红景天及红景天苷在干细胞定向分化为肝系细胞中的应用的制作方法

专利名称：红景天及红景天苷在干细胞定向分化为肝系细胞中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及红景天尤其是红景天苷在诱导干细胞定向分化为肝系细 胞中的应用。(二) 背景技术红景天系景天(CrowM/ace"e)科红景天属(i^oJ/o/fl丄.)才直物，为多 年生草本或亚灌木植物，主要分布在北半球的喜马拉雅山区、亚洲西北部 和北美洲海拔在1,600 4，000米的地区。红景天药用历史悠久，素有"黄 金人参""神仙草，，之称。药典记载红景天为景天科植物大花红景天的干燥 根及根茎，其性甘、苦、平，益气活血、通脉平喘，可用于气虚血瘀、胸 痹心痛、中风偏瘫和倦怠气喘。现代药理研究表明，红景天的生物活性与 其所含的多种化学成分密不可分。红景天苷(sa/^Y^Vfe)是从红景天中分离提纯的天然产物，为一种 单体化合物，是红景天的有效成分之一，部分相关科属中药也含红景天苷， 其化学结构式为oh ( I )红景天苷单体的分离纯化方法红景天粉为原料，以水为溶剂用微波 法提取红景天苷。最佳工艺参数为液固比20: 1,浸泡时间1.5h,低功率农吏波处理60s，磁力搅拌15min,提取2次，提取率可达90%(参见 微波辅助提取红景天苷，赵武奇殷涌光梁歧等，食品与发酵工业，2004， 30 (2), 19 22)。 药理作用提高和改善抗各种高原反应能力。抗缺氧、抗疲劳作用。研究表明它通过维持5-HT含量正常化起到了 抗中枢疲劳的作用。抗衰老。具有抗氧化作用及体外清除羟自由基和超氧阴离子自由基的 能力。抑制大鼠肾小管上皮细胞及间质细胞向肌成纤维细胞转化，有效緩解 肾间质损伤，防治肾间质纤维化。抗肝纤维化作用。红景天苷可明显抑制乙醛刺激的HSC增殖及胶原 基因的表达，在体外有显著的抗肝纤维化作用。对心脑血管的保护作用。红景天苷可抑制大鼠缺血再灌注引起的白细 胞介素1(3表达的增加，减少脑缺血再灌注后脑组织中TNF-a的表达起到保 护脑血管的作用；通过抑制血管ACE的表达，在一定程度上可抗心肌缺血。提高机体免疫能力、抗肿瘤、抗病毒。抗辐射。红景天苷有防护X射线辐射损伤机体组织和细胞膜的作用。 提高记忆力和防治老年痴呆，保护神经细胞。红景天苷可抑制缺氧缺 糖损伤所致的线粒体膜电位和活性的降低，从而具有稳定线粒体膜电位的 作用，抑制神经细胞凋亡的发生；体外促进神经千细胞向神经元方向分化 为红景天药物用于相关神经系统疾病的临床治疗提供了实验依据。 降血糖和改善蛋白质、脂肪代谢。目前还未有红景天及红景天苷具有诱导成体干细胞定向分化为肝系细胞的作用纟艮道。
发明内容本发明目的是提供红景天及红景天苷的新用途，即红景天及红景天苷 诱导干细胞定向分化为肝系细胞的应用。本发明的技术方案是红景天在制备诱导干细胞定向分化为肝系细胞诱导剂中的应用，如利 用红景天诱导干细胞定向分化为肝系细胞(如肝细胞，胆管细胞等)。本发明推荐以红景天中的有效成份红景天苷作为诱导成体干细胞定 向分化为肝系细胞的诱导剂。红景天苷具有拟肝细胞生长因子 (Hepatocyte grow factor, HGF )样作用。通常的，本发明所述的干细胞为成体干细胞，所述的成体干细胞包括 除造血干细胞外的骨髓间充质干细胞以及多种祖细胞，优选为骨髓间充质 干细月包。本发明所述应用为将红景天苷与细胞生长因子FGF-4组合作为诱 导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝系细胞。具体的，所述应用为取大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养，取稳 定传代的骨髓间充质干细胞于诱导培养基中，进行诱导培养，获得成熟肝 细胞样细胞；所述诱导培养基为添加有红景天苷与细胞生长因子FGF-4 的基础培养基，所述基础培养基中红景天苷与细胞生长因子FGF-4添加 量为红景天苷终浓度为1 5^M(优选为2pM),细胞生长因子FGF-4 终浓度为5 20ng/mL (优选为10ng/mL)。优选的，所述的应用为取大鼠骨髓间充质干细胞，进行传代培养，取第3代的骨髓间充质干细胞，接种于MSC培养基，37°C、 5%(302条件 下培养至细胞汇合率大于90%,将细胞培养基更换为添加有2(iM红景天 苦与10 ng/mL细胞生长因子FGF-4的基础培养基，诱导培养14天，得 到成熟肝细胞样细胞。所述MSC培养基本领域常见适用于骨髓间充质干细胞培养的培养 基，本发明中选用含10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、 100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的低糖DMEM培养基。所述基础培养基为本领域常见适用于骨髓间充质干细胞诱导培养的 基础培养基，本发明中釆用含2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM 2_[4_(2_轻乙基)-l-哌。秦]乙磺酸(Hepes )、 1 x胰岛素—转铁蛋白-硒、200昭/L 地塞米松、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的高糖DMEM培养基。一种诱导干细胞定向分化为肝系细胞的诱导剂，所述的诱导剂含有红 景天，本发明所述的诱导剂特别是指诱导剂中含红景天苷，或者含有红景 天苷的同分异构体，或基团被修饰的单体化合物；另外，经实验验证，红 景天苷元(即红景天香去掉糖基，结构式如式(II )所示)，也具有类似 的作用，也可以作为诱导剂用于诱导干细胞定向分化为肝系细胞。进一步 本发明所述的诱导剂为红景天苷或红景天苷元与细胞生长因子FGF-4的 组合物，具体应用时在基础培养基中添加量为红景天苦终浓度2yM, 细胞生长因子FGF-4终浓度10 ng/mL,或者在基础培养基中添加量为 红景天香元终浓度2 ju M，细胞生长因子FGF-4终浓度10 ng/mL。1% 2%;步骤为(1) 、将硫酸先溶解到甲醇中，然后将油脂或脂肪酸和硫酸甲醇一起加入到低压反应釜中，反应压力0.2 0.3MPa，反应温度为80~95°C，催化剂硫酸占油 脂或脂肪酸重量的1% 2%，醇油重量比为0.8:1 1.2:1，反应时间为16~20h;(2) 、将步骤(l)所得反应混合物回收甲醇，然后将剩余物静置分层，上层主 要为生物柴油，下层主要为甘油和硫酸；(3) 、将步骤(2)中的上层液体用60 7(TC温水洗涤，洗至分层后下层水相呈中性，取上层油相经真空干燥脱水得到粗生物柴油；(4) 、将步骤(3)中的粗生物柴油经减压蒸馏，在高于-0.1MPa真空条件下收 集17(TC 19(TC馏分，即为生物柴油制品。本发明的有益效果本发明提供了低酸催化制备生物柴油的新工艺，该工 艺具有原料适应范围广，酸添加量低，是带压反应，可以縮短反应时间，降低 能耗，产物转化率高，工艺简单，同时减少了三废污染的产生，降低了生物柴 油的生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。 实施例l:向低压反应釜中加入100g麻疯果油(酸价3.8) ， 2g浓硫酸， 100 g甲醇，硫酸先溶解在甲醇中再加入到反应釜中，反应压力0.2 0.3MPa， 反应温度85。C，反应时间18h。反应结束后通过甲醇蒸馏塔真空回收甲醇，然 后将产物静置分层2小时，上层主要为脂肪酸甲酯，下层主要为甘油和硫酸。 将上层产物用约30 mL 60 7(TC热水洗涤，静置分层，重复2次后下层水相呈 中性，取上层油相经真空干燥脱除水分得到粗生物柴油产品95 g，通过生成的 甘油测得甲酯的转化率为94.4%。得到的粗甲酯经减压蒸馏塔减压蒸熘，真空 度高于-0.1MPa，取17(TC 19(TC之间的馏分，为生物柴油最终产品。实施例2:向低压反应釜中加入100g麻疯果油(酸价3.8) ， 1.5g浓硫 酸，80g甲醇，硫酸先缓慢滴加到甲醇中再加入到反应釜中，反应压力 0.2 0.3MPa，反应温度95。C，反应时间19 h。反应结束后通过甲醇蒸馏塔真空 回收甲醇，然后将反应产物静置分层2小时，上层主要为脂肪酸甲酯，下层主 要为甘油和硫酸。将上层产物用约30mL60 7(TC热水洗涤，静置分层，重复 2次后下层水相呈中性，取上层油相经真空干燥脱除水分得到粗生物柴油产品 96 g，通过生成的甘油测得甲酯的转化率为95.3%。得到的粗甲酯经减压蒸馏 塔减压蒸馏，在真空度高于-0.1MPa条件下取170。C 19(TC之间的馏分，为最 终生物柴油产品。实施例3:向低压反应釜中加入100g麻疯果油(酸价3.8) ， 1 g浓硫酸， 100g甲醇，硫酸先溶解在甲醇中，再将硫酸甲醇溶液加入到反应釜中，反应肝损伤及中晚期肝脏疾病领域的深入研究，为新药开发提供了基础。(四)


图1为呈梭形的骨髓间充质干细胞；图2为呈漩涡状生长的骨髓间充质干细胞；图3为不同诱导条件下甲胎蛋白(AFP)的表达；A:红景天苷+FGF-4 联合诱导组；B: FGF-4单独诱导组；C: HGF+FGF-4联合诱导组；D: HepG2阳性对照；图4为不同诱导条件下CK18的表达；A:红景天苷+FGF-4联合诱导组； B: FGF-4单独诱导组；C: HGF+FGF-4联合诱导组；D: Hela细胞阳性 对照组；图5为不同诱导条件下糖原合成情况；A: FGF-4单独诱导组；B: HGF+FGF-4联合诱导组；C:红景天苷+FGF-4联合诱导组； 图6为不同诱导条件下谷丙转氨酶(ALT)分泌情况； 图7为不同诱导条件下谷草转氨酶(AST)分泌情况； 图8为不同诱导条件下尿素氮分泌情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一 步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此实施例1: 试剂及材料4周龄SD大鼠浙江省医学科学院实验动物中心；红景天苷及红景天苷元中国药品生物制品检定所；Percoll: Pharmacia公司；低糖DMEM培养基GIBCO公司；高糖DMEM培养基GIBCCV〉司；胎牛血清GIBCO公司；Hepes (2-[4-(2-羟乙基)-l-哌嗪]乙磺酸)Amresco公司；胰岛素/转铁蛋白/竭Sigma公司；地塞米+>: Sigma ^>司；HGF: Pepro Tech公司；FGF-4: Pepro Tech公司。实验步骤(1 )骨髓干细胞的获取及其支持培养乙醚麻醉后颈推脱臼法处死SD大鼠(4周龄)，无菌取胫骨和股骨， 剪开两端骨骺，不含血清的MSC培养液(即低糖DMEM培养基添力。2mM 谷氨酰胺、10mM Hepes和各100U/ml的青、链霉素)反复冲洗骨髓腔，400m 筛网过滤，收集骨髓细胞。配制密度为1.073 kg/L的Percoll溶液(先用9份 密度为1.077kg/L的Percoll原液与1份8.5。/oNaCl或1.5M PBS混合达到生理 性渗透压，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS )稀释至Percoll浓 度为60%,即可得密度为1.073 kg/L的Percoll溶液)，密度梯度离心，收 集中间的白膜层细胞即大鼠骨髓单个核细胞，以3xl0Vcm2密度接种于培 养瓶中，MSC培养液(为低糖DMEM培养基添加10。/。胎牛血清、2mM谷 氨酰胺、10mMHepes、各100U/ml青、链霉素)，37。C饱和湿度、5%C02 孵箱培养24h后换液，去除悬浮细胞。以后每3天换液1次，此时可见细胞 呈梭型且呈旋涡状生长(图l、图2)。当细胞达60%~70%融合后采用不同的接种密度进行常规传代培养。(2)红景天苦诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞取培养第3代的MSCs,以5xl0Vcm2密度接种于细胞培养亚(低糖 DMEM培养基添加10。/。胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、各 100U/ml的青、链霉素)，37。C饱和湿度、5%(302孵箱培养；细胞汇合率 大90%时，换成基础培养基(为高糖DMEM培养基添加2。/。胎牛血清、2mM 谷氨酰胺、10mM 2-[4-(2-羟乙基)-l-哌溱]乙磺酸(Hepes )、 1 x胰岛素-转 铁蛋白-竭、200(ig/L地塞米松、100U/ml青链霉素和100U/ml链霉素)；分 为3个诱导组，在基础培养基中分别添加FGF-4单独诱导组生长因子FGF-4 10ng/ml;HGF+FGF-4联合诱导组生长因子FGF-4 10ng/ml， HGF 20ng/ml; 红景天香+FGF-4联合诱导组生长因子FGF-4 10ng/ml,单体化合物 红景天苷2jiM;每3天换液1次，并观察细胞形态的变化。于第7、 14、 21天分别收获 细胞，提取蛋白检测甲胎蛋白(AFP)和CK18的表达情况(图3、图4); 于第14天后Periodicacid-Schiff法检测细胞内糖原合成(图5 )。 实验结果及结论从红景天苦诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞的特异性蛋白(AFP, CK18)表达情况来看，诱导时间和物质表达情况之间具有明显的时效关 系。在诱导的第4天，AFP开始表达，在诱导的第7天达到高峰，接近阳性 对照，在14天白蛋白表达，AFP已成阴性；CK18在第10天开始表达，第 14天达到高峰，红景天香+ FGF-4组已经接近阳性对照组；糖原染色显示， 红景天芬+ FGF-4组糖原阳性率明显已经超过FGF-4单独诱导组及HGF+FGF-4联合诱导组。(3)红景天芬衍生物(以红景天苷元为代表)诱导骨髓干细胞定向 分化为肝细胞取培养第3代的MSCs,以5xl0Vcm2密度接种于细胞培养皿，培养条 件同上实施例2;分为3个诱导组，在基础培养基中分别添加FGF-4单独诱导组生长因子FGF-4 10ng/ml;HGF+FGF-4联合诱导组生长因子FGF-4 1 Ong/ml, HGF 20ng/ml;红景天苷元+FGF-4联合诱导组生长因子FGF-4 10ng/ml，单体化合 物红景天苷元2pM;每3天换液1次，并观察细胞形态的变化。于第14、 21及28天分别收获 细胞，取上清检测肝细胞特异性生化指标一 —谷丙转氨酶(ALT)(图6 ) 及谷草转氨酶(AST)(图7 )及尿素氮(图8 )的分泌情况。 实验结果及结论从红景天香元诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞的生化指标(ALT、 AST和BUN)情况来看，诱导时间和物质表达情况之间具有明显的时效关 系。ALT、 AST和BUN随着诱导时间的延长，在诱导的第3、 4周达到正常 肝细胞的分泌水平。由此推测红景天苷及其衍生物均具有诱导骨髓干细胞 定向分化为肝细胞的作用。利用红景天苷及其衍生物红景天苷元(或者其它同分异构体及其基团 被修饰的红景天苷)可以诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞，如果将其成 功引入急慢性肝损伤以及晚期肝脏疾病(如肝衰竭)，通过大量增殖逐步恢 复肝脏的正常功能，这将为治疗难治性肝脏疾病提供组织细胞来源；同时 通过此法大量扩增肝细胞，可以进一步进行组织工程学等方面的研究。本发明所公开的内容，可以满足本研究领域技术人员的应用，同时， 在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作出各种 改动或者修改，这些基于本发明的操作同样落于本发明所限定的范围。
权利要求
1.红景天在制备诱导干细胞定向分化为肝系细胞诱导剂中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于红景天中提取的红景天苷在制备诱导干细胞定向分化为肝系细胞诱导剂中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的干细胞为成体干细胞。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述成体干细胞为骨髓间充质 干细胞。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为红景天苷与细胞 生长因子FGF-4组合作为诱导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化 为肝系细胞。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为if又大鼠骨髓间充 质干细胞进行传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞于诱导培养 基中，进行诱导培养，获得成熟肝细胞样细胞；所述诱导培养基为添 加有红景天苷与细胞生长因子FGF-4的基础培养基，所述基础培养基 中红景天苷与细胞生长因子FGF-4添加量为红景天苷终浓度为1 5 U M,细胞生长因子FGF-4终浓度为5 20 ng/mL。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为取大鼠骨髓间 充质干细胞，进行传代培养，取第3代的骨髓间充质干细胞，接种于 MSC培养基，37°C、 5。/。C02条件下培养至细胞汇合率大于90%,将细 胞培养基更换为添加有2jaM红景天苷与10 ng/mL细胞生长因子 FGF-4的基础培养基，诱导培养14天，得到成熟肝细胞样细胞。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述MSC培养基为含10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、 100U/ml青霉素、100U/ml链 霉素的低糖DMEM培养基；所述基础培养基为含2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mMHepes、 1 x胰岛素-转铁蛋白-硒、200 ia g/L地塞米松、100U/ml青霉素、100U/ml 链霉素的高糖DMEM培养基。
9. 一种诱导干细胞定向分化为肝系细胞的诱导剂，其特征在于所述的诱 导剂含有红景天。
10. 如权利要求10所述的诱导剂，其特征在于所述的诱导剂含红景天苷元 或红景天苷。
全文摘要
本发明提供了红景天及红景天苷在诱导干细胞定向分化为肝系细胞中的应用，尤其是红景天苷与细胞生长因子FGF-4组合作为诱导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝系细胞。本发明开拓了红景天苷的新用途，即体外诱导骨髓干细胞等干细胞定向分化为肝系细胞；提供了红景天及红景天苷在诱导成体干细胞定向分化为肝系细胞中的作用，有利于体内干细胞移植治疗急慢性肝损伤及中晚期肝脏疾病领域的深入研究，为新药开发提供了基础。
文档编号C12N5/071GK101225374SQ20081005951
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者乔洪翔, 吴理茂, 李连达, 欧阳竞锋 申请人:浙江大学