3ml新配制的4。C预冷缓冲液中放入样品0.2克(需准确称取)，在4"C下研磨成匀浆。该预冷缓冲液是由30mMTris-HC1pH7.5，1.OmMMgCl2，1.OmMEGTA，1.OmMPMSF，1.0%》-Mercaptalethanol(v/v)，0.5。/。Tween-20(v/v)，10%甘油(v/v)的水溶液组成。接着对所得的匀浆进行16000转/分低温离心20分钟后；取出上清液置于冰浴中待用；得提取液。上述提取液如果存放-8(TC中可保存一年。但是一旦溶解后，就不能再次冰冻。3)、提取液处理对所得的ll份提取液分别作以下处理将2ul提取液放入18ul的处理液(该处理液由20mMTris-HClpH8.3，63mMKC1，0.005%Tween-20,1.OmMEGTA，50uMdNTP，0.4uMTLS寡核苷酸，0.lmg/ml牛血清蛋白的水溶液组成)中，置于19。C下，保温13分钟；再加热至65。C，保温3分钟；最后转入冰浴中成为处理后的提取液。4)、样品PCR扩增反应对所得的ll份处理后的提取液分别作以下处理选用步骤l)所得的20uM的TCX寡核苷酸lul，将其和lul5Uu厂1TaqDNA聚合酶直接加入到20ul处理后的提取液中，进行PCR扩增两步反应1)94°C/45秒，56。C/60秒，72。C/70秒循环5次，2)94。C/45秒，60。C/60秒，72°C/70秒循环25次，72'C延伸10分钟。再4'C保存待用。5)、PCR产物定量分析将亲本及对应杂种一代的PCR产物和O.5ug(6ul)DNA标样(SM0311，MBIFermentas)，在同一片1%琼脂糖凝胶上分离，用O.1%溴化乙锭染色，并用GeneGeniusBio-imagingSystem(SYNGENE，SynopticsLtd,Cambridge,UK)观察、拍照。再利用GeneGeniustool(SYNGENE，Syn叩ticsLtd,Cambridge,UK)图像定量分析工具，根据DNA标样(SM0311，MBIFermentas)说明书，以750bp条带含有21.5ngdsDNA为标准，测定PCR产物的DNA含量，并记录结果，具体如表l所示。表l、PCR产物DNA含量记录<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6)、亲本和杂种产量预测根据上述表1中的PCR产物DNA含量，可以得知1)亲本中，母本产量比父本高。2)杂种产量比亲本高。为了证明上述实施例1所述方法的正确性，发明人作了如下的对照试验对上述亲本"协青早A"、"中9A"、"J413"、"明恢63"和"9308"，以及它们的六个杂种一代"协青早A/J413"、"协青早A/明恢63"、"协青早A/9308"、"中9A/J413"、"中9A/明恢63"和"中9A/9308"实施两次重复，随机区组设计对单株粒重进行了评价，最终所得的结果如表2所示。表2、亲本及杂种一代单株产量评价结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表1和表2可得知采用本发明的方法预测杂交稻亲本及杂种产量，准确性高，相关系数达到-0.832，/M).00149，如图1所示。以上实验证明使用本发明的方法能对亲本和杂种一代的单株粒重产量进行预测，且预测结果基本吻合实际情况。而现有方法则不行。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQIDNO:15'GTTCTAACCTCTAACTGAACGT3'SEQIDNO:25，CCTATACCCTATACCCTATACCCTAA3，权利要求1、一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，其特征是包括以下步骤1)、合成寡核苷酸序列；2)、制备水稻的亲本和杂种的幼穗提取液；3)、提取液处理采用含有步骤1)所得寡核苷酸的处理液对上述每种提取液分别进行处理，得处理后的提取液；4)、样品PCR扩增反应在上述每种处理后的提取液中分别加入步骤1)所得的寡核苷酸和TaqDNA聚合酶，进行PCR扩增两步反应；5)、PCR产物定量分析获得PCR产物的DNA含量；6)、亲本和杂种产量预测根据亲本和杂种的PCR产物的DNA含量进行预测，DNA含量越高其单株产量越低。2、根据权利要求l所述的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，其特征是所述步骤l)中的寡核苷酸序列为TLS:5，GTTCTAACCTCTAACTGAACGT3，和TCX:5，CCTATACCCTATACCCTATACCCTAA3，。3、根据权利要求2所述的杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，其特征是所述TCX链以及TLS链除3'端第13个碱基不可改变外，其余碱基容许有一定变化。4、根据权利要求l、2或3所述的一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，其特征是所述步骤2)中的幼穗为长度小于l厘米的新鲜幼穗。5、根据权利要求4所述的一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，其特征是，所述步骤3)的处理过程为先置于19。C下保温13分钟，再加热至65'C保温3分钟;最后转入冰浴中，即得处理后的提取液。全文摘要本发明公开了一种杂交稻亲本和杂种产量的预测方法，包括以下步骤1)合成寡核苷酸序列；2)制备水稻的亲本和杂种的幼穗提取液；3)提取液处理；4)样品PCR扩增反应；5)PCR产物定量分析；6)亲本和杂种产量预测根据亲本和杂种的PCR产物的DNA含量进行预测，DNA含量越高其单株产量越低。采用本发明的方法能有效、快速对杂交稻亲本和杂种的产量进行预测。文档编号C12Q1/68GK101230402SQ20081005973公开日2008年7月30日申请日期2008年2月21日优先权日2008年2月21日发明者刘小川申请人:浙江理工大学