专利名称：一种含有内切几丁质酶基因的重组载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是一种内切几丁质酶、表达该酶的基因以 及含有内切几丁质酶基因的重组载体。
背景技术：
几丁质又称甲壳素，化学名为(l,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-卩-D-葡萄糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过p-l,4-糖苷键连接而成的天然高分子氨基多糖类化合物，广 泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞和甲壳动物虾、蟹、昆虫外壳以及高等植 物的细胞壁中。自然界中几丁质年生物合成量近一百亿吨，其中10%来自于海 洋，是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源，但遗憾的是这一资源未被充 分利用而作为废物自然流失，不仅造成了巨大的浪费，而且还导致了严重的环 境污染。大量的废弃几丁质资源由于没有行之有效的处理方法或因处理效果不 好长期存在于自然环境中，在一定条件下会发生化学的、物理的或生物的转化， 对周围环境造成一定的影响。污染成分不仅通过水、气、土壤、食物链等途径 污染环境，成为大气、水体和土壤环境污染的"源头"；同时又是各种病源微生物 的孽生地和繁殖场，形成病源型污染，严重危害人体健康。如何充分利用这些 几丁质资源，使之变废为宝，消除其对环境的污染，成为目前急需解决的重要 问题。近年来人们逐渐发现几丁质的中间降解产物几丁寡糖具有区别于单糖的某 些独特的生理功能增强人体免疫机能；促进脾脏抗体的形成；抗肿瘤及抑制 肿瘤转移；降低胆固醇和血脂的含量；抗血栓、降血压、降血糖、抗凝血、抗 菌和抑菌等生物活性并能选择性地活化和增殖人体肠道内的有益菌；消除体内霉素，调节生理机能，延缓衰老；强化肝脏机能，阻碍病原菌生长繁殖和排除 体内重金属等，已被科学界列为人的生命第六要素，是目前发现的唯一的阳离 子动物性膳食纤维，在医药、保健、化工、食品、环境和农业等领域具有广泛 的应用前景，附加值高，因此几丁寡糖的生产已成为开发利用几丁质原料的一 条重要途径。几丁质可通过酸法或酶法降解。酸法降解能耗大，降解程度难以控制，降解 产物主要为单糖，降解过程中产生的含硫酸或盐酸的废水直接排放或加碱中和 后排放到环境中，对环境造成严重的二次污染。酶法降解具有反应条件温和， 能耗低，无需昂贵设备和对环境友好等优点，因而具有良好的应用前景。几丁 质可通过几丁质降解酶系作用而降解。根据反应初级产物类型和水解切口位置 的不同，几丁质降解酶系可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和几丁二糖酶。 内切几丁质酶从几丁质链的内部切割(3-l，4糖苷键，产生几丁寡糖；外切几丁质 酶从几丁质链的非还原性末端依次切割P-1,4糖苷键，产生几丁单糖；几丁二糖 酶则专一性的将几丁二糖降解为几丁单糖，因此研制高效廉价的内切几丁质酶 是催化几丁质降解成几丁寡糖的关键所在。 发明内容本发明的目的是提供一种含有内切几丁质酶基因的重组载体。该重组表达 载体的特征在于，在质粒pMD-19-T中包含有SEQIDNO.l核苷酸序列。本发明的另一个目的在于提供一种利用上述重组载体构建的大肠杆菌表达 载体。本发明的另一个目的在于提供一种利用构建的大肠杆菌表达载体转化的大 肠杆菌宿主。本发明的另一个目的在于提供一种利用上述重组载体构建的巴斯德毕赤酵母表达载体。本发明采用现代生物技术，从木霉中克隆出内切几丁质酶基因，构建了微 生物表达载体，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模 工业化发酵生产的大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶 工程菌，可并利用其催化几丁质降解成几丁寡糖，实现几丁寡糖的工业化生产 和产业化示范。
图1表示木霉内切几丁质酶cDNA质粒的获得。图2表示木霉内切几丁质酶基因DNA的获得。图3表示木霉内切几丁质酶cDNA含信号肽原核表达载体的构建。图4表示木霉内切几丁质酶cDNA不含信号肽原核表达载体的构建。图5表示木霉内切几丁质酶cDNA的真核表达载体的构建。
具体实施方式
实施例l.木霉内切几丁质酶cDNA的获得Trizol法提取总RNA:在液氮中将100mg木霉菌丝体磨成粉末，趁液氮尚 未挥发光时，将粉末转移到1.5mL离心管中。用lmL针筒，26-G号(0>4.5)针 头抽吸匀浆液多次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到 1.5mLEppendorf管中。加入100|oL氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈振荡混匀30秒。 台式离心机上，12,000rpm，室温离心5分钟。将上清液小心转移到无菌 1.5mLRNase-free离心管里，加入150jjL无水乙醇，混匀。将上述溶液全部转移 到套放于2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置5分钟，8，000rpm离心1 分钟。小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入45(HiL RPESolution， 10,000rpm室温离心30秒。小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，10，000rpm，室温离心1分钟。小心取出柱子，放入无菌 Nase-free的1.5ml离心管里，在柱内膜的中央小心加入15^iL DEPC-H20， 55-8CTC 放置2分钟后得到绿色木霉总RNA。以绿色木霉总RNA为模板，以P1和P2为引物，P1 ( SEQ ID NO.4 ): 5'画GACGAATTCATGTTGGGCTTCCTCGGAAAA腸3' P2 (SEQIDN0.5): 5'-AGACTCGAGAGTTGAGACCGCTTCGGATGTT画3'用AMV两步逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，通过RT-PCR技术 扩增得到内切几丁质酶基因编码序列ECH(SEQIDNO.l)，用Solutionl将该基 因编码序列连接到pMD19-T载体上，用CaCl2法42。C热激90秒后将其转化到 大肠杆菌DH5a。利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆经PCR、酶切鉴定 和DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公司测序。木霉内切几丁质酶cDNA质粒(pMD-ECH)的构建流程见图l。所获得的木霉内切几丁质酶cDNA序列见SEQIDNO.l。木霉内切几丁质酶氨基酸序列见SEQIDN0.2。实施例2.木霉内切几丁质酶DNA的获得称取木霉菌丝200mg (鲜重)在液氮中研磨成粉，将菌丝粉用0.5ml溶液I (100mmol/L NaCl; 30mmol/L Tris國HCl， pH 7.8; 10mmol/L EDTA， pH8.0; 10mmol/Lp-巯基乙醇)悬浮，悬浮液于12000g离心lmin得沉淀，重新加入溶 液I (100mmol/LNaCl; 30mmol/LTris誦HCl， pH7.8; 10mmol/LEDTA， pH8.0; 10mmol/L P-巯基乙醇)悬浮离心一次。将沉淀用0.6mL溶液n (0.1mmol/LNaCl; 0.2mmol/L蔗糖；10mmol/L EDTA)悬浮。加入0.2mL裂解液，剧烈振荡lmin 后将悬浮液置于55'C水浴处理30min。用等体积酚/氯仿/异戊醇(25: 24: 1)抽提2次，于12000g离心5min。取上清加入1/10体积3mol/LNaAc,混匀后加 入2倍体积无水乙醇，室温沉淀10min， 12000g离心5min。沉淀用70%乙醇清 洗后吹干，溶于适量TE (10mmol/L Tris'Cl (pH8.0) ， 1 mmol/LEDTA (pH8.0)) (含RNase)后制得基因组DNA。以所获得的基因组DNA为模板，以P1和P2为引物， PI (SEQIDN0.4): 5'-GACGAATTCATGTTGGGCTTCCTCGGAAAA-3' P2 ( SEQ ID NO.5 ): 5'-AGACTCGAGAGTTGAGACCGCTTCGGATGTT-3' 用PCR技术扩增出内切几丁质酶基因片断ECHDNA。用Solution I将基因 编码序列连接到pMD19-T载体上，用CaCl2法42。C热激90秒将其转化到大肠 杆菌DH5a。利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆经PCR、酶切鉴定和 DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公司测序。图2为木霉内切几丁质酶DNA质粒(pMD-ECHDNA)的构建流程。 获得的木霉内切几丁质酶基因组DNA核苷酸序列见SEQ ID N0.3。实施例3.木霉内切几丁质酶cDNA的原核表达载体的构建如图3所示，为木霉内切几丁质酶cDNA含信号肽原核表达载体的构建流程。 比较基因组DNA和cDNA序列，得到内含子部分序列，由此设计两组引物构建含信号肽(引物P1， P2)和不含信号肽(引物P3， P2)的原核表达载体。引物序列如下PI (SEQIDN0.4): 5'國GACGAATTCATGTTGGGCTTCCTCGGAAAA画3' P2 ( SEQ ID NO.5 ): 5'-AGACTCGAGAGTTGAGACCGCTTCGGATGTT-3' P3 (SEQIDN0.6): 5'國CATGAATTCGCCAGCGGATATGCAAACGCC-3' 用碱法提取质粒pMD-ECH和大肠杆菌原始表达载体pET28a (购自美国Novagen有限公司)。以P1和P2为引物，以pMD-ECH为模板，用PCR技术扩 增出含信号肽的内切几丁质酶ECH片段，并用限制性内切酶EcoRI和Xhol双 酶切得后插入经EcoRI和Xhol酶切的大肠杆菌表达载体pET28a的多克隆位点， 得到含信号肽的原核表达载体pET-ECH，利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化 克隆经PCR、酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公 司测序。如图4所示，为木霉内切几丁质酶cDNA不含信号肽原核表达载体的构建。 以P2和P3为引物，以pMD-ECH为模板，用PCR技术扩增出无信号肽成 熟的内切几丁质酶MECH片段，并用限制性内切酶EcoRI和Xhol双酶切后插 入经EcoRI和Xhol酶切的大肠杆菌表达载体pET28a的多克隆位点，得到不含 信号肽的原核表达载体pET-MECH，利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆 经PCR、酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公司测 序。实施例4.大肠杆菌工程菌株的构建、内切几丁质酶的表达和酶活测定将构建好的两个原核表达载体(pET-ECH和pET-MECH)用CaCl2法将其 转化到大肠杆菌BL21菌株中，利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆经PCR、 酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确。经验证正确的不含信号肽的阳性克隆37t:过夜活化后，5%接种量转接共 5mL含Kana的LB培养基中，37。C振荡培养至OD6(W=0.8，加入IPTG至终浓 度为0.5mM， 3(TC诱导培养4小时，离心收集菌体，加入一定体积的Lysis buffer(50mM Tris-HCl，lmM EDTA)重悬，超声反复破壁，然后12000rpm,4。C离 心20min，收集上清后测定表达的内切几丁质酶的酶活。测定酶活条件如下用1X胶态几丁质作为底物，pH-7缓冲液，37X:反应1小时，加入3mLDNS,10(TC 反应10min中止反应，迅速用冷水冷却，离心取上清测定其OD54onm值。酶活 定义pH二7缓冲液环境，37°C，每分钟催化胶态几丁质生成lmgNAG(乙酰氨 基葡萄糖)定义为一个酶活单位。按照该方法经初步测定所构建并筛选的重组大 肠杆菌产几丁质酶的酶活为100U/mg。实施例5.木霉内切几丁质酶cDNA的真核表达载体的构建如图5所示，为木霉内切几丁质酶cDNA不含信号肽的真核表达载体的构 建流程。用碱法提取质粒pMD-ECH和巴斯德毕赤酵母原始表达载体pPIC9K (购自 美国Invitrogen公司)，以P3和P4为引物，P3 (SEQ ID NO.6): 5'-CATGAATTCGCCAGCGGATATGCAAACGCC-3' P4 (SEQ ID NO.7 ): 5'-AAGCGGCCGCCTAGTTGAGACCGCTTCGGATGTT-3' 以pMD-ECH为模板，用PCR技术扩增出不含信号肽的内切几丁质酶基因 MECH片断，用限制性内切酶EcoRI和Notl双酶切后插入经EcoRI和Notl双酶 切的毕赤酵母表达载体pPIC9K多克隆位点，得到真核表达载体pPIC9K-MECH。本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本 发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述 实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。序列表〈110〉浙江工商大学〈120〉 一种含有内切几丁质酶基因的重组载体〈130>〈160〉 7〈170> Patentln version 3.2〈210〉 1〈211〉 1275<212> 腿<213〉 7!rj'c/ oofer鹏〈400〉 1atgttgggcttcctcggaaa3tccgtggccctgcttgctgcgctgcaggcC3CCttC3CC60tctgcstctcccgtaactgc3S3cgscgtctctgttg3g3sgsgsgccagcggatatgc3120ascgccgtct3CttC3CC33ctggggtatctscggccgcs3cttccsgcctcsgsscctg180gttgcgtcgg3C3tc3ctcattgtcstctaictcgttcatgascttccaagcagscggcsct240gtcgtctctggagstgcctscgccgattstcsg33gcactatgacgacgattcttggssc300gacgtcggtsac33tgcgtscggctgtgtg3sgc3gctgttcaagttgaag3sggccs3C3603ggtcstgctttct3tcggtggctggscctggtccscc3Scttcccctct420gc3gc3sgc3ccgstgcc33ccgc33g33ctttgcc33gscggccstcsccttcatgaag480gsctggggtttcgatggtatcgatgtcgactgggagtsccctgccgatgacscccsggcc5403CC33C3tggttcttctgctc33gg3g3tccgstctcagctagatgcctatgctgcgcs3600tatgctccsggCt3tC3Cttccttctctccattgctgcccccgctggccccg3gcsctsic660tctttcctgcacstgtccgsccttggcc33gttctcg3ctatgtcaacctcstggcctst720gaictstgctggttcttggsgcsgctsctccggscscgstgccsscttgtttgccsscccg780七Ct33CtCC33ctcttcgcc3t3C33C3CCgstc33gctstc3sggsct3tatcaaggga840ggtgttcccgC3sgc33gatcgttcttggt3tgccc3tctacggscg3tctttcgagagc9003ccggtggcsttggccsgacct3c3gtgg33tcgg3tctgg33gctggg3g3scggt3tc960tgggactscaaggttcttcccssggccggcgctacsgtcctaccgcacsg1020gcatactscsgctstgsccccsgcsgcs3ggagctc3tctctttcgstacccctgccstg1080sggtctcttsctcggcctgggsggcsgcstgttctgggss1140gcttctgctg3C33gsctggctctgsctccttg3tcgg33ccsgccsc3g3gctctggg3"00sgcctagactCC3CtC3g33cttgctgggct3CCCC33Ctccc3gt3tgaC3scatccga1260sgcggtctcs1275<210〉 2<211〉 424<212> PRT〈213> 7Wc/100 27ffl3<■> 2Met Leu Gly Phe Leu Gly Lys Ser Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gin15 10 15Ala Thr Phe Thr Ser Ala Ser Pro Val Thr Ala Asn Asp Val Ser Val20 25 30Glu Lys Arg Ala Ser Gly Tyr Ala Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp35 40 45Gly lie Tyr Gly Arg Asn Phe Gin Pro Gin Asn Leu Val Ala Ser Asp50 55 60lie Thr His Val lie Tyr Ser Phe Met Asn Phe Gin Ala Asp Gly Thr 65 70 75 80Val Val Ser Gly Asp Ala Tyr Ala Asp Tyr Gin Lys His Tyr Asp Asp859095Asp Ser Trp Asn Asp Val Gly Asn Asn Ala Tyr Gly Cys Val Lys Gin100105110Leu Phe Lys Leu Lys Lys Ala Asn Arg Asn Leu Lys Val Met Leu Ser115120125lie Gly Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr130135140Asp Ala Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys Thr Ala lie Thr Phe Met Lys145150155160Asp Trp Gly Phe Asp Gly lie Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp165170175Asp Thr Gin Ala Thr Asn Met Val Leu Leu Leu Lys Glu lie Arg Ser180185190Gin Leu Asp Ala Tyr Ala Ala Gin Tyr Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu195200205Leu Ser lie Ala Ala Pro Ala Gly Pro Glu His Tyr Ser Phe Leu His210215220Met Ser Asp Leu Gly Gin Val Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Ala Tyr225230235240Asp Tyr Ala Gly Ser Trp Ser Ser Tyr Ser Gly His Asp Ala Asn Leu245250255Phe Ala Asn Pro Ser Asn Ser Asn Ser Ser Pro Tyr Asn Thr Asp Gin260265270Ala lie Lys Asp Tyr lie Lys Gly Gly Val Pro Ala Ser Lys lie Val275 280 285Leu Gly Met Pro lie Tyr Gly Arg Ser Phe Glu Ser Thr Gly Gly lie290 295 300Gly Gin Thr Tyr Ser Gly lie Gly Ser Gly Ser Trp Glu Asn Gly lie 305 310 315 320Trp Asp Tyr Lys Val Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Val Gin Tyr Asp325 330 335Ser Thr Ala Gin Ala Tyr Tyr Ser Tyr Asp Pro Ser Ser Lys Glu Leu340 345 350lie Ser Phe Asp Thr Pro Ala Met lie Asn Thr Lys Val Ser Tyr Leu355 360 365Lys Asn Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp370 375 380Lys Thr Gly Ser Asp Ser Leu lie Gly Thr Ser His Arg Ala Leu Gly 385 390 395 400Ser Leu Asp Ser Thr Gin Asn Leu Leu Gly Tyr Pro Asn Ser Gin Tyr405 410 415Asp Asn lie Arg Ser Gly Leu Asn 420 424〈210> 3 〈211〉 1467〈212〉 隨〈213〉 Wc/ oofer鹏<400〉 3atgttgggcttcctcgg333stccgtggccctgcttgctgcgctgcaggcC3CCttC3CC60tctgcstctcccgt33Ctgc333cg3cgtctctgttgsgacggst3tgc31203scgccgtct3CttC3CC33ctggtgsgcs33gct3cttc3gsgtcstg3333ccsgggc180taatattggtgatca3aggggtatctacggccgcaacttccagcctcsgascctggttgc240gtcggsc3tc3CtC3tgtC3tctsctcgttC3tg33cttccaagcagacggcactgtgt33003gttttg33g3cssgagtca33gg3ttctaattttcst3Ctcagttgct33tCttttC3C360ctatagcgtctctggagstgcctacgccg3csct3tg3cgacgattgtat420g3tsgccctgctccctttgtcctcctatttttgagctctg33CgtCt3C3480aicagcttggaacgscgtcggtscggctgtgtgasgcagctgttC3sgttg5403ccgc3scttgssggtc3tgctttctstcggtggctggscctggtccacc60033CttCCCCtctgcsgcs3gcsccgstgcc3CtttgCC33gscggcc3tc660accttcatgssggactggggtttcgatggtstcg3tgtcgaccgggagtaccctgccgst720g3cscccsggCC3CC33C3tggttcttctgctc33ggsgstccgstctcsgctagatgcc780tatgctgcgc33t3tgctccaggct3tC3cttccttctctccsttgctgcccccgctggc840cccgsgcsct3CtCtttCCtgcscstgtccgsccttggccaagttctcgact3tgt仁33c900ctcstggcct3tgsct3tgctggttcttgg3gcsgctsct.ccggacacgatgcc3scttg960tttgccaacccgtct33ctccaactcttcgccgstcaagctatcaaggac1020tatatcaagggsggtgttcccgc33gc33gatcgttcttggt3tgcccstct3cggscg31080tctttcgsgsgcaccggtggcsttggccsg3cct3csgtgg33tcggstctgg33gctgg1140tctggg3ctsC3sggttcttcccaaggccggcgctacsgtccsgt3tg3c1200tctsccgcacaiggeigctcaLtctctttcgat1260acccctgccstgstc33C3ccssggtctct3cctcggcctgggaggcagc1320atgttctggg3sgcttctgctg3C33gsctggctctgsctccttgstcgg1380sgsgctctggctccsctcsg33cttgctgggctaccccaaCtCCC3gt3tl"0gaagcggtctcaactag1467〈210〉 4 <211〉 30 〈212〉 DNA 〈212〉人工序列〈400〉 4gscg33ttcs tgttgggctt cctcggssss 30
〈210〉 5
〈211〉 31
<212> DNA <212>人工序列
〈400〉 5
agactcgaga gttgagaccg cttcggatgt t 31
〈210〉 6 〈211〉 30 〈212〉 腿 〈212〉人工序列
〈400〉 6
catgaattcg ccagcggata tgcaaacgcc 30
〈210〉 7 〈211〉 34 〈212〉 DNA 〈212〉人工序列
〈400〉 7
sagcggccgc ctagttgaga ccgcttcggs tgtt 3权利要求
1.一种含有内切几丁质酶基因的重组载体，其特征在于，在质粒pMD-19-T中包含有SEQ ID NO.1核苷酸序列。
2. 一种利用权利要求1所述重组载体构建的大肠杆菌表达载体。
3. —种由权利要求2所述大肠杆菌表达载体转化的大肠杆菌宿主。
4. 一种利用权利要求1所述重组载体构建的巴斯德毕赤酵母表达载体。
全文摘要
本发明涉及一种内切几丁质酶、表达该酶的基因以及含有内切几丁质酶基因的重组载体。本发明采用现代生物技术，从木霉中克隆出内切几丁质酶基因，构建了微生物表达载体，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶工程菌，可并利用其催化几丁质降解成几丁寡糖，实现几丁寡糖的工业化生产和产业化示范。
文档编号C12N15/70GK101225401SQ200810059170
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月16日 优先权日2008年1月16日
发明者平 于, 励建荣, 唐云平, 蕾 张, 朱军莉, 李学鹏, 章慧慧, 陆海霞 申请人:浙江工商大学