中期因子基因为靶的小干扰rna、载体及其应用的制作方法

专利名称：：中期因子基因为靶的小干扰rna、载体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中期因子基因为靶的小干扰RNA(SiRNA)、含有该小干扰RNA的载体，及其在制备抗肿瘤药物和防治新生血管异常增生的药物中的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
：肝癌是种高侵袭性、高转移性的实体恶性肿瘤。尽管目前针对肝癌细胞本身进行的手术切除、化疗和放疗等治疗方案日趋完善，但仍难以取得满意的疗效，因此探索新的有效的治疗途径已成为提高肝癌生存率的关键。近年研究表明，与其他实体恶性肿瘤一样，肿瘤血管生成(angiogenesis)是肝癌无限制侵袭生长和转移的基础，如果没有新生血管生成，原发肿瘤的生长不会超过12mm3。肿瘤组织必须依赖从新生血管中获取营养和排泄代谢产物。因此，以新生血管为靶点，抑制肝癌血管生成，切断肝癌和转移的"命脉"，对肿瘤进行生物基因治疗己成为近几年新的研究热点；它与传统的以肿瘤细胞为靶点的治疗手段相比，具有广谱、放大的抗肿瘤作用，且毒副作用小，不易产生耐药性的特点。中期因子(Midkine，MK)是一个新发现的促血管生成因子，其基因最初是在视黄酸(retinoicacid,RA)诱导分化早期的胚胎瘤细胞中被发现的，定位于染色体llq11.2，由5个外显子和4个内含子组成，故又称视黄酸反应性肝素结合性生长/分化因子。它是一种具有促细胞转化、促有丝分裂作用、促血管生成、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等肿瘤形成相关活性的碱性肝素结合性蛋白质，仅在胚胎中期和成年肾脏表达。已有的研究表明，MK能促进内皮细胞分化，对人脑与脐静脉内皮细胞、PC12细胞、神经外胚层前体细胞和NIH3T3成纤维细胞具有有丝分裂原活性。在软琼脂培养中，MK能促进SW13细胞克隆形成，而将经MK转染的SW13细胞和NIH3T3细胞接种无胸腺裸鼠，则能形成富含血管的肿瘤。在肝癌等许多人类恶性肿瘤组织中MKmRNA及蛋白均呈高度表达，而各种正常组织仅有低水平表达或无表达，并与肝癌的发生、浸润转移，血管生成及预后密切相关。因此，MK可能是抗血管生成治疗肝癌的理想靶位。近年来的研究表明，一些小的双链RNA(dsRNA)可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。其作用机制主要通过dsRNA被核酸酶切割成2125nt的干扰性小RNA片段即siRNA，由siRNA介导识别并耙向切割同源性靶mRNA分子而实现。在哺乳动物细胞中用siRNA能高效阻断某个特定基因的表达，利用siRNA表达载体，无需像反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期，并能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使目标基因表达降到极低水平甚至完全"剔除"，从而产生缺失突变体表型，而且比基因敲除技术更快更简单。该技术可介导哺乳动物细胞特异性基因沉默，可能成为关闭基因的有效手段。在基因功能、基因治疗方面已显示出巨大的应用前景，并且有潜在的药物研究和开发价值。
发明内容本发明的目的是提供对肝癌肿瘤血管生成促进因子MK基因具有较好抑制活性的小干扰RNA序列及其化学修饰衍生物，为研发特异高效的新型抗肝癌血管生成基因治疗的新药提供基础。本发明采用的技术方案是中期因子基因为靶的小干扰RNA,其特征在于所述小干扰RNA的核苷酸序列为正义链5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3，，反义链5,-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3'。所述小干扰RNA序列，是根据GenBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的MidkinemRNA参考序列(GenBank序列号24475622)，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，根据Ambion公司的设计工具软件进行设计得到。通过与GenBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达，其中前述序列筛选得到的为最佳序列，其作用于人MKmRNA的第282-302位，3号外显子，该序列能特异性抑制人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞的生长及肝癌肿瘤血管生成促进因子基因MK的表达，具有成为用于抑制MK高表达的肝癌细胞生长及与新生血管形成相关疾病的新型生物工程药物的潜力。所述小干扰RNA的核苷酸序列3'端可有26个dT或T修饰。优选的，所述小干扰RNA的核苷酸序列3'端有2个dT或T修饰。优选的，所述小干扰RNA的核苷酸序列为正义链5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUCtt-3，，反义链5'-GAAACCCACGCCGCAAUCCtt-3'。本发明还涉及所述的中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抗肿瘤药物中的应用。包括有效成分的本发明的反义寡核苷酸或其修饰物以及药物学可以接受的载体的药物组合物，本发明的药物组合物能用于抑制高表达MK的肝癌等恶性肿瘤细胞的生长及与新生血管形成相关的疾病。具体的，是所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制高表达MK的恶性肿瘤细胞生长的药物中的应用。更为具体的，是所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制肝癌细胞生长的药物中的应用。或者，是所述中期因子基因为靶的小干扰RNA在制备抑制高表达MK的恶性肿瘤新生血管生成的药物中的应用。更为具体的，是所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制的肝癌新生血管生成的药物中的应用。所述的中期因子基因为靶的小干扰RNA还可应用于制备预防和治疗新生血管异常增生的药物。本发明还涉及含有所述中期因子基因为靶的小干扰RNA的载体。基于所述中期因子基因为靶的小干扰RNA的特性，所述载体也同样具有上述用途。本发明的有益效果主要体现在提供了特异性抑制人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞的生长及肝癌肿瘤血管生成促进因子基因MK的表达的siRNA序列，为新药研发提供了基础。图1为MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、匿6转染HepG2后12，24，48，72h时间点的MKmRNA表达水平统计结果。图2为MK2转染HepG2细胞后MK蛋白的表达水平；1、2、3、4分别代表MK2浓度5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L和对照组。图3为MK2转染HepG2细胞后对细胞增殖的影响。图4为MK2插入pRNAT-U6.1/Neo的载体图谱。图5为MK2-shRNA重组表达质粒插入序列的测序图谱。图6为MK2-shRNA转染对HepG2细胞MKmRNA和蛋白表达的影响；图中1、2、3、4依次代表对照组、MK2-shRNA浓度5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L组。图7为MK2-shRNA转染对HepG2/HUVEC细胞增殖的影响。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例l:耙向MK基因的小干扰序列的设计和筛选1、靶向MK基因小分子干扰序列的设计与合成检索GenBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的MidkineraRNA参考序列(GenBank序列号24475622)，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，根据Ambion公司的工具软件设计了6对SiRNA。通过与GenBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。6对SiRNA序列由上海吉玛公司合成，用150ul的DEPC水稀释，浓度为20pmol/ul，于-20。C保存。合成的6对SiRNA序列见表l。表l:依据Ambion公司设计软件设计合成的siRNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、耙向MK基因小分子序列的筛选细胞所用试剂人HepG2肝癌细胞系由中科院上海细胞研究所提供，人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)购自美国CascadeBiolgics公司。细胞用含10%小牛血清及100U/ml青霉素，100pg/ml链霉素的DMEM培养基，置37'C、5%C02孵箱培养。PCR相关试剂(Taq酶、逆转录酶、dNTP、OligdT等)；限制性内切酶BamHI、HindIII(TAKARA);T4DNA连接酶(invitrogen);琼脂糖凝胶回收试剂盒；氨节青霉素(sigma);G418(GIBCO);Trizol〔invitrogen);MMLV(promage)、RPMI1640(GIBCO);胎牛血清(GIBCO);MK抗体(自制)；donkeyanti-rabbit(sc-2317，SANTACRUZ);CellLysis;SupersignalWestFemtokit;PMSF;定影液；显影液仪器材料低温高速离心机(Biofbge28RS)，恒温水浴箱(ModelDK-8D);C02细胞培养箱(MCO-17AC);倒置显微镜(XDS-1A);光学显微镜；细胞超净台(ESCD);6孔细胞培养板，荧光定量PCR仪FTC2000;酶标仪；电泳槽；转膜仪；电泳仪；转膜槽；磁力搅拌器；脱色摇床；WS-III型卡片式暗盒；凝胶图象分析系统BioSenSC300。实验方法细胞培养和转染方法肝癌细胞株HepG2或HUVEC细胞培养于含10%小牛血清的RPMI1640中，生长呈对数期状态备用。细胞接种于6孔细胞培养板中。培养过夜后，用01igofectamine2000转染剂将SiRNA导入细胞。在1.5ml的eppendorf管中将7.5ul的oligofectamine加入10.5ul的RPMI1640中，混匀室温放置5~10分钟，分别将一定量的6种SiRNA加入到RPMI1640至体积102ul，再混合两种溶液，室温放置20分钟；弃尽细胞孔的培养基，加入480ul含10X小牛血清的RPMI1640，然后加入制备好的上述转染试剂，空白组仅用转染试剂，一式三份，混匀，置细胞培养箱中。RNA提取用Trizol试剂提取总RNA。弃尽培养液后，每孔加入0.5ml的Trizol试剂，反复吹打，转移至1.5ml的eppendorf管中，加入0.2倍体积的氯仿，振荡混匀15秒，室温放置5分钟后,4'C条件下15000g离心15分钟，吸上清至另一eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置10分钟，4。C条件下15000g离心10分钟，弃上清，沉淀加75%乙醇，7500g离心5分钟洗涤，次，室温放置10分钟左右，加入10ul的0.1。/。DEPC水溶解，260nm测光密度，用40ug/ml/OD计算RNA浓度，然后用0.1%DEPC水调节浓度至200ng/ul，-20°C保存备用。RT-PCR检测MKmRNA方法cDNA合成用Invetrogen公司所提供的SuperscripTM逆转录试剂盒进行，其过程简述如下取10ul上述RNA，加入lul的50uMligodT，7(TC变性10分钟，立即置冰上2分钟，离心。然后加入9ul混合试剂4ul5X1Strandbufer、2ul0.1MDTT、MdN(A,T，C,G)TP、lulRNaseinhibitor、0.5ulSSTR2、0.5ul1%DEPC水，在42°C水浴52分钟，然后7(TC水浴15分钟终止反应，再加入水80ul，置冰箱保存。实时定量PCR方法50ul反应体系中含有MK基因上游引物(5，-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3，)、下游引物(5'-CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3')各0.3uM、探针(5，-CCAGGAGACCATCCGCGTCCC-3，)0.2uM;2.5ul20XHmnanGAPDH;25ul2xPCRmastermix(PE公司)；10ul上述cDNA;加水补足体积。然后在定量PCR反应仪7700(PE公司)进行，反应条件为5(TC预变性2分钟；95"C变性10分钟；95'C变性30秒；6(TC退火1分钟，扩增40个循环。然后以内参照GAPDH基因相对定量MK基因表达。WesternBlot检测MK蛋白表达提取孔中培养的HepG2细胞或HUVEC细胞，用预温PBS洗涤一次，加入200^1/孔CellLysis，冰上放置10min，用细胞刮刮下细胞，4。C低温离心U000转/minxlOmin，吸取上清到新鲜Eppendorf管中。用蛋白定量试剂盒定量，取120昭蛋白作电泳并转膜。兔抗MK抗体作为一抗，工作浓度为I:IO，Anti-rabbit为二抗，浓度为1:4000;按以下步骤操作①灌胶10%聚丙烯酰胺凝胶。②样品处理加入6x加样缓冲液，10(TC煮沸5min。③电泳80V电泳45min，150V电泳85min。转膜:转膜前10min将硝酸纤维膜和滤纸浸泡在转膜缓冲液中，恒定电压100V转膜60min。⑤春红染色2min，去离子水漂洗，将Marker条带标记好。⑥用脱脂奶粉阻断，室温阻断23h(或4。C过夜)。⑦加一抗，室温结合2h(或4。C过夜)。⑧TBST洗涤3xl0min。⑨加二抗，室温结合lh。⑩TBST洗涤3xl0min。(11)加底物显色，结合lmin，将膜速封，放入X光片盒。(12)曝光，在暗室中放入X光胶片lmin，使胶片与膜接触曝光。(13)把胶片放入显影液1min，清水漂洗，放入定影液中，透明为止。(14)吹干，分析。MTT法分析细胞生长抑制转染后48小时的细胞的OD值(A4卯).根据公式抑制率-[(A对照一A用药)/A对照]xl00。/。计算出细胞抑制率。再根据抑制率计算半抑制浓度IC50。实验基本操作方法HepG2肝癌细胞或HUVEC细胞经培养至对数生长期，接种至培养板孔中，转染siRNA或shRNA至细胞中，接下来分二方面来操作1、用MTT法来评价转染48h后的siRNA或shRNA对细胞生长的抑制情况；2、提取RNA，用RT-PCR来评价MKmRNA的量，用WesternBlot来评价MK蛋白表达水平，根据图片和结果数据，Bio-rad图像分析系统检测，再与对照组比较分析的出结论。细胞培养、转染、RNA提取、RT-PCR、WesternBlot、MTT在上述已列出，试验中培养基和转染剂及试剂的用量及操作的要求按实验目的和效果来定。6条siRNA抑制HepG2肝癌细胞MK表达的最佳siRNA及时间效应评价HepG2肝癌细胞经培养为对数生长期，接种于6孔培养板中，转染6种相同浓度siRNA后，进行培养，分别在转染后12h、24h、48h、72h四个时间段收集细胞，抽提mRNA。然后经RT-PCR检测MKmRNA的量及对MK的抑制率，与空白载体组对照，Bio-rad图像分析系统检测，从而可以评价哪种siRNA对MK的抑制作用最强，将其筛选出。MK-2siRNA作抑制HepG2肝癌细胞生长情况及剂量效应评价HepG2肝癌细胞经培养为对数生长期，接种于96孔培养板中，转染不同浓度MK-2siRNA后，进行培养，48h后，每孔加入10ul5mg/mL的MTT液，37°C、5。/。C02细胞培养箱孵育4小时，弃去培养液，每孔加入150ulDMSO，37。C振荡10min，使结晶充分溶解，酶标仪在测量波长570nm、参考波长为630nm条件下测量各孔的吸光度OD值。转染后48小时的细胞的OD值(A490).根据公式抑制率呵(A对照一A用药)/A对照]xlO()n/。计算出细胞抑制率。MK-2siRNA抑制MKmRNA和蛋白表达水平情况及剂量效应评价HepG2肝癌细胞经培养为对数生长期，接种于6孔培养板中，转染不同浓度MK-2siRNA后，进行培养，24h后，收集细胞，分别抽提mRNA和蛋白，RT-PCR检测MKmRNA，WesternBlot检测MK蛋白表达。RT-PCR、WesternBlot在前面论述己经列出，同上。结果1.耙向MKmRNA的shRNA的设计与合成根据MKmRNA的计算机模拟二级结构，设计了6条siRNA。根据Ambion公司的设计工具软件设计，上海吉玛公司合成，序列见表l。各用150ul的DEPC水稀释，浓度为20pmol/ul，于-2(TC保存。2.6条SiRNA转染对HepG2细胞MK表达的影响RT-PCR法检测MK1、MK2、MK3、Mk4、MK5、MK6转染HepG2细胞后，转染后不同时间点HepG2细胞中MK的表达水平，统计如下，与对照组相比，MK1、MK2、MK3、Mk4、MK5、MK6分别不同程度的抑制了HepG2细胞MK基因的表达，其中MK2在同一时间点抑制效率均高于MK1、MK3、Mk4、MK5、MK6的抑制水平，且在转染后24h检测点的抑制水平达到9615/。(图1)。进一步转染不同浓度的MK2siRNA入HepG2细胞，检测转染后24hHepG2细胞MKmRNA和MK蛋白的表达水平。故筛出MK2-siRNA进行进一步的实验研究。结果显示，MK2-siRNA转染24h对MKmRNA的抑制率为5nmol/L的抑制率为42.5%,50nmol/L的抑制率为96%,500nmol/L的抑制率为99%;故釆用50nmol/L的转染工作浓度进行进一步的实验研究。3.MTT法检测MK2-SiRNA转染对HepG2细胞生长的影响转染48小时后，不同浓度的MK2-SiRNA均有效抑制HepG2细胞的增殖，且具有剂量依赖效应。这与不同浓度的MK2-SiRNA转染后对MK蛋白的抑制水平基本保持平衡，两者具有很好的相关性。结果统计见图3。实施例2:MK2-siRNA重组表达质粒的构建及其活性验证1.构建重组质粒载体MK2-shRNA:取上述抑制效率最高的MK2-SiRNA构建shRNA，选择的载体为美国genscript公司的pRNAT-U6.1/Neo，U6启动子下游作表达的两个酶切位点分别为BamHI禾BHindIII，构建MK2-shRNA重组表达质粒。先化学合成R7-l:5'-gatcccGGATTGCGGCGTGGGTTTCttgatatccgGAAACCCACGCCGCAATCCttttttccaaa-3，禾tlR7-2:5，-agcttttggaaaaaaGGATTGCGGCGTGGGTTTCcggatatcaaGAAACCCACGCCGCAATCCgg-3，，两条单链复性成双链，将目的片段与载体PRNAT-U6.1/neo分别用BamHI和HindIII进行双酶切，并用凝胶回收试剂盒回收。酶切后，载体和片段用T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化到DH5(x巾，涂于氨苄阳性板中，挑取阳性克隆并增菌，抽提质粒进行鉴定。用测序法测序基因序列准确性，测序序列Forward:5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3'。2.MK2-shRNA转染到HepG2细胞，检测MK抑制情况HepG2肝癌细胞经培养为对数生长期，接种于6孔培养板中，将shRNA转染到细胞中，同时设立空质粒组和脂质体组，进行培养，用RT-PCR检测MKmRNA表达。转染MK2-shRNA(分三组，浓度分别为5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L)后，继续培养24h收集细胞，抽提mRNA和蛋白，RT-PCR和WesternBlot具体操作同上。3.MTT法检测MK2-shRNA转染对HepG2/HUVEC细胞增殖的影响HepG2/HUVEC细胞处于对数生长期，接种96孔板，培养过夜，转染MK2-shRNA(5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L)，转染后48h，MTT法检测细胞增殖水平，方法同上。结果1.构建MK2的重组表达质粒取上述抑制效率最高的MK-2构建shRNA，选择的载体为genscript的pRNAT-U6.1/Neo，U6启动子下游作表达的两个酶切位点分别为Bamffl和HindIII。先化学合成R7-l:5'-gatcccGGATTGCGGCGTGGGTTTCttgatatccgGAAACCCACGCCGCAATCCttttttccaaa-3，禾tlR7-2:5，-agcttttggaaaaaaGGATTGCGGCGTGGGTTTCcggatatcaaGAAACCCACGCCG-CAATCCgg-3'，两条单链复性成双链，将目的片段与载体PRNAT-U6.1/neo分别用BamHI和HindIII进行双酶切，并用凝胶回收试剂盒回收。酶切后，载体和片段用T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化到DH5a中，涂于氨苄阳性板中，挑取阳性克隆并增菌，抽提质粒进行鉴定。载体质粒图谱见图4。用测序法测序基因序列准确性，测序序列Forward:5，-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3，。序列分析软件分析结果显示，所插入序列与目的序列MK2-SiRNA同源性100n/n，测序结果见图5。2.RT-PCR和western-blot法检测MK2-shRNA转染对HepG2细胞MKmRNA和蛋白表达的影响MK2-shRNA转染24小时后，收集细胞提RNA和总蛋白，供RT-PCR和western-blot实验。检测结果表明，MK2-shRNA转染有效抑制HepG2细胞MKmRNA和蛋白的表达，并具有剂量依赖效应，结果见图6。3.MTT法检测MK2-shRNA转染对HepG2/HUVEC细胞增殖的影响MK2-shRNA转染48小时后，不同浓度的MK2-shRNA均有效抑制HepG2/HUVEC细胞的增殖，且具有剂量依赖效应。这与不同浓度的MK2-shRNA转染后对MKmRNA和蛋白表达的抑制水平基本一致，两者具有很好的相关性。结果统计见图7。序列表.ST25.UtSEQUENCELISTING<110〉湖州中心医院<120>中期因子基因为靶的小千扰RNA、载体及其应用<130><160〉18<170〉Patentlnversion3.2<210〉1<211>19<212〉RNA<213〉Unknown〈220〉<223>人工序列<400〉1cugg卿卿gaguuuggei<210>2<211>19〈212>腿<213>Unknown〈220〉〈223〉人工序列〈400〉2uccaaacuccuucuuccag19〈210〉3<211〉19<212>廳<213〉Unknown<220>〈223〉人工序列<400〉3ggauugcggcguggguuuc<210〉4<211>19〈212〉RNA<213〉Unknown<220><223〉人工序列<400>4gaaacccacgccgcaaucc19<210>5〈211>19<212〉RNA<213>Unknown〈220〉<223>人工序列<400〉5guacaaguuugagaacugg19<210>6<211〉19<212>RNA序列表.ST25.txt<213>Unknown<220〉<223>人工序列<400>6ccaguucuc3aacuuguac19<210>7<211>19<212〉RNA〈213〉Unknown<220><223>人工序列<400>7g83ggcgcgcuacaaugcu19<210>8<211>19<212>腿<213>Unknown<220><223>人工序列〈400>8agc肌uguagcgcgccuuc19<210>9<211〉19<212>舰<213>Unknown<220><223〉人工序列<400>9gacca肌gcaaaggccaaa19〈210>10<211>19<212〉RNA<213〉Unknown〈220〉<223>人工序列<400>10uuuggccuuugcuuugguc19<210〉11<211〉19〈212>RNA<213>Unknown<220><223〉人工序列<400〉11sggcca33gcC33gaaagg19<210〉12<211>19<212>RNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400〉12ccuuucuuggcuuuggccu序列表.ST25.txt19<210><211〉〈212〉〈213〉1319DNAUnknown<220〉<223〉人工序列<400>13gcgcgctacaatgctcagt19<210><211〉<212〉<213>1420■Unknown<220〉<223〉人工序列<400〉14cccttccctttcttggcttt20<210>15<211〉21<212>醒〈213>Unknown<220>〈223〉人工序列<400>15ccaggagaccatccgcgtccc21〈210〉16<211>65<212〉DNA<213〉Unknown<220><223>人工序列<400>16gatcccggattgcggcgtgggtttcttgatatccggaaacccacgccgcaatcctttttt60cca犯65<210〉17〈211>65<212>DNA<213>Unknown<220><223〉人工序列<400>17agcttttggaaaaaaggattgcggcgtgggtttccggatatcaag站acccacgccgcaa60tccgg65<210>18〈211〉23〈212〉隱<213>Unknown序列表.ST25.txt<220><223>人工序列<400>18tacg8tacaaggctgtt3gagsg2权利要求1、中期因子基因为靶的小干扰RNA，其特征在于所述小干扰RNA的核苷酸序列为正义链5’-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3’，反义链5’-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3’。2、如权利要求1所述的中期因子基因为靶的小干扰RNA，其特征在于所述小干扰RNA的核苷酸序列3'端有26个dT修饰。3、如权利要求2所述中期因子基因为靶的小干扰RNA，其特征在于所述小干扰RNA的核苷酸序列3'端有2个dT修饰。4、权利要求13之一所述的中期因子基因为靶的小干扰RNA在制备抗肿瘤药物中的应用。5、如权利要求3所述的应用，其特征在于所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制高表达MK的恶性肿瘤细胞生长的药物中的应用。6、如权利要求4所述的应用，其特征在于所述中期因子基因为靶的小十扰RNA在制备抑制肝癌细胞生长的药物中的应用。7、如权利要求3所述的应用，其特征在于所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制高表达MK的恶性肿瘤新生血管生成的药物中的应用。8、如权利要求7所述的应用，其特征在于所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制的肝癌新生血管生成的药物中的应用。9、权利要求13之一所述的中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备预防和治疗新生血管异常增生的药物中的应用。10、含有如权利要求1或2所述中期因子基因为靶的小干扰RNA的载体。全文摘要本发明提供了中期因子基因为靶的小干扰RNA，所述小干扰RNA的核苷酸序列为正义链5’-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3’，反义链5’-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3’。本发明的有益效果主要体现在提供了特异性抑制人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞的生长及肝癌肿瘤血管生成促进因子基因MK的表达的siRNA序列，为新药研发提供了基础。文档编号C12N15/11GK101407810SQ20081005936公开日2009年4月15日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者行姚,戴利成,杨水新,翔王申请人:湖州市中心医院