专利名称：：利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体的制备方法。
背景技术：
：为满足农产品不断增长的需求，从1980年至1999年，我国化肥的总用量，增长了约2.3倍，平均年增加150万吨，而粮食总产量却没有相应增幅；由于大量和不合理施用化肥，使其中的氮素化肥的损失率高达15%-35%，资金和能源被大量浪费，有的地区地下水也被污染，环保的问题越来越多。现在，我国政府下决心治理生态环境，保证经济可持续发展，其中重要的一环就是要大力开发推广生物有机肥。生物有机肥是一种全新概念的肥料，它以微生物、土壤、有机物、农作物和生态环境为研究对象，根据它们之间的相互关系，采用生物发酵技术与现代肥料生产工艺相结合，研制开发出具有沃土、环保、肥效高、作物优质高产等特殊功效的新型肥料。生物有机肥主要含有腐植质和有益微生物，具有表面活性、吸附性强、离子交换的点位多、对矿质养分络合作用等优良的特点；随着生物技术的发展和高新技术的渗透，生物有机肥料在产品质量、应用效果和科技含量上均有了较大幅度的提升；而我国广大地域有机物资源非常丰富，大力开发生物有机肥料新品种、新产品，将对生产绿色食品、有机食品、促进生态农业和生态环境建设、改良土壤、节水灌溉等方面发挥重要的作用。在我国的南部地区，适宜种植甘蔗的几省(区)成为我国蔗糖的主要生产地，蔗糖业也成为支柱行业之一。随着蔗糖业的扩大，制糖业的三废尤其是滤泥污染越来越突出；为解决污染问题，已出现了不少效果较明显的技术。但由于不同的地方有不同的环境和条件，且不同的治理方案也有不同的优缺点，申请人有志于在利用本地特有资源进行微生物发酵生产生物有机肥方面找出一种效果显著的技术。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体配方。本发明以如下技术方案解决上述技术问题利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体配方酵母菌类30%-35%，霉菌类30%-35%，芽孢杆菌类30%-40%。酵母菌类主要有酿酒酵母、热地假丝酵母。霉菌主要有泾阳链霉菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、白地霉、嗜热侧孢霉。芽孢杆菌主要有蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌。还可以用圆褐固氮菌。本发明的发酵生产生物有机肥的菌体，发酵时升温快，有机废弃物分解迅速，生产出的生物有机肥质量稳定，而且为综合利用蔗糖滤泥、变废为宝提供了一种非常见效的方法。具体实施方式，本发明利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥菌体，要求选育的菌株必须是对营养条件的要求简单，不管是自养型或异养型，都能利用其周围碳、氮源和光能，分解菌体周围的物质合成自身，这个分解过程全部依靠细菌本身产生的活性酶的作用。经多年试验，本发明的生物有机肥菌体主要从以下菌类中选用酵母菌包括酿酒酵母、热地假丝酵母；霉菌包括泾阳链霉菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、白地霉、嗜热侧孢霉；芽孢杆菌包括蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌；还有圆褐固氮菌。菌剂的生产配方为-酵母菌类30°/。-35%，霉菌类30%_35%，芽孢杆菌类30%-40%。还可以加入圆褐固氮菌。本发明选育出的菌种分别有如下特性酿酒酵母繁殖能力强，抑制杂菌生长，保证发酵连续性；主发酵迅猛，耗糖速度快，縮短发酵时间；发酵充分。泾阳链霉菌菌落的正面为淡红到粉红色，背面为木瓜黄到虎皮簧,孢子丝直或大螺旋形，孢子表面光滑，个别孢子表面带刺。霉菌在培育过程产生的细胞分裂素菌株，作为菌肥开发应用在大ffl实验表明有刺激作物生K:、抑制病害的作用。绿色木霉是一株具有生防潜力的拮抗菌。研究发现菌株在基本培养基上生长最快，温度和pH值对菌丝生长和孢子产生影响显著，光照可促进孢子产生，微量元素对菌丝生长有一定促进作用,Mn有利于孢子产生。米曲霉在培养基组成为麸皮葡萄糖水=9:1:5的条件下，接种3ml孢子菌悬液，28'C培养72h时酶活最高。黑曲霉分生孢子穗黑色、褐黑色或紫褐色，也会发生浅色的突变系，一般大而呈球形，有时不发达；分生孢子梗光滑，无色或上部的1/3带黄褐色；顶囊大的呈球形，小的仅稍膨大，全部产生小梗；小梗单层或双层；分生孢子粗糙，常具褐黑色的条纹。有些株系产生菌核。白地霉属真菌菌落平面扩散，组织轻软，乳白色。菌丝生长到-定阶段时，断裂成圆柱状的裂生孢子。嗜热侧孢霉所用菌株中嗜热侧孢霉具有最高的木聚糖酶活性(164.4U/g)，木霉具有最高的纤维素酶活性和CMC酶活性(分别为12.1和77.2U/g),同时曲霉和嗜热侧孢霉也具有较高的纤维素酶活性和CMC酶活性,所用曲霉和嗜热侧孢霉一样，适合作纤维降解的微生物。热地假丝酵母菌落表面光滑、湿润和黏稠，与某些细菌的菌落相似，但一般比细菌的菌落大而厚。酵母菌细胞生长在培养基的表面，菌体容易挑起。有些酵母菌表面是干燥粉状的，有些种培养时间长了，菌落呈皱縮状，还有些种可以形成同心环状等。蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链。该菌在不利环境条件下能以孢子形式存在，耐高温(ioo'c)、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化，能经受颗粒肥料加工的影响，满足肥料加工的要求。在储藏过程以孢子形式存在，处于休眠期，不消耗肥料的营养成分，不影响肥料品质，使肥料的质量得到保证。蜡状芽孢杆菌能够产生多种酶类(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)及营养物质(如多种氨基酸和维生素类物质)。巨大芽孢杆菌该菌株对多种农作物有害真菌有强烈的拮抗作用，抑菌物质是该菌分泌的一种蛋白质，田间试验结果表明抑菌谱显示,对作物立枯病菌、纹枯病菌、全蚀病菌、茄假单孢杆菌、枯萎病菌、黄萎病菌、白叶枯病菌、根瘤镰刀病菌都有较强的抑制作用.圆褐固氮菌是固氮菌属中的一个种，革兰氏阴性杆菌，细胞呈大卵圆形，大小2微米X5微米，常成对，周生鞭毛运动，不形成芽孢，但能形成厚壁的孢囊和荚膜粘液。不产生水溶性的色素，但在琼脂培养基上的生长物具有特征性的非水溶性的褐色色素，有些菌株的这种色素时间长会变成黒色。细胞内含有许多颗粒体，菌体外面有荚膜。需要注意的是，圆褐固氮菌的菌休形态多变，幼龄时为杆状，细胞单独存在或两个联接呈"8"字形，老龄细胞缩短，呈椭圆形或圆形。不同的圆褐固氮菌菌株固氮作用有明显差异，低的菌株利用l克葡萄糖仅能固定氮素5毫克，最高的可达20毫克。胶冻样芽孢杆菌对胶冻样芽孢杆菌的发酵培养基进行了优化。结果表明胶冻样芽孢杆菌(B.raucilaginosus)生长的最适培养基(g/L)为庶糖14、Na2HP041.5、FeCl30.002、CaC(U.5、酵母膏1(3，自来水1000ml、pH7.0-7.5;有机氮和无机铵态氮抑制胶冻样芽孢杆菌的生长；胶冻样芽孢杆菌液体培养物对作物苗期生长具有促进作用。沼泽红假单胞菌菌株最适生长温度为25—30。C、光照强度为1500—30001x，适当添加酵母膏有利于菌体繁殖。属于光合细菌的一种，光合细菌简称PSB，是地球上最古老的菌种之一，PSB菌体营养丰富，蛋白质含量高达65%，且富含多种维生素、辅酶等生物活性物质和微量元素，适应性强，能忍耐高深度的有机废水和较强的分解转化能力，对酚、氰等毒物有一定忍受和分解能力。在决定配方的试验过程中，申请人还进行了以下实验1.诱导实验每个菌株都有它不同的作用，有由小到大作用的过程，这个过程是人为诱导产生的。实验结果表明，同一个属的细菌性质、特点基本相同，所不同的是有可以诱导与不能诱导之分。如果一个菌株经过条件诱导、营养诱导或药物等其它诱导，使它原来有害的部分消失，但抗原性不多，经过一年多的诱导实验，原选育的菌种通过诱导实验，选育训化的菌株的性状均表现为比原菌种好，这就为充分发挥菌种的最大作用奠定基础。2、组合菌的毒性实验选育、诱导后的配伍菌必须对人、畜和植物均无毒害。为此需要作毒性实验，本项目在利达公司进行小白鼠的实验，采用一次性口服、间歇式口服和皮下腹腔注射等处理，经过多次实验证实所选育和诱导的菌株无毒害作用。3、配伍菌株互作效应实验目的是了解菌株是共生菌、互生菌抑或桔抗等关系。实验结果表明，选育和诱导的菌株具有共生、互生的特征，因此，不仅选育的菌株可在同一个培养基上生长，且在菌株繁殖过程中还有促进作用。4、菌株杂交观察防止选用菌种的杂交、特别是防止诱导后菌株的变异，是确保建立发酵工程的基础；为了确保菌种的不变异，本项目在实施过程中拟定的措施有①在菌种保存过程中，干燥菌株不超过5年必须重新鉴定，并重新干燥保存；使用菌株在4'C保存下不能超过3个月，已超过3个月的菌株必须重新转种。②用于生产上的菌种要经过2-3次复壮，在复壮中纯化标准菌体，用标准菌体再扩大生产，保持它的优良特性。③菌种保存有时必须用菌种原有培养基，而生产时则采用新的培养基，不能混合使用；因为，生产用培养基是以快生、快长为主要目的；而菌种保存培养基是以固定、稳定菌种特性为目的。在菌剂的生产过程中，菌体配方选用13株功能各异的菌种，如芽肥菌、丝状真菌、放线菌等，虽然这些菌各自培养时间有些差异，但它们对营养要求、温度、水份都基本相近，这样菌剂载体配制较为简单，并便于规模生产。菌剂的生产过程是①菌种的接种，在无菌条件下操作，将经冰箱的纯化后菌种，接种到已准备好的培养基上；此后生产出的菌株为一级种子。②摇床扩增，将一级种子接种到容量为2000毫升三角瓶内，培养扩增菌数，约需培养3天，此时培养出的菌株为二级种子。③菌粉收获，菌粉载体由于含蛋白质高，并富含纤素和矿物质，将这些基质粉碎并按一定比例混合组成；接上菌种后5天，菌体大量繁殖，每克载体含活菌数超过50亿个(15个株目的菌的总数)，此时，经过脱水后包装即得"菌曲剂"。堆腐酵解是获得生物有机肥的菌体(亦即菌曲或菌剂)后制备生物有机肥的重要环节，在堆腐酵解中，菌体在有机质中发酵，产生的微生物的衍生物及代谢产物主要有三类一类是酶，如纤维素酶群、蛋白酶群、氧化酶、糖化酶、水解酶、酰化氨基酸酶等；酶是一种蛋白质，具有专一性，如纤维的分解必须有纤维素酶，由三组水溶性纤维素酶(纤维素内切酶、溶解酶和纤维二糖酶)协同作用才能把一个葡萄糖长链切开；蛋白酶能把大分子的蛋白质分解切割成碎片，如碱、胨、肽或腙等结构，再进一步分解成氨基酸。第二类是有机酸，如腐植酸，吲哚乙酸、赤霉乙酸和柠檬酸；有机酸是由碳素循环而得到的产物，如腐植酸、乙酸、柠檬酸等，这些有机酸的存在，有利于作物根系对矿质养分的吸收。还有一类是生物素，如赤霉素和各种抗生素，酮类。以下是将得到的生物有机肥的菌体置入以蔗糖滤泥为主的有机物中进行堆腐酵解制备生物有机肥的方法根据本菌曲(剂)有氧发酵的需要，将以蔗糖滤泥为主的有机物堆成3-5米宽，1.5-1.8米高，长度根据物料和场地情况而定的条形；堆沤3-4天温度可达到5(TC以上，并能保持55-7CTC的温度10-15天，有用的微生物的代谢产物都在这个阶段产生。试验表明当有机废弃物(糖厂滤泥)占85%-95%、统糠占5%-15%、组配的菌曲3-6公斤/吨、在夏季(或冬季)进行堆腐酵解制备生物有机肥时，第一天总体的温度变化为28—35。C(冬季15—26。C)，第三天为51—55。C(冬季35—46。C)，第五天为68—69。C(冬季65—68°C)，之后变化不大，第十天为61—65'C(冬季66—69'C),第十天无论是夏季还是冬季，堆体的温度都开始下降，第十三天夏季55—59'C(冬季58—60'C),第十六天为49—53°C(冬季45—5(TC),堆腐酵解基本完成。发酵生产生物有机肥的养分含量<image>imageseeoriginaldocumentpage7</image>实施例1夏季堆腐酵解有机废弃物制备生物有机肥菌曲的配方是酵母菌类30%，霉菌类35%，芽孢杆菌类35%。有机废弃物中，糖厂滤泥占95%,统糠5%,菌曲6公斤/吨，配料过程中另加入圆褐固氮菌1公斤/吨。堆腐酵解的第一天堆温为28—33。C,第三天50—53。C,第六天68—69°C，之后堆温较稳定；第十天为61—65'C，之后堆温下降，第十六天为49_53°C，堆腐酵解基本完成。发酵生产生物有机肥的养分含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2冬季堆腐酵解有机废弃物制备生物有机肥菌曲的配方是酵母菌类35%，霉菌类33%，芽孢杆菌类32%。有机废弃物中，糖厂滤泥占90%,统糠10%,菌曲4.5公斤/吨，配料过程中另加入圆褐固氮菌2公斤/吨。堆腐酵解的第一天堆温为15—22。C，第三天34—43。C，第六天65—68°C，之后堆温较稳定；至第十天为66—69°C，之后堆温下降，第十六天为45—5(TC，堆腐酵解基本完成。发酵生产生物有机肥的养分含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3冬季堆腐酵解有机废弃物制备生物有机肥菌曲的配方是酵母菌类32%，霉菌类30%，芽孢杆菌类38%。有机废弃物中，糖厂滤泥占85%,统糠15%,菌曲3公斤/吨，配料过程中另加入圆褐固氮菌2.5公斤/吨。堆腐酵解的第一天堆温为15—26。C，第三天35—46。C，第六天65—68°C，之后堆温较稳定；至第十天为66—69'C，之后堆温下降，第十六天为45—5(TC,堆腐酵解基本完成。发酵生产生物有机肥的养分含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1.一种利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体，其特征是菌体的各成份重量百分比为酵母菌类30％-35％，霉菌类30％-35％，芽孢杆菌类30％-40％。2.如权利要求1所述的利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体，其特征是酵母菌类的菌株有酿酒酵母、热地假丝酵母。3.如权利要求1所述的利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体，其特征是霉菌类的菌株有泾阳链霉菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、白地霉、嗜热侧孢霉。4.如权利要求1所述的利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体，其特征是芽孢杆菌有蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌。5.如权利要求1或2或3或4所述的利用蔗糖滤泥发酵生产生物有机肥的菌体，其特征是加入圆褐固氮菌。全文摘要一种以蔗糖滤泥为主发酵生产生物有机肥的菌体，其特征是菌体的各成份重量百分比为酵母菌类30％-35％，霉菌类30％-35％，芽孢杆菌类30％-40％。使用本发明的发酵生产生物有机肥的菌体，发酵时升温快，有机废弃物糖厂滤泥分解迅速，生产出的生物有机肥质量稳定。文档编号C12N1/20GK101255402SQ20081007352公开日2008年9月3日申请日期2008年4月7日优先权日2008年4月7日发明者谭宏伟申请人:谭宏伟