茶尺蠖反转录转座子基因rtp及其用途的制作方法

专利名称：茶尺蠖反转录转座子基因rtp及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于昆虫基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种茶尺蠖反转录转座子(retrotransposon， rtp)基因分离和分析；还涉及利用该基因进行调节茶尺蠖对病毒抵御能 力。
背景技术：
茶尺蠖是主要茶园虫害之一，因此也是重要的防治对象。随着茶园管理的无公害化和 有机化，化学合成农药的使用受到限制或禁止，而生物农药则成为大力推广的制剂。核型 多角体病毒(NPV)是常用防治茶尺蠖的生物农药。研究显示，NPV对幼龄茶尺蠖有较好 防效，但对3龄以上幼虫作用较小。高龄茶尺蠖对NPV产生抗性的原因的探索，将有助 于该生物农药的合理、高效使用。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种茶尺蠖反转录转座子基因rtp以及该基因编码的 蛋白质，该基因物的活性与不同龄期茶尺蠖害虫的抗病毒性能密切相关，可用于明确不同 龄期茶尺蠖对NPV的耐受性原因。为了解决上述技术问题，本发明提供一种茶尺蠖反转录转座子基因rtp，其具有SEQID No: l所示的核苷酸序列。本发明还同时提供了上述基因rtp编码的蛋白质，其具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸 序列。本发明还同时提供了上述基因rtp的用途，利用该基因物调节鳞翅目害虫的抗病毒性能。作为本发明基因rtp用途的改进病毒为核型多角体病毒。 作为本发明基因rtp用途的进一步改进鳞翅目害虫为茶尺蠖。作为本发明基因rtp用途的进一步改进将根据SEQIDNo: l所示的核苷酸序列设计的 rtpsiRNA注射入茶尺蠖体内，使内源rtp表达下调，达到茶尺蠖抗病毒能力下降。本发明通过分子生物学技术手段分离和分析与鳞翅目害虫抗病毒性能密切相关的基 因，为鳞翅目害虫NPV等生物农药的增强剂的研发奠定基础。本发明是采用cDNA-AFLP 和RT-PCR技术分离茶尺蠖等鳞翅目害虫与抗病毒性能有密切关系的基因rtp;证明rtp基因 表达与鳞翅目害虫不同龄期的抗病毒能力密切相关。实现本发明的具体技术步骤如下一、茶树鳞翅目害虫rtp基因分离和分析分别取高、低不同龄期茶尺蠖幼虫若干头。以TRIZOL (Invitrogen公司)试剂提取总 RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)分离mRNA。 分别取l-5吗mRNA进行cDNA合成，双链cDNA合成采用TakaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit (宝生物工程[大连]有限公司)进行。双链cDNA经异丙醇沉淀纯化后，以TakaRa BspHI/BssHII (宝生物工程[大连]有限公司)组合酶切消化。消化后的片段与事先设计的2 个接头SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4，以T4DNA连接酶(上海生工生物工程有限公司) 连接。以连接完成的cDNA片段为模板，以预扩增引物SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6进行 PCR预扩增。将预扩增产物适当稀释后，以选择性扩增引物组合SEQ ID No: 7和SEQ ID No: 8，进行选择性扩增。扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，以核酸银染试 剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行显带。从凝胶上割取在低幼虫龄无表达或弱表达、而在高龄期幼虫有强表达的对应条带。割 取目标带，以纯水浸提过夜后，取适量浸提液作为模板，以SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8 引物组合进行PCR，产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。电泳结束后割取目标条带，以UNIQ-IO 柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行片段回收，并插入pUCm-T载 体(上海生工生物工程有限公司)，阳性克隆委托Irwitrogen公司进行序列分析，确定了其 中一个157bp的显著差异序列与茶尺蠖龄期发育密切相关的片断，经与美国生物信息数据 库http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov比对，证实该序列与家蚕等反转录转座子具有较高同源性， 具体序列如SEQIDNo:9。以此片断以及检索到的家蚕rtp为基础，重新设计了2对引物，即 SEQIDNo: 10和SEQIDNo: 11、SEQIDNo: 12和SEQIDNo: 13。以4龄茶尺蠖幼虫cDNA 为模板，以上述2对引物进行PCR。两个PCR产物分别插入pUCm-T载体中，委托Invitrogen 进行序列分析，得到了长度分别1214bp和1046bp的2段序列。经S叫Man软件(DNAStar公 司)对上述片断进行拼接，剔除中间长157bp的重叠区序列，获得了长度为2104bp的可读序 列，具体如SEQIDNo:l。经与美国生物信息数据库http:/Zwww. ncbi.nlm.nih.gov比对证实，该序列与家蚕等昆虫的反转录转座子具有较高同源性。因此将该序列定名茶尺蠖rtp基因；经过EditSeq软件推演得到了包含700氨基酸的蛋白序列，具体如SEQ ID No:2。 二、 rtp基因表达与茶尺蠖抗病毒性能的关系将NPV病毒制剂用水稀释成常规使用浓度，即2.0X10S-2.0Xl()SpiB/毫升，以稀释后 的病毒液涂抹茶叶正面和反面，以带病毒的茶叶饲喂不同龄期茶尺蠖，分析其对病毒的耐 受性，同时研究rtp的表达情况。结果显示，当采用常规浓度处理l龄茶尺蠖幼虫时，幼虫 死亡率在95%以上，而相同的浓度处理2龄幼虫时，其病死比例约为60-80%，处理3龄幼虫 时病死比例只占处理总数20-40%，而4龄幼虫经病毒处理后病死率在20%以下。基因表达 分析显示，在l龄时茶尺蠖幼虫的rtp基因几乎不表达，随着发育龄期增加，该基因表达逐 渐加强。说明该基因的表达活性与茶尺蠖的抗病毒有很强的相关性，即rtp表达强则茶尺蠖 抗病毒能力强，反之亦然。进一步以siRNA技术研究了rtp基因表达对茶尺蠖抗病毒能力的影响。结果显示，以人 工体外合成的rtp-siRNA注射高龄茶尺蠖后，再以常规浓度的NPV词喂，高龄幼虫的抗病毒 能力大大降低，其死亡率达到65%以上，而未注射rtp-siRNA的对照，病毒饲喂后的死亡率 仍在40%以下。可见rtp的正常表达与茶尺蠖等鳞翅目害虫的抗病毒能力有密切关系。上述研究证实，rtp表达与茶尺蠖的抗病毒能力呈正相关，rtp表达强，幼虫抗病毒能力 强。而且rtp作用机制为rtp通过自身表达，实现反转录和转座行为，活化被插入下游的抗 病毒基因活性，从而使高龄幼虫具有强的抗病毒能力。 一旦rtp表达受到抑制，下游相关基 因无法活化，幼虫抗病毒能力下降。


下结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是由SEQ ID No: 7和SEQ ID No: 8引物组合所获得的低龄和高龄茶尺蠖幼虫 cDNA-AFLP差异条带的显示图；注其中M为分子量标记，A为l龄茶尺蠖幼虫，B为4龄茶尺蠖幼虫；黑色箭头所 示为目标条带(分子量约为150bp)。图2是以SEQ ID No: 14和SEQ ID No: 15引物组合PCR所得的不同龄期茶尺蠖中rtp 的表达情况显示图；注图中RNA为18sRNA，作为基因表达的背景参照。M为分子量标记，1为1龄幼 虫，2为2龄幼虫，3为3龄幼虫，4为4龄幼虫。
具体实施方式
实施例l:取1龄后期幼虫10头和4龄期茶尺蠖幼虫2头，以TRIZOL (Invitrogen公司)试剂提取总 RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)分离mRNA。 分别取l ng mRNA进行cDNA合成，双链cDNA合成采用TakaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit (宝生物工程[大连]有限公司)进行。双链cDNA经异丙醇沉淀纯化后，以TakaRa Bspffl和BssHII (宝生物工程[大连]有限公司)组合酶切消化，具体操作参照BspHI和BssHII 限制性内切酶使用说明。消化产物中加入等体积的异丙醇冰浴l小时后，13000转/分钟离心 25分钟后取沉淀。将沉淀与事先设计的2个接头SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4混合，以T4 DNA连接酶(上海生工生物工程有限公司)连接。以连接完成的cDNA片段为模板，以预 扩增引物SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6进行PCR预扩增。具体PCR预扩增条件为94。C变 性30秒，56。C退火60秒，72。C延伸60秒，共30个循环。将预扩增产物稀释20倍后，以选择 性扩增引物组合SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8，进行PCR选择性扩增，具体选择性扩增条 件为94。C变性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸60秒，l个循环；94。C变性30秒，65。C退火 30秒，并以每循环下降0.7。C， 72。C延伸60秒，12个循环；94。C变性30秒，56。C退火30秒， 72。C延伸60秒，23个循环。扩增产物以6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，以核酸银染 试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行显带，具体如图l所示。从凝胶上割取在l龄幼虫无表达、而在4龄期有强表达的对应条带。目标带以纯水浸提 过夜后，取适量浸提液作为模板，以引物组合SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8进行PCR，扩 增条件为94。C变性4分钟，l个循环;94。C变性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸60秒，35 个循环；72。C延伸5分钟。产物于1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳结束后割取目标条带， 以UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行片段回收，并插入 pUCm-T载体(上海生工生物工程有限公司)，阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析， 确定了其中一个157bp的显著差异序列与茶尺蠖龄期发育密切相关的片断，具体序列见SEQ ID No: 9，经与美国生物信息数据库1^9://^^.11(^.111111.1^.2(^比对，证实该序列与家蚕等 反转录转座子具有70%左右同源性。以此片断以及检索到的家蚕rtp (GenBank Accessing No. AB126055.1)为基础，重新设计2对引物，艮卩SEQIDNo: 10和SEQIDNo: 11、 SEQIDNo: 12和SEQIDNo: 13。以4龄茶尺蠖幼虫cDNA为模板，以上述2对引物进行PCR。两个PCR 产物分别插入pUCm-T载体中，委托Invitrogen进行序列分析，得到了长度分别1214 bp和1046bp的2段序列。经SeqMan软件(DNAStar公司)对上述片断进行拼接，剔除中间长157bp 的重叠区序列，获得了长度为2104bp的可读序列，具体如SEQIDNo:l。经与美国生物信息 数据库http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov比对证实，该序列与家蚕等昆虫的反转录转座子具有 60%左右的同源性。因此将该序列定名茶尺蠖rtp基因；经过EditSeq软件(DNAStar公司) 推演得到了包含700氨基酸的蛋白序列,具体如SEQIDNo:2，该序列与家蚕等反转录转座子 具有60%以上的同源性。 实施例2:将NPV病毒制剂用水稀释成10.0X 105 PIB/毫升，以稀释后的病毒液涂抹茶叶正面和反 面，室内晾干后饲喂l龄、2龄、3龄和4龄期茶尺蠖，于饲喂2小时后，在各处理中取样2-10 头幼虫。上述幼虫样品以TRIZOL (Invitrogen公司)提取总RNA，并以重新设计的引物组 合SEQIDNo: 14和SEQIDNo: 15 (预计产物长度为341bp)进行PCR，研究不同龄期rtp表 达以及幼虫对NPV病毒抗性的相关性。结果显示，NPV病毒制剂处理1龄茶尺蠖幼虫后， 幼虫死亡率约为93%，而2龄幼虫的病死比例约为75%， 3龄幼虫的病死比例只占处理总数 37%，而4龄幼虫经病毒处理后病死率18%。基因表达分析显示，在l龄时茶尺蠖幼虫的rtp 基因几乎不表达，条带强度为0.10以下，2龄幼虫rtp强度为0.35， 3龄幼虫rtp强度为0.85， 4 龄幼虫rtp强度为0.98，见图2。可见随着发育龄期增加，该基因表达逐渐加强。说明该基因 的表达活性是组成型的，且与不同龄期茶尺蠖的抗病毒性能有很强的相关性，即rtp表达强 则茶尺蠖抗病毒能力强，反之亦然。以茶尺蠖rtp SEQ ID No: 1为材料，采用TaKaRa siRNA Cocktail Kit (si-RNAase III TM)(宝生物工程[大连]有限公司)制备可与鳞翅目害虫内源rtp发生双链干涉作用的 rtp-siRNAs。将60头3龄茶尺蠖分成2组， 一组用于rtp-siRNAs注射处理，另一组为对照。将 制备的rtp-siRNAs用水溶解后，从3龄幼虫气门处注射rtp-siRNAs，注射剂量为每头300ng的 rtp-siRNAs(注射体积为2PL);同时以注射等体积纯水为对照。注射处理24小时后，再以IO.O X105PIB/毫升NPV涂抹处理后的茶叶饲喂，饲喂3天开始计算死亡数量，直至化蛹为止。 结果显示，以rtp-siRNA抑制茶尺蠖内源rtp基因活性后，3龄幼虫在词喂NPV后，对NPV的 敏感性显著增加，第7天时幼虫死亡率已达87%,而没有注射rtp-siRNA的对照饲喂NPV后 死亡率仅为40%。可见注射rtp-siRNA干涉高龄幼虫内源rtp表达活性后，高龄幼虫对NPV的 抗性显著降低。反过来证明rtp的正常表达对茶尺蠖抗病毒能力提高有显著作用。 —本发明试验证明茶尺蠖内源rtp基因的正常表达与茶尺蠖对NPV的抗性密切相关。因此，rtp的表达受发育进程控制，该基因的表达引起的转座对茶尺蠖抗病毒有利。rtp基因及 其产物是茶尺蠖等害虫病毒农药的新型增效剂的研发中的潜在作用位点。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQ ID No: 1acttctcgcgtgccccacaatcagatgacgtcactattgaggccacatcgcaggaggtta60cggctgcgattacatcttttttgagtggctcagceggaggcctagatggcctgacacctc120aac at c t aaaagatcttctatcttttagctctggtg郷tcgcagagtccctcttgagag180atctaacctctttagtt犯tctcatgttatctggtcgagtcagtagtgatattgtcgaag240ttttgtacggcgctaatctgtgcgcacttttggtgggatc3ggCC33tCg300ctgtcggcactacatatcgtcgccttgctgcc卿gtgggttgtaggaaaaaggttgctc360ttttgagctcccttttccaaCC^t3C33Ctcggctttggttcgcggggtggatgtg鄉420ctgccgttxattctgtccggaccttccttccgg卿ggtgctgtt犯agg480tggacgtcaaa犯cgctttt幼ttcggttgatcgaggagccctgttggccca^gtgsiEigg540ataaaattectgatctgtacaattttctttggcaatgttatggcgagcccacaaaattga600ct tatcaaaacaatcatatgctatcctccgttggctgtcaa^鄉gtg3tcccttcggcc660ctgcgaccttcgccctggccattcaccctatcattcaacgtctccagtcca^a<cta<aacg720tttggtacttggacgeicggsacgttggggcacgcg卿agt犯aatactgc鄉ggttgc780ccgttgtgggtttgagtcttcacgggg咖gttgtgaatttttcggggtcgctgttcatt840gggtctttgggtatgttctcgctgaatctgggcttcattattctccagagtttattgggg900gaattgttgatgggtcggtttegactgetgttgctgagtttcgatcatttttagggttta960ttatttattceggacttttttttcgtaatgcgtgtggagttttaaagectttatctgagc1020ttttgaaa犯agg犯at犯ctggtactggggagcttgtcatgagaacgettttaeggege1080ttaagaactttttggcgttggatctggtattggctcattttaattataacgcgtccctca1140ttttaactgttgstgtgtcgcggtcaggtctttcagegattttttttcagat3gaatc犯1200ctgggUtgcgcgcccggtgttttttgcgtcgcgaatcctaagtgttgctgat犯tggtt1260attctcegtttcaggtggtagccaacgctattattttttgtgttcggggttactaccatt1320tcgactstattgtaggattgttccatttatettaegtacagatcttgaactgcttttctt1380ggtttttggtttttatcgaggtattttctcCC￡lCC3tCC3atgc犯caactgecttagat1440ttggacatcattgccgctctcaacctcgacgctttcgttgt3C3C犯CCtC1500actgtgg卿caattgegtggtgCEl卿gtcagaggcttcatgectataetgetctgage1560RFLP检测将PCR产物3nL, 10xBuffer lpL，限制性内切酶///"P1I为0.2(iL (2U)，加双蒸水补至 10nL，将样品混匀后离心，37'C培养箱放置12h，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在 紫外灯下拍照。用引物扩增猪基因组DNA得到了 635bp特异性扩增片段(详见图4)，序列分析结果表明在144bp处 存在C144-T144突变，并导致州力PII多态性。该基囚突变位点由两个等位基囚控制，其中T是没有形成 酶切位点的等位基因，C是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型其中AA型为未 发生酶切的纯合型(电泳检测时只有635bp —条DNA带)，BB型为发生酶切的纯合型(电泳检測时出现 492bp和143bp两条DNA带)，AB为杂合型(电泳检测时出现635bp、 492bp和143bp三条DNA带)。 (三)PCR—^ff^PlI—RFLP多态性在各猪品种中的分布情况的检测的应用利用PCR—iZ/"PlI—RFLP检测了六个猪种其中属丁中国地方血缘的猪种分别是二花脸猪，通城猪， 大花白猪，属于外来的例如欧美血缘的猪种分别是长白猪，大白猪和杜洛克猪。该突变位点在不同猪种中 的基因型和基因频率如表l所示，结果显示在地方猪种中等位基因A占优势.在国外猪种中等位基因G 占优势。_表1:几个猪品种中gCL/tf基因144位点多态性的基因型和基因频率_基因型 等位基因频率品种 个体数,T 1 "奴 TT(AA) TC(AB) CC(BB) T (A) C(B)二花脸猪 22 0 1 21 0.023 0.977通城猪 35 0 3 32 0.043 0.957大花白猪 41 4 16 21 0.293 0.707长白猪 17 2 11 4 0.441 0.559大白猪 31 5 19 7 0.468 0.532杜洛克猪 32 0 11 21 0.172 0.828x 2检验六个猪种间基因型频率差异性发现，几个猪种间基因频率差异不显著 实施例2实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的K:白猪(为国外猪种血缘)，父母代为 17头长白猪公猪和36头长白猪母猪，子一代长白猪共302头仔猪，父母代及子代全部进行了基因型检测， 子代在0、 17、 32日龄采集抗凝血和非抗凝血，采用常规方法对血常规和抗体水平进行检测。所分析的性状主要是免疫性状，包括猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水 平、伪狂犬抗体水平及血常规18项。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析5C丄" 基W SNPs位点的基因型效应及其与免疫指标的关系Y=X|3+ZY+e其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；p为固定效应参数向量，包括性别效应、胎 次效应、线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；Y为所有随机效应 参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS(Version 8.1)软件中MIXED125130135GlyGlyCysGlu Ala Ala ValHisSer Val ArgThrPhe Leu His140145150GinAsnCysGly Glu Val LeuLeu Lys Val AspValLys Asn Ala155160165PheAsnSerVal Asp Arg GlyAla Leu Leu AlaGinVal Lys Asp170175180LyslieProAsp Leu Tyr AsnPheLeu Trp GinCysTyr Gly Glu185190195ProThrLysLeu Thr Tyr GinAsnAsn His MetLeuSer Ser Val200205210GlyCysGinGin Gly Asp ProPheGly Pro AlaThrPhe Ala Leu215220225AlalieHisPro lie lie GinArgLeu Gin SerLysLeu Asn Val230235240TrpTyrLeuAsp Asp Gly ThrLeuGly His AlaSer Lys lie245250255LeuGinGlyLeu Pro Val ValGlyLeu Ser LeuHisGly Glu Ser260265270CysGluPhePhe Gly Val AlaValHis Trp ValPheGly Tyr Val275280285LeuAlaGluSer Gly Leu HisTyrSer Pro GluPhelie Gly Gly290295300lieValAspGly Ser Val SerThrAla Val AlaGluPhe Arg Ser305310315PheLeuGlyPhe lie lie TyrSerGly Leu PhePheArg Asn Ala320325330CysGlyValLeu Lys Pro LeuSerGlu Leu LeuLysLys Gly Asn335340345Asn Trp Tyr Trp Gly Ala Cys His Glu Asn Ala Phe Thr Ala Leu 350 355 360Lys Asn Phe Leu Ala Leu Asp Leu Val Leu Ala His Phe Asn Tyr 365 370 375Asn Ala Ser Leu lie Uu Thr Val Asp Val Ser Arg Ser Gly Leu 380 385 390Ser Ala lie Phe Phe Gin lie Glu Ser Thr Gly Phe Ala Arg Pro 395 400 405Val Phe Phe Ala Ser Arg lie Leu Ser Val Ala Asp Asn Gly Tyr 410 415 420Ser Pro Phe Gin Val Val Ala Asn Ala lie lie Phe Cys Val Arg 425 430 435Gly Tyr Tyr His Phe Asp Tyr lie Val Gly Leu Phe His Leu Ser 440 445 450Tyr Val Gin lie Leu Asn Cys Phe Ser Trp Phe Leu Val Phe lie 455 460 465Glu Val Phe Ser Pro Thr lie Gin Cys Asn Asn Cys Leu Arg Phe 470 475 480Gly His lie Lys Asn Gin Cys Arg Ser Gin Pro Arg Arg Phe Arg 485 490 495Cys Thr Gin Pro His Cys Gly Asp Asn Cys Val Val Gin Glu Ser 500 505 510Glu Ala Ser Cys Leu Tyr Cys Ser Glu His His Phe Ser Thr Ser 515 520 525Arg Ser Cys Pro Glu Gin Glu Arg Gin Arg Ala lie Lys Met Lys 530 535 540Met Ser Arg Asp Gly lie Ser Tyr Gin Glu Ala Cys Ser Gin Thr 545 550 555Ala Lys Val Asn Arg Arg Leu Asn Gin Val Ala Gly Ser Val Pro560565570ValThrGinThrGinAla SerLeuLeuProProSerAsnAla Thr575580585GinProProProSerSer SerSerGinProPheGinSerTyr Arg590595600LysThrValSerHisSer ProArgProLysAlaLeuLeuGly Lys605610615SerTyrAspArglieAla HisGinAsnlielieAlaGinGly Pro620625630SerThrlieProAsnGly TyrProLeuGluArgAlaGinSer Gin635640645SerProHisProThrPro AspSerHisGinLeuLeuThrGin Leu650655660LeuThrlielielieAsn MetlieThrHisAspProAsnSer Leu665670675ProSerAsnValAlaHis MetliePheGinLeuProSerLeu lie680685690AsnHisHis Gly Ser Met Pro Asn Asn Pro695 700SEQIDNo: 3 (BspHI接头)5，-CTCGTAGACTGCGTACC -3，3，- CATCTGACGCATGGGTAC-5SEQIDNo: 4 (BssHII接头)5，-GACGATGAGTCCTGAG -3，3，- TACTCAGGACTCGCGC-5"SEQIDNo: 5 (预扩增上游引物)5，-GTAGACTGCGTACCCATGA-3， SEQIDNo: 6 (预扩增下游引物)5，-GATGAGTCCTGACGCGCA-3，SEQIDNo: 7 (选择性扩增上游引物)5，-GACTGCGTACCCATGAG-3， SEQIDNo: 8 (选择性扩增下游引物)5，-GATGAGTCCTGACGCGCAA-3， SEQIDNo: 9tcatgagaac gcttttacgg cgcttaagaa ctttttggcg ttggatctgg tattggctca 60 ttttaattat aacgcgtccc tcattttaac tgttgatgtg tcgcggtcag gtctttcagc 120 gatttttttt cagatagaat caactgggtt tgcgcgc 157SEQIDNo: SEQIDNo: SEQ ID No: SEQIDNo: SEQ ID No: SEQIDNo:10 5，-AYTTYTCGCRTRYCCCRSAATC11 5，-GCGCGCAAACCCAGTTGATTC12 5，-CATGAGAACGCTTTTACGGCGC13 5，-ATTSSATTAYTRGRCATARA14 (rtp表达上游引物)15 (rtp表达下游引物)5 ，-ACTATTGAGGCCACATCGCAGGAG ;，-CCGC AATTTTGGTGAAGGAAGGT
权利要求
1、一种茶尺蠖反转录转座子基因rtp，其特征是具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 如权利要求l所述的基因rtp编码的蛋白质，其特征是具有SEQIDNO: 2所示的氨 基酸序列。
3、 如权利要求l所述的基因rtp的用途，其特征是利用该基因物调节鳞翅目害虫的抗病 毒性能。
4、 根据权利要求3所述的基因rtp的用途，其特征是所述病毒为核型多角体病毒。
5、 根据权利要求4所述的基因rtp的用途，其特征是所述鳞翅目害虫为茶尺蠖。
6、 根据权利要求5所述的基因rtp的用途，其特征是将根据SEQIDNo: l所示的核苷酸 序列设计的rtp siRNA注射入茶尺蠖体内，使内源rtp表达下调，达到茶尺蠖抗病毒能力下降。
全文摘要
本发明公开了一种茶尺蠖反转录转座子基因rtp，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本发明还公开了上述基因rtp编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还公开了上述基因rtp的用途利用该基因物调节鳞翅目害虫的抗病毒性能。
文档编号C12N15/12GK101215566SQ200810059158
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月14日 优先权日2008年1月14日
发明者晨 林, 梁月荣, 董占波, 郑新强, 陆建良 申请人:浙江大学