用于筛选和鉴定低丰度小rna表达谱的新型小rna芯片的制备方法和应用的制作方法

专利名称：用于筛选和鉴定低丰度小rna表达谱的新型小rna芯片的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因芯片技术领域，更具体地涉及一种新型的小RNA的寡核苷酸探针和使用所述寡核苷酸探针制备的小RNA芯片，并且涉及一种能够富集低丰度、低分子量(＜40nt)的小RNA的方法。本发明可以显著提高基因芯片检测细胞/组织中低丰度的小RNA的灵敏度和特异性。本发明的小RNA芯片可用于制备鉴定和比较细胞分化前后小RNA的变化，通过检测小RNA表达谱而鉴定细胞/组织的特异性，以及诊断和评价肿瘤细胞的来源和分化程度的试剂盒。

背景技术：
小RNA，核酸的长度在21-35个核酸碱基之间的非蛋白质编码核酸序列，广泛存在于各种生物体中。目前小RNA至少可以分为六类微核酸(miRNA)，小的非编码核酸(tncRNA)，短的干扰核酸(siRNA)，重复结合的小干扰核酸(rasiRNA)，小的调节核酸(smRNA)以及与Piwi相互作用的核酸(piRNA)[1，2]。在上述六类核酸中miRNA被研究的最为广泛[3]。这些miRNA是从蛋白编码基因的内含子或外显子以及非蛋白编码基因转化而来。目前已有几百个miRNA被克隆并被测序[4，5]。从小RNA发现的历史来看，大多数小RNA是通过实验方法鉴定的[6，7，8]，而且通过使用焦磷酸测序(pyrosequence)技术越来越多的小RNA，包括miRNA，siRNA以及21U-RNA被鉴定出来。虽然克隆和测序是鉴定新的小RNA最常用的方法，但低丰度的小RNA却常被漏掉[9]。经典克隆测序的方法要求大量的总RNA，而在样品数量有限的情况下得到相当量的总RNA会遇到困难。为了避免上述局限性，人们发展了许多预测小RNA的方法[10-13]，这包括计算机筛选，芯片检测，比较基因组分析以及从已经存在的小RNA基因结构预测它与启动子，终止子结合的结构。因为含高密度核苷酸的基因芯片已经表现出检测mRNA表达的强大威力，因而用基因芯片检测并确证小RNA的表达有可能获得成功。出于上述目的有些研究人员已经发展出利用组合方法鉴定新的miRNA的方法，例如Bentwich[13]通过综合运用计算机预测和芯片分析发现了一些新的miRNA。其它几个独立的研究组也报道微矩阵芯片是高通量探测miRNA表达谱的有效的，灵敏的，而且是专一的检测方法[14-23]。但以往的芯片检测探针为20个左右的寡核苷酸，与样品中的小RNA相互作用的强度不够高，对于低分子量和低丰度的小RNA的检测中存在着漏检的问题，同时目前采用的检测探针容易受样品中的小RNA前体的干扰。因而提高探针检测小RNA的灵敏度和专一性以及提供高质量的小RNA纯化样品，提高小RNA尤其是分子量低于40个碱基的实验样品是进一步发现新的具有重要生物功能的小RNA需要克服的主要技术瓶颈。


发明内容
本发明的目的是提供一种能够通过综合使用小RNA的结构预测，小RNA的富集技术以及通过包括用特定方法制备的探针的小RNA芯片的高通量检测，鉴定从人蛋白编码基因的内含子区生成的小RNA分子，提高检测小RNA信号的灵敏度以及提高对样本中低丰度小RNA的检测能力。
在本发明的第一方面，提供了一种能高效结合成熟小RNA的新型寡核苷酸探针，如图1所示，以及制备这种探针的方法。这种探针由三个部分组成共有序列1，与成熟小RNA杂交的序列专一性寡核苷酸部分2(即，杂交序列2)和发夹结构3，探针的总长度为40-70个碱基，其中能识别成熟小RNA的杂交序列2的长度为15-35个碱基，其特征在于，DNA探针部分2的5’端还连接着10-30个碱基的高GC含量的无义链DNA序列(发夹结构3)，例如，但不限于，CCGGCCTATTATGGCCGG(本领域的技术人员应该理解，本发明不限于所举例中的序列，包括各种能形成发夹结构的序列)，此序列能形成一种发夹结构；在探针部分2的3’端连有一段共同的核苷酸序列1，例如，但不限于，TTTTTTTTTT或AAAAAAAAAAA。当用于本文时，本领域的技术人员应该理解，所述“共有序列1”或“共同的核苷酸序列1”是指按照常规方法在大部分的寡核苷酸探针中都可以使用的寡核苷酸序列，也可以叫作“通用序列”。在每条寡核苷酸探针的与芯片基质相连端(探针的3’端)带有氨基连接基团，能够和涂布在基因芯片的载体(例如，玻璃片)表面的有机硅聚合物通过Schiff碱反应固定在芯片表面，从而容易点样到涂有有机硅的载体(例如，玻璃板)上而制成基因芯片。
另外，所述寡核苷酸探针中能够与成熟小RNA形成互补结构的寡聚核苷酸中的每一个核苷酸可以是自然无修饰的，也可以是经不同化学方法修饰的，如肽核苷酸(PNA)、闭锁核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修饰的核苷酸。
与现有技术的寡核苷酸探针(其不包括发夹结构3，为直链探针)相比较，本发明的寡核苷酸探针的优点在于，除了共有序列1和专一性杂交序列2之外，在探针部分2的5’端还连接着发夹结构3(即，10-30个碱基的高GC含量的能够形成发夹结构的无义链DNA序列)。所述发夹结构3形成较大的发夹环，其优点在于，使得所述寡核苷酸探针提供了较大的空间阻抑作用，避免与小RNA的前体或更长的同源片段杂交，提高了探针针对小于40nt的小RNA的特异性。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了制备本发明的寡核苷酸探针的方法，其包括在常规直链探针的5’端连接上发夹结构3。
在检测新的小RNA时，该探针制备方法的新颖性在于选择了通过计算机设计获得的或已鉴定的潜在小RNA的正义链和反义链DNA序列，该序列只能与成熟的小RNA片段杂交，形成互补的二聚体，而不能与小RNA的前体或更长的同源片段杂交形成互补的二聚体。这是因为较大的发夹环的阻抑作用。所以这种DNA探针可以提高探针与待检测样品中的互补小RNA的特异性结合，降低非特异性背景信号，提高检测的灵敏度，更适合于检测样本中的低丰度的成熟的小RNA(图5和6)。这样成功地去除了小RNA前体的影响。
本发明的第二方面提供应用本发明第一方面的寡核苷酸探针而制备的小RNA芯片。本发明第一方面的寡核苷酸探针的3’端带有氨基连接基团，能够和涂布在基因芯片的载体(例如，玻璃片)表面的有机硅聚合物通过Schiff碱反应固定在芯片表面，从而容易点样到涂有有机硅的载体(例如，玻璃板)上而制成基因芯片。
在本发明的优选的实施方案中，本发明的小RNA芯片可用于制备鉴定和比较不同细胞之间，正常细胞和肿瘤细胞之间或细胞分化前后小RNA的变化，通过检测小RNA表达谱而鉴定细胞/组织的特异性，以及诊断和评价肿瘤细胞的来源和分化程度的试剂盒。
本发明的第三方面在于改良了小RNA样品纯化和富集方法。目前分离样品中的总RNA以及mRNA的常规的标准操作程序[15-21]并不适合低丰度、低分子量的小RNA的纯化与回收，其实验成本高，纯化的产量低，而每次芯片检测需要至少1μg的小RNA，按照常规方法通常需要进行3-5次纯化，才能满足进行芯片杂交检测的实际需要，增加了实验的劳动和时间成本。然而，按照本发明的方法，采用两步法可以获得高纯度、高回收率(至少1μg)的小RNA，尤其是低分子量，碱基数小于40的小RNA(本发明的两步法在下文称为“联合方法”)。
然而，本领域的技术人员应该理解，本发明的小RNA分子的纯化、富集方法还可以用来纯化和富集长度为40-200nt的小RNA。
在本发明的一个优选的实施方案中，小RNA纯化、回收的第一步可以采用商品化的miRNA提取试剂盒，如美国Ambion公司的mirVana(货号为1560)，先从样品中富集碱基数为200以及更小的小RNA，将洗脱出来的小RNA组分用乙醇沉淀法回收，然后将该沉淀组分在直径为4厘米，高度为4厘米的玻璃管电泳柱(见图2)内进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的电流和电压根据具体情况调节，以达到能将小于40的小RNA与大于40的RNA片段完全分离的目的。电泳仪可为国产或进口的产品，例如，BioRed的PowerPac，以分离收集碱基数低于40的小RNA。但是，本发明不局限于直径为4厘米和高度为4厘米的玻璃管电泳柱，其直径和高度范围为1cm到10cm，选择的原则是一次性获得1μg左右的小RNA分子。所获得的小RNA用RNA定量试剂盒，如美国Invitrogen公司的RiboGreenTM试剂盒(货号R-11490)进行定量。用该方法可一次性获得足量的短的小RNA，以便用于进一步的RNA标记和杂交分析。



图1.新型小RNA检测探针的结构示意图。探针的蓝色部分表示芯片上的每一条DNA探针中的相同的共有序列部分1，黑线部分表示每一条探针中的专一性杂交寡核苷酸序列2，绿色部分是每一条探针中相同的能形成发夹结构的核苷酸序列3。该探针的3’端通过氨基与芯片载体的活性基团连接。
图2.改进的小RNA柱状电泳装置的正视图。图2A，制胶装置图；图2B，电泳装置图。
图3.本发明实施例1中采用的实验步骤、主要方法以及某些实验参数的流程图。实施例1中包括新的小RNA预测，样品的富集和纯化，小RNA标记，芯片杂交以及小RNA表达谱的分析。
图4.用美国Ambion公司的mirVana miRNA分离试剂盒获得的小RNA的电泳分析。用mirVana miRNA分离试剂盒将从细胞中分离纯化的总RNA(TOT)进一步分离纯化为碱基数高于200(HMW)以及低于200(LMW)的RNA组分。图4A和4B给出了1微克RNA的各样品经1.2％的变性琼脂糖凝胶(图4A)和15％变性聚丙烯酰胺凝胶(图4B)的电泳图。
图5.用改良的大直径(4厘米)的玻璃管电泳，从低于200(LMW)的RNA组分中分离纯化出低于40nt的RNA用于进一步的分子杂交试验。图5给出了分别来自A549和HLF细胞的10微克RNA的各样品的RNA印迹(Northern Blot)杂交图。图中30nt大小的杂交带显示来自两种不同富集方法(即，纯化低于200nt的小RNA的常规方法和纯化低于40nt的小RNA的本发明的联合方法)的差异。
图6.传统的直链小RNA探针与新型小RNA检测探针的特异性比较。其中，“传统的”为传统的直链探针(不包括发夹结构3)，其不但能与成熟的(Mature)(＜40nt)小RNA片段杂交，形成互补的二聚体，也能与小RNA的前体(Precursor)(＞60nt)或更长的同源片段杂交形成互补的二聚体；“改进的”为本发明的探针，因为较大的发夹环的阻抑作用，其只能与成熟的(＜40nt)小RNA片段杂交，形成互补的二聚体，而不能与小RNA的前体或更长的同源片段杂交形成互补的二聚体。所以这种DNA探针可以提高探针与待检测样品中的互补小RNA的特异性结合，降低非特异性背景信号，提高检测的灵敏度，更适合于检测样本中的低丰度的成熟的小RNA。
图7.单独用mirVana miRNA试剂盒以及用本发明的联合方法分离的小RNA进行基因芯片检测小RNA表达谱的比较。总RNA用mirVanamiRNA试剂盒分为碱基数高于200的高分子量组分(HMW)和碱基数低于200的低分子量组分(LMW)。随后低分子量组分进一步分为两个组分，其中一个组分的RNA大于40个碱基，另一组分的RNA小于40个碱基(Enrich(富集))。为了评价这两种操作在小RNA芯片分析上的差异，40-200nt的低分子量RNA(图7A，LMW)和小于40nt-RNA(图7B)经荧光探针标记后在小RNA芯片上进行杂交。图7A和图7B的杂交扫描谱的前三行给出的某些强信号点代表实验中的不同对照。图7C给出了这两张芯片中相应探针处信号强度的定量比较。
图8.小RNA芯片技术能够检测骨髓干细胞分化前后小RNA的差异表达。骨髓干细胞分化前(BMSC)(图8A)和分化后(HSC)(图8B)的总RNA分为碱基数低于200的大分子量组分和碱基数低于40的低分子量组分。低分子量组分经荧光探针标记后在小RNA芯片上进行杂交。图8C给出了这两张芯片中相应探针处信号强度的定量比较。
图9.小RNA基因芯片技术可区分不同细胞类型的小RNA表达谱。从骨髓干细胞(BMSC)(蓝色)，人纤维母细胞(HLF)(黄色)和A549细胞(红色)分离的总RNA纯化成高分子量RNA和低分子量RNA(LWM)。低分子量RNA经标记后杂交，并计算出三种不同细胞类型的杂交总荧光强度信号(图9A)。图9B给出了每一种细胞中可鉴定的小RNA的数目，并分解成在三种细胞中共同出现的，在每两种细胞中共同出现的以及仅在某一种细胞中出现的小RNA的数目。图9C给出了三种不同细胞中小RNA表达谱的荧光强度分布。

具体实施例方式 以下将通过实施例对本发明作进一步的阐述。但是，本领域的普通技术人员应该理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并不限制本发明的保护范围，本发明的精神和范围由后附的权利要求所限定。本领域有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行不背离本发明的精神和范围的修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。
实施例1 用基因芯片检测方法从人基因组中的内含子以及蛋白编码区鉴定小RNA 虽然本实施例仅限于小RNA基因芯片检测的探针制备和用于低丰度小RNA的纯化、富集的方法，为便于说明本发明的应用，本实施例介绍一个比较完整的小RNA的高通量测定来检测经计算机预测分析可能存在的小RNA。图3给出了从人基因组中的内含子以及蛋白编码区鉴定小RNA的实验流程图。
1.芯片的制备 从人编码基因的相关数据库中下载了21000条内含子序列(http://www.meduohio.edu/bioinfo/eid/index.html)，通过计算机预测分析发现具有生成小RNA可能的内含子序列有1256条，从中随机选出536条序列，这些序列的宿主基因包括多种功能基因如与转录因子、细胞周期、细胞凋亡、信号通路、代谢调节等有关。采用美国应用生物系统公司3900型高通量DNA合成仪合成这些序列。利用上述核苷酸序列的正义链和反义链做为小RNA俘获探针的一部分(即，专一性寡核苷酸序列2)，该部分的核苷酸的平均长度为25个碱基，它的3’端与共有序列1的5’端相接，在它的5’端接上15个碱基组成的无义链寡核苷酸(即，发夹结构3)，使得每一条核苷酸探针的总长度约为50个碱基。将每条探针的3’端进行氨基修饰，使之能够和玻璃板上的聚合硅发生共价反应从而固定到芯片表面。然后将这些探针分别在用于制备芯片的玻璃板上平行点样三次，每张芯片上共含4080个探针点样点，其中的864个探针点为不同的对照探针。对照探针包括内源性和外源性的阳性和阴性探针，其中tRNA，let-7，U6和U2 snRNA(序列见表1)作为内源性阳性探针，另外还合成了多个外源性阴性探针(序列见表1)。
表1.实施例1中所用的一些探针(包括一些阳性探针和阴性探针)的序列。


芯片的制备采用涂有有机硅的Corning GAPS-2玻璃板(目录号#40003，供应商Corning Inc.，美国)为支持材料，并用SmartArray点样机(型号SmartArray-48，供应商CapitalBio Corp，中国)点样，每个探针点的直径为150μm，相邻探针点中心间的距离为240μm，点完探针样品后让玻璃片在室温下干燥24小时，然后按下述方法清洗掉未共价结合的DNA和点样缓冲液把玻璃片放在一个烧杯中并在烧杯中放一个搅拌子，在25℃用0.2％的SDS洗涤两次，每次5分钟，然后在50℃用蒸馏水洗两次，每次5分钟，再在25℃用0.1M四氢硼二钠溶液洗涤5分钟，用0.2％SDS洗涤三次，每次1分钟，用蒸馏水洗2次，每次1分钟。将玻璃片室温下于空气中彻底晾干后用于杂交检测。
本实施例中的小RNA芯片可以进一步制成试剂盒，所述试剂盒包括本发明的小RNA芯片，以及本领域的技术人员已知的检测所需要的各种试剂。
2.低丰度小RNA的纯化和标记 人的A549肿瘤细胞系(ATCC No.HTB-22，美国)作为纯化低丰度小RNA材料的一个例子。按照美国Invitrogen公司提供的实验操作说明书，收集2×105个细胞，经生理盐水洗涤后用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，混合在其中的基因组DNA用美国Ambion公司的不含RNase的DNase I分解去除。RNA的纯化量用紫外260nm的光吸收测量。RNA的纯度通过测量样品在260nm和280nm处的光吸收的比值来评价。260nm/280nm的比值在1.8-2.0之间表示RNA的纯化质量好。RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测分子量分别为5000个碱基和1900个碱基的28S和18S的核糖体RNA而说明(图4)。出现清晰的28S和18S核糖体核酸条带表明所纯化的RNA保持着高度的完整性，相反如果发现28S和18S条带变得弥散，表明所制备的RNA发生了显著的降解。为了避免mRNA降解的影响，可以用试剂盒如Sigma公司的CelLytic NuCLEARTM抽提试剂盒(目录号N-XTRACT.46)先把细胞核从细胞中分离出来。总RNA可以分别从细胞核和细胞浆中提取。然后用美国Ambion公司的mirVana miRNA试剂盒(目录号AM1560)从总RNA中富集大小为200nt及用改良的大直径(直径为4厘米)的玻璃管电泳，从低于200(LMW)的RNA组分中分离纯化出低于40nt的RNA用于进一步的分子杂交试验(图7)。低分子量小RNA的量可以用美国Invitrogen公司的RiboGreenTM试剂盒(目录号R-11490)进行定量。
纯化的小RNA经T4连接酶和过量的5’-磷酸-胞苷-尿苷-cy3(5′-phosphate-cytidyl-uridyl-Cy3-3′)供体与小RNA受体的3’-羟基定量连接[19，24]，进行标记。15μl的核酸标记反应体系中含2μg的低分子量RNA(＜200nt)或200ng的小RNA(＜40nt)，0.5mM ATP，50mM HEPES(pH7.8)，5mM DTT，20mM MgCl2，150mg/ml PEG，10mg/ml BSA，10％DMSO，1000ng的5’-磷酸-胞苷-尿苷-Cy3和3个活力单位的T4连接酶，25℃反应2小时。
3.阵列杂交和检测结果分析比较 3.1阳性对照探针的检测结果 将标记的小RNA与芯片上的寡核苷酸探针用通用的杂交方法[15-21]杂交后，用LuxScan 10K-A芯片扫描仪(型号LuxScanTM 10K-A，供应商CapitalBio Corp，中国)记录各寡核苷酸探针位置处被标记的小RNA荧光探针的荧光发射强度，并用计算机软件，如Axon公司的GenePix Pro4.0进行分析。和小RNA let-7a(序列见表1)相比，小RNA let-7c(序列见表1)、let-7f(序列见表1)的序列只有一对碱基不能配对，而let-7a探针检测到的信号明显的比let-7c和let-7f探针检测到的信号强2.1倍[25]，并且用已被广泛使用的小RNA探针检测到的结果具有明显的可重复性[26，27]。
3.2传统的直链小RNA探针与新型小RNA检测探针的特异性比较 参见图6，比较了传统的直链小RNA探针与新型小RNA检测探针的特异性。本发明的探针只能与成熟的(＜40nt)小RNA片段杂交，形成互补的二聚体，而不能与小RNA的前体(＞60nt)或更长的同源片段杂交形成互补的二聚体(图6“改进的”)。这是因为较大的发夹环的阻抑作用。所以，本发明的这种DNA探针可以提高探针与待检测样品中的互补小RNA的特异性结合，降低非特异性背景信号，提高检测的灵敏度，更适合于检测样本中的低丰度的成熟的小RNA。相反，传统的直链探针(不包含发夹结构)不但能与成熟的(＜40nt)小RNA片段杂交，形成互补的二聚体，也能与小RNA的前体(＞60nt)或更长的同源片段杂交形成互补的二聚体(图6“传统的”)。可见改进后的探针大大提高了小RNA芯片检测成熟RNA片段的特异性。
3.3本发明的纯化和富集小RNA的联合方法的优点 图7比较了仅用mirVana miRNA试剂盒纯化的大小在200nt及其以下的小RNA以及进一步用本发明的联合方法纯化的大小为40nt及其以下的小RNA与本发明所制备的寡核苷酸探针杂交的不同结果。以A549细胞为例，用mirVana miRNA试剂盒纯化的小RNA通过用包括本发明的探针的小RNA基因芯片检测可以获得66种具有明显信号的小RNA(图7A)，而用联合方法纯化的小RNA样品经与相同的芯片探针杂交后可以探测到203种具有显著信号的小RNA(图7B)。用本发明的联合方法所给出的检测信号强度也比用前一种方法高出几倍至10多倍(图7C)。利用本发明的寡核苷酸探针可以有效去除碱基数高于40的小RNA与检测探针的杂交，正如用本发明的联合方法所富集的小RNA样品给出较前一种方法所富集的RNA样品给出的显著变强的检测信号(图7C)所表明的。
实施例2 检测细胞分化前后基因表达的差异 人骨髓间充质干细胞(BMSC)(来源知情的病人)经诱导处理后分化为造血干细胞(HSC细胞)[28]。收集分化前和分化后的细胞，并用实施例1所述的联合方法提取小RNA(＜40nt)后，用包括实施例1中的小RNA检测芯片的试剂盒检测分化前和分化后的小RNA表达谱的变化，如图8A，图8B所示。定量分析可以确定其中的13种小RNA(序列见表2，SEQ ID No.1-13)在细胞分化后被显著下调，另外4种小RNA(序列见表2，SEQ ID No.14-17)被显著上调，如图8C所示。

实施例3 通过检测小RNA表达谱鉴定细胞/组织的特异性 本实施例采用三种人源性细胞分化前的人骨髓干细胞(BMSC)(来源知情的病人)，人纤维母细胞(HLF)(ATCC No.CCL-186，美国)和人A549细胞(ATCC No.HTB-22，美国)。从上述三种细胞中分离纯化小RNA后，采用包括实施例1中的小RNA检测芯片的试剂盒进行检测并分析检测信号的差异。图9A显示BMSC和HLF细胞中被检测到的小RNA的总荧光信号没有显著的差别，而和A549细胞相比，A549中可被检测到的小RNA荧光信号显著降低，比较可检测到的各小RNA的荧光强度差异可以发现有10种小RNA(序列见表3，SEQ ID No.36-45)是这三种细胞所共有的，而有5种小RNA(序列见表3，SEQ ID No.31-35)仅在BMSC细胞中表达，另外6种小RNA(序列见表3，SEQ ID No.25-30)仅在HLF细胞中表达，有7种小RNA(序列见表3，SEQ ID No.18-24)仅在A549细胞中表达，这种特异表达的小RNA谱可以成为鉴定细胞/组织特异性的一种实验方法。
表3.小RNA在不同细胞中的表达。
注释表3中提供的序列是人工合成的寡核苷酸序列，其与芯片上的探针序列互补，但是本领域的技术人员应该理解，在广泛意义上，所述序列包括相应的sRNA序列。
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IB083242序列表.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院生物物理研究所
<120>用于筛选和鉴定低丰度小RNA表达谱的新型小RNA芯片的制备方法和应用
<130>IB083242
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<170>PatentIn version 3.1
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atcctcctgc ctcagcctcc 20
权利要求
1.一种检测低丰度小RNA的寡核苷酸探针，其特征在于，从5’端到3’端依次由下述三部分组成第一部分为共同的无义寡聚核苷酸(1)，第二部分为能与成熟小RNA杂交的序列专一性寡聚核苷酸(2)，第三部分为发夹结构(3)，其是由高CG含量组成的可形成发夹结构的无义链核苷酸。
2.按照权利要求1所述的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针具有下述特征之一所述寡核苷酸探针的总长度在40-70个碱基之间，所述寡核苷酸探针中能够与成熟小RNA杂交的寡聚核苷酸(2)的长度在15-40碱基之间，或者发夹结构(3)的长度在10-30碱基之间。
3.按照权利要求1或2所述的寡核苷酸探针，其中所述第一部分的共同的无义寡核苷酸(1)为TTTTTTTTTT或AAAAAAAAAAA，所述第三部分的由高CG含量组成的可形成发夹结构的无义链核苷酸(3)为CCGGCCTATTATGGCCGG，或者所述第二部分的能够与成熟小RNA形成互补结构的寡聚核苷酸(2)中的每一个核苷酸是无修饰的，或者是经不同化学方法修饰的，如肽核苷酸(PNA)、闭锁核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧-修饰的核苷酸。
4.一种制备权利要求1或2所述的寡核苷酸探针的方法，其包括在常规直链探针的5’端连接上发夹结构(3)。
5.一种用于筛选和鉴定低丰度小RNA表达谱的小RNA芯片，其包括权利要求1所述的寡核苷酸探针。
6.一种试剂盒，其包括按照权利要求5所述的小RNA芯片。
7.按照权利要求6所述的试剂盒的应用，其用于检测不同细胞之间、正常细胞和肿瘤细胞之间或细胞分化前后基因表达的差异，或者通过检测小RNA表达谱而鉴定细胞/组织的特异性，或者诊断和评价肿瘤细胞的来源和分化程度。
8.按照权利要求7所述的应用，在人骨髓间充质干细胞(BMSC)分化前后，表达水平被显著下调的小RNA包括SEQ ID No.1-13，表达水平被显著上调的小RNA包括SEQ ID No.14-17。
9.按照权利要求7所述的应用，在分化前的人骨髓干细胞(BMSC)、人纤维母细胞(HLF)和A549细胞中都表达的小RNA包括SEQ ID No.36-45，仅在BMSC细胞中表达的小RNA包括SEQ ID No.31-35，仅在HLF细胞中表达的小RNA包括SEQ ID No.25-30，仅在A549细胞中表达的小RNA包括SEQ ID No.18-24。
10.一种适合于基因芯片检测的小RNA分子的纯化和富集方法，其特征在于联合使用提取小RNA的分离柱和玻璃管电泳柱来富集长度＜40nt的小RNA的实验方法。
全文摘要
本发明提供一种新型的小RNA芯片，用于筛选和检测那些已被鉴定或预测的内源性shRNA、miRNA和/或其它类型的小RNA，和介绍专用于小RNA的寡核苷酸探针的制备以及低丰度小RNA的纯化和富集方法。该短小核苷酸捕获探针由三部分组成；第一部分为共同序列(1)，第二部分为能与成熟小RNA杂交的寡核苷酸(2)，第三段为由高CG含量组成的可形成发夹结构的无义链核苷酸(3)。样品中低丰度的小于40nt的小RNA可通过联合使用小RNA分离柱和大管径制备电泳来富集。该方法可灵敏地检测到细胞/组织中低丰度表达的小RNA分子，可用于鉴定和比较细胞分化前后小RNA的变化，以及诊断和评价肿瘤细胞的来源和分化程度。
文档编号C12N15/11GK101608232SQ20081011518
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月18日 优先权日2008年6月18日
发明者殷勤伟, 赵春华, 张洪杰 申请人:中国科学院生物物理研究所