专利名称：筛查牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛査牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒。
技术背景荷斯坦奶牛是当前世界各国广泛使用的奶牛品种，经高度的选育与良好的词养 管理，生产性能不断提高，在人类生活中发挥着越来越重要的作用。近年来，由于 选种选配的不断进行，使奶牛间的近交不断增加，目前世界上大多数荷斯坦牛都可 以追溯到北美几头特别优秀的种公牛。在我国，由于大量进口种牛、胚胎和冷冻精 液，增加了遗传缺陷快速传播的风险，因此需要逐步建立完善的检测及防控体系。遗传缺陷指的是由于生殖细胞或受精卵中的遗传物质发生了结构或功能上的改 变，从而使发育成的个体出现解剖结构上的异常或生理机能上的损害。遗传缺陷可分 为基因突变和染色体畸变两种。而基因突变有异常染色体隐性基因突变居多。目前 发现的奶牛遗传缺陷大多属于这类突变。由于隐性遗传缺陷，即杂合型个体虽带有 一个异常等位基因，但外表看不出来，因此需要借助分子手段进行检测。如两个亲本都是杂合型个体(Aa)(这里以a表示致病基因，A表示正常基因)，那它们的后代就 有l/4的可能出现二个隐性致病基因(aa)纯合的情况，这样的个体通常是致死的，即 使是非致死的遗传缺陷，也会大大影响生产性能。杂合型公牛(Aa)虽然只带有一个a， 但其却是a基因携带者。这种Aa杂合型公牛常会有健壮外观，女儿牛表现优良，导致 a基因在子代、孙代、曾孙代...逐渐传递，经过多代的人工授精，a基因携带者在 群体中所占比例就大大提高，从而导致带有二个隐性致病基因(aa)的个体涌现，给奶 牛业带来损失。尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)是荷斯坦牛群中一种由常染色体单基因突变造成 的隐性遗传疾病，可导致隐性纯合的后代胚胎早期死亡。尿苷酸合酶是一种双功能酶，包括乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRTase)和乳清 酸核苷脱羧酶(ODCase)的活性区域以及它们之间的一段连接肽。连接肽可能对蛋 白质的正确折叠及正常活性起一定作用，因此这一区段的突变可能会降低蛋白质结 构的稳定性，增加温度不稳定性或引起蛋白质水解能力的下降。哺乳动物中，尿苷 酸生物合成的最后两步由尿苷酸合酶(UMPS)催化，使乳清酸转化成尿苷酸。尿苷酸作为一种主要的嘧啶核苷酸，是其它嘧啶核苷酸合成的前体物质。嘧啶 核苷酸是核酸(DNA、 RNA)和几种代谢辅助因子的结构成分，因而对于机体正常的生长发育至关重要。患有尿苷酸合酶缺乏症的奶牛泌乳时，分泌大量的乳清酸到乳汁中，同时奶牛还伴随有泌乳反应诱导的乳清酸尿症和乳清酸血症(J丄.Robinsin， D.B.Dombrowski, G.W.Harpee stad and R.D.Shanks, 1984, Detection and prevalence of UMP synthase deficiency among dairy cattle, The Journal of Heredity, 75:277-280 )。尿苷酸合酶缺陷型奶牛的乳汁中乳清酸浓度异常高，为300—1000pg/ml，而正 常奶牛乳中乳清酸的平均浓度仅为80pg/ml。正常奶牛尿中乳清酸水平通常低于 10|ig/ml，但缺陷型奶牛泌乳时尿中乳清酸含量可达20 — 200(ig/ml。乳清酸的浓度可 以通过比色法进行测定，所以此浓度可作为正常和缺陷型奶牛的判别指标。但由于 只有当奶牛泌乳时，缺陷型奶牛奶中、尿中的乳清酸水平才升高，而且测定误差较 大， 一般并不常用。正常和缺陷型荷斯坦牛相比，乳中乳糖、？L脂、乳蛋白的浓度和血细胞比容差 异不大，而且尿苷酸合酶的动力学常数、对抑制剂的反应、PH值的大小和热不稳定 性也没有明显的差异。此外，核苷酸代谢的其它部分，包括红细胞PRPP浓度、PRPP 合成酶活性、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶等在杂 合牛中不受影响。乳清酸是牛乳中的一种常见成分，个体之间含量差异较大。Robinson等人(1983 年)通过连续5年对250头荷斯坦泌乳奶牛的观测发现，有些奶牛乳中乳清酸的水 平很高，平均超过300iig/ml，而群体的平均值仅为81.8ng/ml。于是他们经过进一步 地研究分析后，得出这些奶牛乳中乳清酸的大量蓄积是由于其体内尿苷酸合酶(Uridine Monophosphate Synthase,简称UMPS)缺陷造成的。尿苷酸合酶催化功能 的降低导致了酶作用底物乳清酸的含量升高。实验室一般以红细胞中尿苷酸合酶的 活性作为动物体内酶活性的衡量指标。根据红细胞中尿苷酸合酶活性的高低，可将 荷斯坦牛群分成两种表型，其中一种表型的牛只占绝大部分，其体内尿苷酸合酶的 活性差不多是第二种表型牛只的两倍。Shanks等人把前一种表型定义为正常型，后 一种表型定义为缺陷型(Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase,简称 DUMPS)，缺陷型的牛只也就是患有尿苷酸合酶缺乏症的个体。另外，Shanks等人 还通过大量的实验和统计分析得出尿苷酸合酶缺乏症的遗传遵循常染色体隐性单 基因的遗传模式，而且缺陷型的个体是杂合的(Nn)，正常型的个体是显性纯合的(NN)。由于牛群中没有发现第三种表型，可以推测隐性纯合的基因型具有致死性。 1989年Shanks等人最终实验证实隐性基因纯合的胚胎在母体妊娠40-60天左右死 亡。尿苷酸合酶基因杂合的荷斯坦牛，体内红细胞、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、乳 腺等组织中尿苷酸合酶的活性只有正常水平的一半。鉴于血样比其它组织更易于采集和操作，实验室在80年代至90年代初通常采用红细胞尿苷酸合酶活性测定的生 化方法，区分基因正常和基因杂合的个体， 一般采用分光光度法(SilvaRF, HatfieldD, 1978, Orotate phosphoribosyltransferase: orotidylate decarboxylase (erythrocyte). Methods Enzymol. 1978;51:143-54)和同位素标记法(M.E.Jones etal.， 1978; 1986 Jones M.E.,Kavipurapu P.R. and Traut T.W.， 1978， Orotate phosphoribsyltransferase: orotidylate decarbozylase(Ehrlich Ascites Cell), Methods Enzymol., 51:155-167)进4亍湖lj 定，而后一种方法使用得较多。它通过测定(7 — "C〕乳清酸转化成尿苷酸过程中 C02的生成量，得到最终结果，以酶的活性单位表示。尿苷酸合酶的活性单位通常 用每毫升反应液在37"C下反应10分或20分钟时所形成产物的微摩尔数表示。由于生化指标的测定常受到生物体、周围环境及测定方法本身的影响，结果的 变动范围较大，测定的准确性很难保证；而且不同年龄性别组尿苷酸合酶的活性差 异很大，所以测定时应配合对照样本的使用，这就使得群体中年龄性别组的合理划 分和组中对照样本的选取相当关键。出于经济效率的考虑，对照样不宜过多，但也 不能太少，否则测定准确性下降，达不到正确分型的目的。如果将正常个体的尿苷酸合酶活性定义为100%,则缺陷型个体中该酶的活性只 有正常水平的50%，而且个体之间存在着差异，其中年龄和性别对尿苷酸合酶活性 的影响较大。Jones等人(1986)指出初生犊牛中该酶的活性比2岁以上的成年牛高 80%，比1岁的青年牛高11%，公牛比同年龄的母牛酶活性高10%。另外，他们还 观察到成年泌乳母牛和非泌乳母牛，初产和经产母牛之间酶活性没有显著的差异。 考虑到这些因素的干扰和尽量保证检测的准确性，Jones等人(1986)给出了正常和 缺陷型个体酶活性的分界值，分界值定义为正常水平的75%左右。成年母牛的分界 值为1.84单位/毫升，接近于先前得出的1.9单位/毫升的分界标准(Robinson J丄.,Dombrowski D.B.,Clark J.H. and Shanks R.D., 1984, Orotate in milk and urine of dairy cows with a partial deficiency of uridine monophosphate synthase, J. Dairy Sci" 67:1024-1029) 。 1987年，Shanks等人又建议将分界值定为正常水平的2/3，即红细 胞中尿苷酸合酶活性在正常水平的33-67%之间时，个体为杂合子；活性低于33%， 为隐性纯合子。但由于不同地区不同牛群自身的特点和环境条件，育种者应结合本 地实际，通过实验得出适合本群的分界值。牛尿苷酸合酶cDNA的开放阅读框编码一个480氨基酸的蛋白质。它具有两种 酶的催化活性，OPRTase和ODCase处于基因的两个不同区段，中间以一条多肽相连。它们分别对应于细菌和真菌中由不同基因编码的单功能蛋白质。1994年Ryan等通过荧光原位杂交(FISH)法将基因定位在牛的第一号染色体 q31区。牛UMPS的氨基酸序列与人的同源性为84%，小鼠UMPS的氨基酸序列与 人的同源性为82%，说明这个蛋白质在哺乳动物中是高度保守的。通过将牛UMPS 基因与人和Dictyosteliumdiscoideum (网柄菌属)的序列进行比较，发现催化活性中 心的可能区域保守性较高(Michel Jacquet et al, 1988, S叫uence analysis of the DdPYR5-6 gene coding for UMP synthase in Dictyostelium discoideum and comparison with orotate phosphoribosyl transferases and OMP decarboxylases, Mol. Gen Genet, 1988: 2U:441-445)，但属于连接肽的中间区域保守性较差。1994年Schober等最早确定了 UMPS基因的基因组结构(B Schwenger，S Schober and D Simon, 1993, DUMPS Cattle Carry a Point Mutation in the Uridine Monophosphate Synthase Gene, Genomics, 16:241-244)。尿苷酸合酶基因大于25kb， 包括6个外显子和5个内含子，，6个外显子分别为156bp， 154 bp， 672 bp， 176 bp, 115 bp和415 bp。密码子405的C/T突变可导致DNA序列上一个Aval酶切位点的 消失，这个点突变位于外显子5中的第55位，所以根据该位点的有无可以进行分型 工作。研究表明该点突变是造成尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)的根本原因。 发明内容本发明的目的是提供一种筛查牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒。 本发明所提供的筛査尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒，包括PCR引物和内切酶Aval;所述PCR引物为核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对。以牛的基因组DNA为模板，用所述核苷酸序列分别为序列表中序列l和序列表中 序列2的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到自UMPS基因外显子5第55位5'端第39 — 133位核苷酸序列(即自GenBank Accession Number为X65065的5'端第1208位至1302 位脱氧核糖核苷酸)。所述试剂盒中还包括琼脂糖凝胶电泳试剂，所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括琼脂 糖、50xTAE和溴化乙啶贮存液；所述50xTAE为每L含有Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pI^8.0)100mL的溶液；所述溴化乙啶贮存液为0.01g/L溴化乙啶溶液。所述试剂盒中，还包括非尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照 和尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照；所述非尿苷酸核酶缺失症 的基因型RFLP检测阳性对照为含有38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液；所述尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照为含有74bp， 38bp, 36bp和21bp的 DNA片段的溶液。所述试剂盒中还包括PCR反应试剂盒。所述PCR反应试剂盒可为市售任意PCR 反应试剂盒，其中，包括DNA聚合酶，PCR缓冲液，dATP， dGTP， dCTP， dTTP等 PCR扩增试剂。具体可为10x扩增缓冲液，4种dNTP混合物，Taq酶(浓度为2xl0617 /L)。用本发明的试剂盒筛查牛尿苷酸核酶缺失症携带者时，可以待测牛的基因组 DNA为模板，利用扩增UMPS基因外显子5的第55位的单碱基突变的5'端第39—133 位核苷酸的PCR引物(核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2的一对PCR引物) 进行PCR扩增，然后按照下述方法进行RFLP分析用内切酶AvaI对PCR产物进行酶 切；酶切产物通过琼脂糖电泳来区分尿苷酸核酶缺失症携带者和非尿苷酸核酶缺失 症携带者。利用核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2的一对PCR引物进行 PCR-RFLP分析，由于21bp的条带太短二看不到，因此在琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰 胺凝胶电泳图谱中，如待测荷斯坦奶牛得到两条带(38bp，36bp)，则该待测荷斯坦 奶牛为非尿苷酸核酶缺失症携带者(DUMPS);如待测荷斯坦奶牛得到三条带，包括 一条74bp的条带(74bp，38bp，36bp)，则该待测荷斯坦奶牛为尿苷酸核酶缺失症携 带者(UMPS)。本发明的筛查荷斯坦奶牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒，以基因组DNA为 基础的检测牛群DUMPS杂合子的方法是利用PCR—RFLP法对荷斯坦牛的基因型进 行直接分型，不受牲畜年龄、性别和基因表达时间等因素的影响，不使用放射性， 不需要采集对照样本，既减少了测定的工作量，又可提高测定的准确性。用其筛査 牛尿苷酸核酶缺失症携带者，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要。
图1为从部分牛血样中提取的DNA 图2为从冻精中提取的DNA 图3为部分牛UMPS基因PCR产物凝胶电泳图 图4为部分个体PCR-RFLP结果(4%琼脂糖凝胶) 图5为部分个体PCR-RFLP结果(12%琼脂糖凝胶)图6为UMPS基因包括405密码子无义突变在内的扩增片段绘制成的等位基因图 谱和酶切位点示意图具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例l、利用筛査牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒的制备及其效果验证一、筛査牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒的制备本发明的筛查牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒，包括PCR反应试剂，琼脂 糖凝胶电泳试剂和酶切试剂。它们的具体组成如下PCR弓I物根据GenBank数据库中牛UMPS基因序列(GenBank Accession Number 为X65125)，在UMPS基因的外显子5的第55位(即GenBank Accession Number为 X65125的自5'端第1247位核苷酸)的点突变两侧(一个AvaI酶切位点的消失)设计 引物，其中，正向引物(引物I)的序列为5' GAACATTCTGAATTTGTGATTGGT3'(序列表中序列i，该引物由上海生工生物公司合成)，反向引物(引物n)的序列为5' GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT 3'(序列表中序列2，该引物由上 海生工生物公司合成)；正、反向引物浓度均为25umol/L。设计引物时，为观察酶切反应是否完全，在一个引物中特意将原序列的碱基C 改成碱基G (GenBank Accession Number为X65125的自5'端第1284位核苷酸)，从 而造成一个新的AvaI酶切位点的出现。该引物可以奶牛基因组为模板扩增得到95bp PCR产物(自GenBank Accession Number为X65125的5'端第1208位至1302位脱氧核糖 核苷酸)。GenBank Accession Number为X65125的自5'端第1247位碱基均为C，基因 型为纯合，即为正常奶牛的基因型，将其命名为AA基因型(UMPS基因纯合基因型)， 该基因型的PCR产物用内切酶AvaI酶切应得到三条带(38bp, 36bp，21bp) ; GenBank AccessionNumber为X65125的自5'端第1247碱基为同时含有C和T，为杂合基因型， 即尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型，将其命名为AB基因型(DUMPS杂合子)， 该基因型的PCR产物用内切酶AvaI酶切应得到四条带(74bp,38bp,36bp,21bp)。将 UMPS基因包括405密码子无义突变在内的扩增片段绘制成等位基因图谱和酶切位点 示意图(如图6所示，图中A表示正常牛基因组扩增片段，B表示尿苷酸核酶缺失症携 带者基因组扩增片段)。TaqDNA聚合酶(2.5U/uL) 、 10xPCR缓冲液(含Mg2。 、 dNTPs (4x2.5mM) 均购自天根生化科技(北京)有限公司，它们的商品目录号分别为ET101-02、 CD111-02。2、 琼脂糖凝胶电泳试剂琼脂糖西班牙分装，北京普博欣生物技术有限公司50xTAE: Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pH=8.0)100mL，加水充分溶解，定容至1L;溴化乙啶贮存液lg溶于100mL蒸馏水中。3、 酶切试剂Aval内切酶(10U/ul)(含酶切缓冲液)，购自北京友谊中银生物工程科技有限责任公司；pBR322/Hael11 Markers购自华美生物工程公司。4、非尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照和尿苷酸核酶缺失 症携带者的基因型RFLP检测阳性对照为了方便筛査对比，用含有38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液作为非尿苷酸核 酶缺失症的基因型RFLP检测阳性对照；用含有74bp, 38bp, 36bp和21bp的DNA片段的 溶液作为尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照。将测序确认的非尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型用步骤1所述的PCR反应试 剂进行扩增，然后用Aval内切酶酶切PCR反应产物得到的溶液，为38bp,36bp和 21bp的DNA片段的溶液，作为非尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性 对照；将测序确认的尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型用步骤1所述的PCR反应试 剂进行扩增，然后用Aval内切酶酶切PCR反应产物得到的溶液，为含有74bp, 38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液，作为尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检 测阳性对照。二、利用步骤一制备的试剂盒筛査尿苷酸核酶缺失症携带者 利用步骤一制备的试剂盒对北京奶牛中心良种场(91头)、北京市南郊杜庆牛 场(82头)、北京市南郊德茂牛场(190头)共363头中国荷斯坦奶牛，乌鲁木齐种 牛场的193头新疆褐牛，以及北京奶牛中心种公牛站的59枚中国荷斯坦公牛冻精进行 了尿苷酸合酶(UMPS)基因PCR-RFLP检测。 1、基因组DNA的提取1) 从血样中提取基因组DNA采用天根生化科技(北京)有限公司的DP318试剂盒提取冻存血样DNA，得到牛基 因组DNA。从600^d冻存血样中一般可提得15吗左右的基因组DNA。每管DNA溶于150pl的 灭菌水中。根据分光光度计测出的OD26o值，可知基因组DNA的浓度约为100ng/W。 将每头牛血样提取的基因组DNA样品，分别取lul进行凝胶电泳，检测基因组DNA的 提取质量，结果如图l所示。图l中M为lkb ladder Marker,泳道l-5为部分牛血样提取 的基因组DNA。2) 从冻精中提取基因组DNA采用天根生化科技(北京)有限公司的DP318试剂盒提取北京市种公牛站的59枚 中国荷斯坦公牛冻精DNA，得到牛基因组DNA。由一枚冻精颗粒(大约0.1ml-0.2ml，约含几千万个精细胞) 一般可提得30吗左右的基因组DNA。每管DNA溶于100)il的灭菌水中。根据分光光度计测出的00260值， 可知基因组DNA的浓度约为300 ng/pl。将每头牛冻精颗粒提取的基因组DNA样品， 分别取lul进行凝胶电泳，检测基因组DNA的提取质量，结果如图2所示。图2中M为 lkb ladder Marker,泳道1-5为部分牛冻精颗粒提取的基因组DNA。2、 PCR扩增以步骤l提取得到的牛基因组基因为模板，用步骤一的步骤1的PCR试剂进行扩增。PCR反应体系总共25pl， 10x扩增缓冲液2.5(1l， 4种dNTP混合物(终浓度为 2.5mmol/L)2[il，引物I (浓度为25pmol/L) 0.5pl，引物II (浓度为25pmol/L) 0.5|^1， 模板DNA (浓度为100ng4iD l|ul， Taq酶(浓度为2xl06U/L) lfil。PCR反应程序:先94。C 5min;然后94。C lmin， 60°C lmin， 72°C 30s，总共35个 循环；最后72'C 7min。对中国荷斯坦母牛、公牛和新疆褐牛的基因组DNA进行PCR扩增，均得到一 条长为95bp的条带，扩增片段位于牛UMPS基因的外显子5中。图3中M为DNA 分子量参照物(pBR322/Hael11 Marker: 587, 540, 504, 458, 434〃267, 234, 213， 192, 184〃124, 123, 109, 89, 80〃64, 57, 51〃21, 18, 11, 8)，其它各泳道为部分牛UMPS基 因的PCR结果。3、 PCR-RFLP检湖UPCR产物的酶切取10pl步骤2获得的PCR产物，加入0.5(il(10U/nl)Aval内切酶， 37t:消化2-3小时，分别用4%琼脂糖凝胶和12.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳同 时对步骤一的步骤4的非尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照和尿 苷酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照进行电泳，作为判别对照。牛UMPS基因PCR产物的Aval酶切结果如图4和图5所示，结果表明在北京 奶牛中心良种场和南郊德茂牛场各发现一头荷斯坦母牛的基因组，PCR产物用内切 酶AvaI酶切得到四条带(74bp,38bp,36bp,21bp)，与尿苷酸核酶缺失症携带者的 基因型RFLP检测阳性对照带型一致，即AB基因型(尿苷酸核酶缺失症携带者)， 其他361头荷斯坦母牛均得到三条带(38bp,36bp,21bp)，非尿苷酸核酶缺失症携 带者的基因型RFLP检测阳性对照带型一致，即AA基因型(非尿苷酸核酶缺失症 携带者基因型)，在荷斯坦公牛和新疆褐牛中只检测到AA基因型，未发现隐性突 变基因的携带者(AB基因型)。携带隐性致死基因的杂合子(AB基因型)在所检测的荷斯坦母牛群中出现的频 率(%)为2x100/363=0.551%。UMPS突变基因(B等位基因)的基因频率(％)为2xl00/(363x2)=0.275%。 图4中M为pBR322/HaeHI Marker,第1-3泳道为UMPS正常基因的纯合子(AA 基因型)，第4泳道为尿苷酸核酶缺失症携带者基因型(AB基因型)，第5泳道为 PCR产物。图5中M为pBR322/Hae111 Marker,第1 、 2泳道为PCR产物，第3泳 道为尿苷酸核酶缺失症携带者基因型(AB基因型)，第4泳道为UMPS正常基因 的纯合子(AA基因型)。 5、序列分析将步骤2扩增得到的奶牛的95bp PCR产物进行序列分析。测序采用PCR产物直接 测序方法，由上海英骏生物技术有限公司完成。结果表明这些95bpPCR产物均是自 GenBank AccessionNumber为X65125的5'端第1208位至1302位脱氧核糖核苷酸；表明 所有AA基因型个体(361头)的UMPS基因的外显子5的第55位(即GenBank Accession Number为X65125的5'端第1247位核苷酸)碱基为C，基因型为纯合，即非尿苷酸核 酶缺失症携带者；所有AB基因型个体(2头)的UMPS基因的外显子5的第55位(GenBank Accession Number为UMPS基因的5'端第1247位核苷酸)位碱基同时含有 C和G，为杂合基因型，即尿苷酸核酶缺失症携带者。该测序结果与PCR-RFLP结果一致，说明PCR-RFLP结果准确。对所有母牛个体 重复进行PCR-RFLP分析，两次实验结果完全一致，证明建立的检测尿苷酸核酶缺失 症携带者的PCR-RFLP试剂盒稳定，结果可靠。序列表〈160>2<210〉1 <211>24 〈212>DNA 〈213〉人工序列<220><223><400>1gaacattctg aatttgtgat tggt 24<210〉 2 〈211> 23 〈212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉<400>2gcttctaact gaactcctcg agt 2权利要求
1、一种筛查牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒，包括PCR引物对和内切酶AvaI；所述PCR引物对为核苷酸序列为序列表中序列1的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对。
2、 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括琼脂糖凝 胶电泳试剂或聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒，所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括琼脂糖、 50xTAE和溴化乙啶贮存液；所述50xTAE为每L含有Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pI^8.0)100mL的溶液；所述溴化乙啶贮存液为0.01g/L溴化乙啶溶液。
3、 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中，还包括非尿苷 酸核酶缺失症携带者的基因型RFLP检测阳性对照和尿苷酸核酶缺失症携带者的基 因型RFLP检测阳性对照；所述非尿苷酸核酶缺失症的基因型RFLP检测阳性对照为含 有38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液；所述尿苷酸核酶缺失症携带者的基因型 RFLP检测阳性对照为含有74bp, 38bp， 36bp和21bp的DNA片段的溶液。
4、 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括PCR反应 试剂盒；所述PCR反应试剂盒包括DNA聚合酶，PCR缓冲液以及dATP， dGTP， dCTP， dTTP的混和物。
5、 根据权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于所述牛为荷斯坦 牛或新疆褐牛。
全文摘要
本发明公开了一种筛查牛尿苷酸核酶缺失症携带者的试剂盒。该试剂盒，包括PCR引物对和内切酶AvaI；所述PCR引物对为核苷酸序列为序列表中序列1的脱氧核苷酸和核苷酸序列为序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对。以基因组DNA为基础的检测牛群DUMPS杂合子的方法是利用PCR-RFLP法对荷斯坦牛的基因型进行直接分型，不受牲畜年龄、性别和基因表达时间等因素的影响，不使用放射性，不需要采集对照样本，既减少了测定的工作量，又可提高测定的准确性。用其筛查牛尿苷酸核酶缺失症携带者，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要。
文档编号C12Q1/68GK101270393SQ20081010206
公开日2008年9月24日 申请日期2008年3月17日 优先权日2008年3月17日
发明者孙东晓, 松 张, 沅 张 申请人:中国农业大学