专利名称：：蛋白生产的改良的制作方法
技术领域：
：本发明涉及细胞培养
技术领域：
。其涉及生产蛋白的方法以及产生用于生物药生产的新表达载体及宿主细胞的方法。本发明还涉及药物组合物及治疗方法。
背景技术：
：供人类治疗使用之生物医药之市场继续高速成长，在2003年中有270种新的生物医药在临床研究中得到评估且估计销售额为300亿(Werner,2004)。生物医药可由各种宿主细胞系统生产，该等宿主细胞系统包3舌细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞及包括源自人类的细胞林之哺乳动物细胞。目前，逐渐增加数量之生物医药由真核细胞生产，因为真核细^^能够正确地加工及修饰人类蛋白。因此，自此等细胞成功地及以高产率生产生物医药至关重要且高度取决于制程(process)中所使用之重组单克隆细胞林之特征。因此，存在对产生具有改良特性之新的宿主细胞系统并建立以高比生产力作为高产率制程之基础来培养生产细胞抹之方法的迫切需要。早先方法集中于制程设计及反应器设计。现在，主要改良由培养基调配物研发及宿主细胞之基因工程化推动。用于生产生物医药之最常见工业用哺乳动物宿主细胞系统为永生化之中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞株(Wurm，2004)。改良哺乳动物生产细胞抹之最初代谢工程化策略集中于其在无血清之培养基中悬浮生长之能力。运铁蛋白及类胰岛素生长因子1(IGF-1)在CHO-Kl细胞中之稳定表达使细胞抹能够在无蛋白之条件下增殖(Pak等人，1996)。改良生产细胞抹之其它方法包括针对靶向或生成转录热点而在转染载体上使用调节DNA组件。已展示诸如影响染色质结构之S/MAR(骨架/基质相关区域)之调节组件及源自管家基因之UCOE(遍在染色质开放组件)均正向影响由CHO细胞林所生产之重组蛋白之比生产力(Barnes及Dickson，2006)。由于细胞凋亡已展示为哺乳动物细胞培养生产过程中细胞死亡之主要原因(al-Rubeai及Singh,1998)，因此已充分研究哺乳动物宿主细胞中抗细胞凋亡基因之表达对培养物生存力的影响。大多数抗细胞凋亡工程化策略系集中于bcl-2家族之抗细胞凋亡基因(例如bcl-l或bcl-xL)之过度表达(Kaufmann及Fussenegger,2003)。藉由增加对发酵期间细月包凋亡刺激(诸如养份耗尽及副产废物累积)的细胞抵抗，使用细胞凋亡工程化细胞抹之生产过程展示延长之培养物生存力且在一些状况下展示产物产率增加(Chiang及Sisk,2005)。由于大多数生物医药产品为在生产过程期间自细月包分泌的蛋白，因此生产细胞抹之分泌运送装置为新颖宿主细胞工程化策略之另一关注标靶。蛋白分泌为复杂之多步机制首先指定运送至细胞外空间或外层细胞膜的蛋白以共翻译方式进入内质网中。自此处，其被封包于脂嚢泡中且运送至高尔基体(Golgiapparatus)且最终自跨高尔基体(tmns-Golgi)网络(TGN)运送至细胞膜，在细胞膜中其被释放至培养基中(Seth等人，2006)。任何生物医药生产过程之产率主要视在制程条件下生长时每时间生产细胞所分泌的蛋白产物之量而定。许多复杂之生物化学细胞内过程为自真核细胞合成及分泌治疗性蛋白所必需。诸如转录、RNA运送、翻译、翻译后修饰及蛋白运送之所有此等步骤在野生型宿主细胞^^朱中得到严密调节且将影响源自此宿主之任何生产细胞林之比生产力。许多工程化方法已利用对驱动诸如转录及翻译之过程之分子网络的日益增多的了解来提高蛋白生产中此等步骤之产率。然而，对于任何多步生产过程而言，在制程链早期步骤期间放宽瓶颈可能在更下游，尤其是翻译后生成瓶颈。据报导，直至特定临限值，生产细胞之比生产力与产物基因转录含量呈线性关系(Bames等人，2007)。然而，mRNA水平下产物表达之进一步增强可引起蛋白合成、折迭或运送装置超载，从而导致蛋白产物的细胞内累积。实际上，在当前制造过程中可经常观察到此种现象(图l)。旨在解决此问题及有效改良自真核细胞分泌蛋白产物之特定靶向工程化方法受到当前缺乏对驱动蛋白运送至细胞膜之复杂调节网络的了解阻碍。对工程化所分泌治疗性蛋白的细胞内运送之首要研究系以如结合蛋白BiP/GRP78、蛋白二硫键异构酶(PDI)之分子伴随蛋白之过度表达为中心。伴随蛋白为寄宿于内质网(ER)内的细胞蛋白且帮助新合成蛋白折迭及装配。已展示与所预期相反，哺乳动物细胞中之BiP过度表达减少而非增加与其相关联的蛋白之分泌(Domer及Kaufman,1994)。同样，CHO细胞中之PDI过度表达使TNFR:FC融合蛋白之表达减少(Davis等人，2000)，而抗体之比生产力增加40。/。(Borth等人，2005)。细胞蛋白折迭能力增加在更下游生成生产瓶颈之此等惊人发现的可能解释受到描述对于CHO细胞抹中之IFN-y生产ER至顺面高尔基体运送问题之报导支持(Hooker等人，1999)。提高哺乳动物细胞分泌能力之另一新近方法为异源过度表达转录因子X-盒结合蛋白1(XBP-1)。XBP-1为浆细胞分化中之主调节因子之一，浆细月包是一种相对抗体之高含量生产及分泌经最优化之特殊细胞类型(Iwakoshi等人，2003)。XBP-1通过以下方式调节此过程:在广泛范围之分泌路径基因之启动子内与所谓ER应力反应组件(ERSE)结合来，从而引起(i)ER之物理性膨胀，(ii)增加之线粒体质量及功能，(iii)较大细胞尺寸及(iv)增强之总蛋白合成(Shaffer等人，2004)。近来，已描述藉由在非浆细胞，尤其生产细胞抹中过度表达XBP-1来增加蛋白分泌之尝试。在CHO-Kl细胞中，展示在将XBP-l引入CHO-Kl细胞中后两种报导蛋白(分泌性碱性磷酸酶(SEAP)及分泌性a-淀粉酶(SAMY))之生产含量增加。然而，在关于诸如HEK293、HeLa或HT-1080细胞之其它细胞抹之瞬时研究中并未显示效应(Tigges及Fussenegger，2006)。AilorEric之专利申请案WO2004111194主张过度表达XBP-1或ATF6用以产生高多产细胞林。值得注意的是XBP-1不仅调节浆细胞分化而且在未折迭蛋白反应(UPR)中起重要作用(Brewer及Hendershot,2005)。UPR^示经由内质网(ER)中蛋白折迭之抑制活化之复合信号转导网络。UPR协调对此应力情况之适应性反应，包括诱导ER驻留分子伴随蛋白及蛋白折迭酶表达以提高ER的蛋白折迭能力，诱导磷脂合成、衰减一般翻译及上调ER相关降解以减少ER之未折迭蛋白负载。在严重或长期ER应力后，UPR最终诱发细胞凋亡(Schroder,2006)。之程序，在此期间细胞丧失增殖能力而产生终末分化之分泌细胞。实际上，几乎所有针对高含量蛋白分泌而特别设计的细胞类型(例如，腺细胞、胰腺P-细胞)均为终末分化的，不能增殖且在最终经历渐近式细胞死亡之前具有有限寿命(Chen-Kiang，2003)。因此，过度表达作为浆细胞分化与UPR两者之调节因子的XBP-l可能因其抑制增殖和/或诱发细胞凋亡之固有风险而不利。总之，存在对改良用于重组蛋白生产之宿主细胞之分泌能力的需要。此在与新颖转录增强技术组合及在高效价制程中甚至可能变得更为重要以便防止翻译后瓶颈及蛋白产物的细胞内积累(图l)。然而，目前，在分泌运送装置之耙向操控之道路上存在两个主要障碍关于基础调节机制之认识要。、、'"》；\本发明描述神经酰胺转移蛋白CERT在将所分泌蛋白运送至细胞膜中之新颖及惊人作用且另外提供一种有效改良自真核细胞经由分泌路径所运送的蛋白之生产的方法。CERT(亦称为Goodpasture抗原结合蛋白)为对于神经酰胺自其在内质网(ER)处之生产位点非囊泡传递至高尔基体膜必需的胞质蛋白，在高尔基体膜中神经酰胺转化为鞘磷脂(SM)(Hanada等人，2003)。存在两种CERT同功异型物缺失26个氨基酸之更丰富表达的替代性拼接形式，富含丝氨酸之区域(SEQIDNO.IO,11);及全长624个氨基酸的蛋白，被命名为CERTL(SEQIDN0.12,13)(Raya等人，2000)。两种CERT同功异型物均具有对于神经酰胺结合及运送所必需且充足之羧基封端类固醇合成急性调节(StAR)相关脂质转移(START)域(Hanada等人，2003)。START域在蝇及虫与人类之间高度保守(图2)。其长度为约210个氨基酸且形成容纳卑体脂质之疏水性通道(Alpy及Tomasetto，2005;Soccio及Breslow，2003)。START域见于15种哺乳动物蛋白中，其中CERT与磷脂酰胆碱转移蛋白Pctp(其在膜之间结合并往返运送磷脂酰胆碱(PC))及StarD10(对于PC及PE具有特异性之脂质转移蛋白)最紧密相关(Olayioye等人，2005;Soccio及Breslow，2003;Wirtz,2006)。除START域以外，CERT蛋白进一步含有对于负责高尔基体定位之PI(4)P具有特异性之胺基封端PH域(Hanada等人，2003;Levine及Munro，2002)及经由与ER驻留跨膜蛋白VAP-A及VAP-B之相互作用而使蛋白靶向ER之FFAT基元(酸性段中之两个苯丙氨酸)(Kawano等人，2006;Loewen等人，2003)。CERT在脂质运输中之基本作用在中国仓鼠卵巢细胞抹LY-A中展现，其9中突变无功能CERT蛋白之表达削弱神经酰胺运送，从而导致鞘磷脂的细胞含量降低(Hanada等人，2003)。据认为非嚢泡脂质转移发生在所谓膜接触位点(MCS)，ER在此处与其它细胞器形成紧密敷着(Levine及Loewen，2006)。CERT可因此在ER与高尔基体膜之间穿梭极短距离，或许同时接触两个代谢区。当过度表达时，CERT之START域足以供神经酰胺转移至高尔基体(Kawano等人，2006)。然而，在生理条件下，高尔基体与ER靶向基元均为CERT功能所必需的。在LY-A细胞中，鉴别出CERT在其PH域内含有突变(G67E)，致使蛋白在PI(4)P结合中存在缺陷(Hanada等人，2003)。对于CERT功能需要PI(4)P进一步由新近报导支持PI4KIIip活性为将神经酰胺有效运输至高尔基体所必需(Toth等人，2006),PI4KIIip之酶活性由蛋白激酶D(PKD)刺激。PKD属于丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶之亚家族(包含PKD1/PKC^1、PKD2及PKD3/PKQ))且最近被鉴别为对于调节高尔基体膜至细胞膜的蛋白运送至关重要(论述于(Rykx等人，2003;Wang，2006)中)。PKD在TGN处之募集及活化由脂质二酰基甘油(DAG)介导(Baron及Malhotra,2002)，DAG之池由鞘磷脂合成酶自神经酰胺及磷脂酰胆碱产生。本发明展示PKD使CERT之邻近于PH域之丝氨酸132磷酸化，藉此负向调节PI(4)P结合、高尔基体靶向及神经酰胺转移活性。另外，藉由将DAG生产所需之神经酰胺转移至高尔基体膜，CERT刺激PKD活性，由此建立确保维持组成性分泌运送之调节反馈回路。重要的是所提供之数据另外展示在不同真核细胞抹(COS7及HEK293)中，引入编码CERT之基因显著地增强异源蛋白分泌至培养基中。当使用不可经PKD磷酸化之CERT突变体时，此效应甚至更加显著。CERT内磷酸化接受体位点之缺失使PKD对CERT之负向控制中断，但经由支撑神经酰胺转化为鞘磷脂及DAG而使CERT对PKD之正反馈保留完整。因此，可推测本发明之分泌增强机制不仅可由野生型CERT，而且可由CERT之使CERT脱离PKD之负向影响之所有突变体来实施，突变包括接受体丝氨酸之点突变、包括失CERT属于StAR相关脂质转移蛋白家族(Soccio及Breslow,2003)，该等蛋白之特征在于其用于脂质结合之START域。由于已证明CERT之START域为CERT作用所需要且足以用于产生CERT作用(Hanada等人，2003),因此可在过度表达此蛋白家族之另一成员时同等地观测到CERT之分泌促进效应。对于PCTP亚家族之紧密相关成员而言，此尤其有可能，该等成员包含PCTP(SEQIDN0.26,27)、CERT/GPBP本身、StarD7及StarD10。此等蛋白具有不同脂质结合特异性且可同等地影响与异源蛋白分泌有关的细胞器功能。另外，由ER应力所诱发之相关蛋白STARD4(SEQIDNO.20,21)及STARD5(SEQIDNO.22,23)之表达可用以满足在生产过程期间对细胞脂质转移增加之需求。START域蛋白存在于自蝇、虫及小鼠至人类之真核生物中指示脂质运输之基本机制在真核界中系保守的。其另外表明本发明中所述之原理(亦即藉由强制表达CERT来增加分泌)有可能充分适用于所有真核细胞(包括酵母)。总而言之，本发明提供一种藉由异源表达CERT、CERT突变体或START蛋白家族之另一成员来增强真核细胞中蛋白之分泌运送的方法。此方法尤其适用于产生具有表达及制造重组蛋白产物之增强生产能力之最优化宿主细月包系统。本发明中所描述之方法在若干方面具有优点第一，证明CERT之异源表达为藉由提高宿主细胞之分泌能力来增强重组蛋白生产之策略。增强生产细胞之比生产力在工业蛋白生产过程中转化为较高产物产率。在趋向于高效价制程及更复杂表达增强技术之当前趋势下，翻译后瓶颈将变成蛋白生产中明显之速率限制步骤且因此促使对分泌工程化方法之关注日益增多。而且同等地可应用于所有真核细胞(包括昆虫细胞及酵母细胞)中的蛋白生产。作为第三重要特征，作为胞质因子之CERT并非未折迭蛋白反应之部分且因此并不涉及诱发蛋白翻译终止及(若未解决)导致细胞周期停滞或甚至细胞凋亡的细胞应力反应程序。相比之下，藉由在脂质运输中起独立作用，靶向CERT可在不伴有诱发细胞凋亡之情况下赋予增强的蛋白分泌。因此，在生产宿主细胞中过度表达CERT可能比基于XBP-1之基因工程化方法有利。第四，本发明中展示CERT之Serl32之突变削弱PKD对CERT之磷酸化，此使CERT脱离负向调节影响。同时，CERT经由DAG对PKD之正向刺激保留完整(图3A)。此发现将CERT置于PKD上游之信号路径中，PKD已被公开为与分泌运送后期阶段(亦即，自反面高尔基体网络运送至细胞膜)之调节紧密相关(Liljedahl等人，2001)。关于蛋白运送，此意谓CERT在ER之"下游"起作用，此使得与XBP-1或特异性ER驻留蛋白相比，CERT为操控之优选标把(图3B)。由于CERT甚至可影响分泌路径之最后步骤，因此可推测CERT之异源表达具有在不在更下游生成瓶颈之情况下增强分泌之潜力。据我们所知CERT为用于分泌路径之基因工程化以增强异源蛋白生产之目前最下游的作用标靶。总之，在无与生长抑制或细胞凋亡诱发应力反应之不利联系之情况下，脂质转移蛋白CERT对自ER至高尔基体及自高尔基体至细胞膜之分泌运送之影响使得CERT、CERT突变体及其它START家族蛋白成为用于旨在增强真核细胞分泌能力之基因工程化方法的极有吸引力及极有前景的标靶。应用本发明中所描述之CERT之靶向操控可用于广泛应用范围。详言之，可区分出两种基本方法(i)过度表达CERT或CERT衍生物和/或增强其活性以提高细胞之分泌运送能力，或(ii)降低CERT活性和/或表达作为基因治疗手段用以减少癌细胞增殖和/或侵袭。CERT过度表达的应用本发明描述一种藉由引入编码CERT、CERT突变体或START蛋白家族之其它蛋白之基因来产生用于异源蛋白生产之改良真核宿主细胞的方法。此将能够在基于真核细胞之生产过程中增加蛋白产率。因此，其将降低该等制程之商品成本且同时减少需要生产之批次数目来产生对于治疗性蛋白之研究试验、诊断、临床研究或市场供应所需之材料。另外，本发明将加快药物研发，因为产生用于临床前研究之足量材料常常为时间表中之关键12工作单元。本发明可用于增加产生用于诊断目的、研究目的(标靶鉴别、先导化合物鉴别、先导化合物最优化)之一种或若干种特异性蛋白或制造市售或临床研发之治疗性蛋白所用的所有真核细胞之特性。如本发明中所示，异源表达CERT不仅增强蛋白分泌，而且对细胞表面上之跨膜蛋白之丰度具有影响。抑制或降低CERT之表达？1起诸如运铁蛋白受体的细胞表面受体量显著减少(图8)。由于所分泌蛋白与跨膜蛋白共享相同分泌路径且在脂嚢泡中被同等地运送，因此此等数据强调CERT在调节分泌以及运送膜结合细胞表面受体中之重要性。因此，本文中所描述之方法亦可用于旨在表征细胞表面受体功能之学术及工业研究目的。举例而言，其可用于表面蛋白之生产及随后纯化、结晶和/或分析。此对于研发新的人类药物疗法至关重要，因为细胞表面受体为主要类别之药物标靶。此外，其可有利于研究与细胞表面受体相关联的细胞内信号转导复合物或分析部分上由可溶性生长因子与其在同一细胞或另一细胞上之相应受体之相互作用所介导的细胞间通信。减少/抑制CERT的应用在本发明中，我们提供证明CERT表达降低引起可溶性细胞外蛋白分泌减少以及细胞表面受体丰度降低。此使得CERT成为治疗性操控之有吸？1力的标革巴。正常健康细胞转化为癌细胞之标志之一为获得相对于外源性生长因子存在之独立性(Hanahan及Weinberg,2000)。与正常细胞相反，肿瘤细胞能够自身生产存活及增殖所必需之所有生长因子。除此自分泌机制以外，癌细胞常常展示其表面上生长因子受体之上调表达，此引起对自周围组织中的细胞所分泌之旁分泌作用生长及存活因子的反应增加。藉由靶向肿瘤细胞中之CERT(例如藉由使用siRNA方法)，可能以两种方式中断自分泌以及旁分泌生长刺激和/或存活机制(i)藉由减少生长因子运送及分泌，及(ii)藉由减少肿瘤细胞上相应生长因子受体之量。藉此两者生长刺激信号之量将减少且癌细胞感知此等信号及对此等信号作出反应之能力将降低。因此，抑制癌细胞中之CERT表达可展现为防止癌细胞增殖及存活之有效手段。另外，CERT可为抑制肿瘤侵袭及转移之有效治疗标靶。在大多数类型之人类癌症后期，原发性肿瘤产生先驱细胞，其移出、侵袭邻近组织且行进至其可成功建立新集落之远离位点，此称为癌转移。作为组织侵袭之先决条件，癌细胞表达一整套蛋白酶，该等蛋白酶使癌细胞能够经由周围健康组织迁移、越过基膜、进入血流且最终侵袭目标组织。一些此等蛋白酶系以膜结合蛋白形式表达，例如MT-MMP(Egeblad及Werb,2002)及ADAM(Blobel，2005)。由于蛋白酶本身在基质重塑、生长因子脱落及肿瘤侵袭中之关键作用，其被论述为癌症治疗之药物标靶(Overall及Kleifeld,2006)。我们假设抑制肿瘤细胞中之CERT表达和/或活性将减少标靶细胞表面上膜结合蛋白酶之量。此可降低或甚至削弱肿瘤细胞之侵袭能力以及其生长因子脱落之能力，从而导致肿瘤之侵袭及转移潜力降低。因此，靶向CERT可提供防止后期胂瘤形成，尤其防止良性/实性结节转化为侵袭性、转移性肿瘤之新颖方式。因此，对于治疗性应用而言，目标在于降低和/或抑制CERT之活性和/或表达。此可藉由用作人类治疗剂以藉由抑制CERT功能来治疗疾病之核苷酸组合物来达成，藉以药物包含经由结合CERTRNA之序列基元而特异性地抑制CERT之RNAi、siRNA或反义RNA。CERT活性/表达之降低/抑制亦可藉由含有结合并静默CERT基因启动子之核苷酸的药物来达成。另外，药物或药品可包含抑制CERT表达或活性之新的化学实体或肽或蛋白。在蛋白作为活性医药化合物的情况下，其可为(i)与CERT启动子结合的蛋白，藉此抑制CERT表达；(ii)与CERT或PKD结合的蛋白，藉此防止PKD与CERT结合且阻碍PKD对CERT之磷酸化；(iii)类似于CERT但并不实现CERT功能的蛋白，其意谓"显性负性"CERT变体；或(iv)充当CERT与PKD之骨架的蛋白，从而引起CERT与PKD不可逆地结合(—急定之PKD/CERT复合物)，其由于PKD对CERT之抑制性磷酸化及CERT自该复合物中之解离受阻而不具有功能性。发明简述本发明并不会由先前技术而显而易见。迄今，关于蛋白CERT所获得之唯一实验资料指出其在神经酰胺作为鞘磷脂前驱物自内质网运送至高尔基体中之作用。惟有本发明中所描述之数据产生CERT在真核细胞中在自高尔基体至细胞膜的蛋白运送中之作用的新颖工作模型。先前技术并未对藉由引入编码CERT或START域蛋白家族之另一成员之基因来增强真核细胞林中蛋白之分泌运送速率的可能性提供任何暗示。本发明之惊人及意外的工作4莫型鉴别CERT为新颖活体内PKD底物及高尔基体功能之关键调节因子。PKD在先前技术中已知。其为丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族，该家族包含三个结构相关成员PKDl/PKQi、PKD2及PKD3/PKQ)。PKD含有结合DAG之两个胺基封端锌指状半胱氨酸富含基元、反向调节PKD酶促功能之普列克底物蛋白同源(pleckstrinhomology,PH)域及羧基封端激酶域。三种PKD同功异型物定位于胞质、细胞核、高尔基复合体及细胞膜，其在该等位点调节自增殖、分化、细胞凋亡、细胞骨架重整及转移至嚢泡运输之范围内之各种细胞过程(论述于(Rykx等人，2003;Wang,2006)中)。迄今，仅已知少数生理性PKD底物，其包括神经元蛋白Kidins220、Ras效应因子RIN1、组蛋白脱乙酰基酶5、E-钙l占附蛋白及PI4KIII卩(Iglesias等人，2000;Jaggi等人，2005;Vega等人，2004;Wang等人，2002)。在TGN处，PKD与运送载体在去往细胞表面途中之分裂紧密相关(Liljedahl等人，2001;Yeaman等人，2004)。PKD因其半胱氨酸富含区域而被募集至TGN(Baron及Malhotra,2002;Hausser等人，2002;Maeda等人，2001)，在此处其经由PKCV介导之磷酸化被活化(azAnel及Malhotra,2005)。最近，鉴别出高尔基体之结构及功能中之关键参与者PI4KIII(3为此细胞器处之PKD底物(Hausser等人，2005)。PKD介导之PI4KIII卩在丝氨酸294处之磷酸化刺激其脂质激酶活性，从而使4-磷酸磷脂酰肌醇(PI(4)P)生产及水泡性口炎病毒G蛋白至细胞膜之运送增强(Hausser等人，2005)。蛋白激酶D(PKD)已被鉴别为反面高尔基体网络(TGN)处分泌运送之关键调节因子。PKD在TGN处之募集及活化由脂质二酰基甘油(DAG)介导，DAG之池由鞘磷脂合成酶自神经酰胺及磷脂酰胆碱产生。神经酰胺自内质网非嚢泡转移至高尔基复合体由脂质转移蛋白CERT介导。此描述于(例如)Hanada等人，2003,Nature,第426巻，803-809及Hanada2006，MolecularandCellularBiochemistry286,23-31以及相应专利申请案WO2005004898及EP1652530中。然而，在所有此等文献中Hanada均未展示或指出在生产用于诊断、研究或治疗目的的蛋白之方法中调节CERT表达或活性(更不必说其它START域蛋白)的暗示。另外，此等文献/专利申请案并未以任何方式描述在药物组合物中使用降低或完全阻断CERT表达或活性之阻断剂。事实是Hanada推断出使用CERT本身作为药物以促进神经酰胺运送。15然而，本发明鉴别CERT为新颖活体内PKD底物。PKD对丝氨酸132之磷酸化降低CERT在高尔基体膜处对其脂质标靶4-磷酸磷脂酰肌醇之亲和力且降低神经酰胺转移活性，从而鉴别PKD为脂质稳态(lipidhomeostasis)之调节因子。本发明亦展示CERT又对PKD活化及PKD依赖性蛋白货物运送至细胞膜至关重要。因此，PKD与CERT之互相依赖为维持高尔基体膜完整性及分泌运送之关键。图l:细胞内产物累积示三种制程(process)中补料分批发酵期间胞内产物的增加。用表达人IgG抗体的三种不同CHO生产者细胞克隆来进行补料分批发酵分别为制程A(圆形)、制程B(菱形)及制程M(三角形)。每隔一天，采集细胞样本，固定后，通过直接免疫荧光来检测抗体轻链。产物量用FACS测量，按照相对于第l天的量绘制曲线。图2:START域蛋白家族系谱集合(A)人START域蛋白、(B)它们的域构成(4TM,四个跨膜区；Pre,线粒体前序列；Thio，酰基-CoA硫酯酶)及(C)它们在蝇(fly)及虫(worm)中的同源物(取自(Soccio及Breslow,2003))。图3:CERT为高尔基体功能之关键调节因子、且在分泌路径中在XBP-1下游起作用(A)CERT与PKD在调节反馈回路中相连。图示当前工作假设，其中PKD被DAG活化，使CERT磷酸化。磷酸化CERT掩蔽PI(4)P，在其终点释放神经酰胺。神经酰胺在高尔基体处转化为鞘磷脂及DAG,DAG又为PKD活化所必需。CERT^畴酸化位点(S132A)的突变可中断此回路。(B)图示分泌蛋白从转录、翻译，经ER及高尔基体室直至细胞膜、并最终在那里而从细胞释放至培养基中的路径。这些箭头表示最近的旨在增强蛋白生产的基因改造方法。大多数努力集中于转录增强技术，少数集中于翻译工程化，目前据报导仅有三例靶向与ER中翻译后加工有关的蛋白(BiP、PDI及XBP-1)。CERT在分泌路径中在ER下游起作用，因此我们认为，它代表了在分泌制程后期进行改造的第一个标靶。图4:由PKD底物抗体来检测CERT细胞。在转染后24小时使细胞裂解，用抗Flag抗体^f吏CERT同功异型物(isoform)发生免疫沉淀。使免疫沉淀的蛋白经历SDS-PAGE,接着用PKD底物抗体进行免疫印迹(pMOTIF;上图)且在洗离(stripping)之后用抗Flag抗体进行免疫印迹(下图)。(B)用Flag-CERT表达质粒以及GFP-PKDlK612W(PKD-KD)或空载体来转染HEK293T细胞。如(A)所述藉由Western印迹法分析CERT。藉由用PKD特异性抗体进行免疫印迹来验证PKD-KD之表达(C20;下图)。(C)将C0S7细胞用Flag-CERT与PKDl-GFP表达质粒共转染，使其固定且用Flag特异性抗体染色(红色)。所示影像为若干共焦截面之重迭。比例尺，20,。图5:PKD使CERT之丝氨酸132磷酸化(A)用以产生PKD底物抗体及CERT中两个潜在PKD基元之肽序列的比对。(B)用编码经Flag标记之CERT野生型(WT)、CERT-S132A及CERT-S272A之表达质粒来转染HEK293T细胞。使细胞裂解且使CERT蛋白发生免疫沉淀且如图4中所描述藉由Westem印迹法分析。(C)在纯化PKD1不存在(-)及存在(+)下在含有[32P]-a-ATP之激酶緩沖液中将重组GST-Flag-CERT野生型(WT)及S132A融合蛋白培育30分钟。藉由SDS-PAGE分离蛋白且将其转移至膜。使用磷光影像器来分析放射性磷酸盐之并入(上图)，接着用Flag特异性抗体进行免疫印迹以验证CERT蛋白之等量装载。(D)在冷ATP存在下如(C)中所描述使重组CERT蛋白与纯化PKD1—起经受活体外激酶。用pMOTIF抗体进行免疫印迹，且在洗离后用Flag特异性抗体进行免疫印迹以验证CERT蛋白之等量装载。PKD1及CERT蛋白系以箭头标记，具有星号之条带系归因于非特异性结合。图6:CERT丝氨酸132之磷酸化调节PI(4)P结合及神经酰胺转移活性用编码经GFP标记之CERT野生型(WT,SEQIDNO.10和12)及小时藉由低渗裂解来收集细胞且在100.000xg下离心后回收胞质部分。将含有等量GFP荧光之样本用于(A)蛋白-脂质覆盖检定。将来自瞬时表达CERT变体之HEK293T细胞的胞质与以一定浓度梯度之不同磷酸肌醇点样膜一起培育且经由其GFP标记来检测结合的CERT蛋白。(B)将含有TNPPE及芘(pyrene)-神经酰胺之供体脂质体与IO倍过量之未标记接受体脂质体混合。60秒钟后，添加来自瞬时表达经GFP标记之CERT野生型(WT)、S132A或仅GFP(对照)的细胞的胞质且在395nm下记录芘荧光(激发340nm)。将光谱相对TritonX-100中之最大荧光及最大GFP荧光正规化。图7:CERT调节PKD活化及分泌运送(A)来自以经Flag标记之CERT野生型(SEQIDNO.10,12)或CERT突变体S132A(SEQIDNO.14)转染之HEK293T细胞之全细胞裂解产物的Western印迹图。分别用磷酸化特异性pS916PKD抗体(上图)、PKD特异性抗体(中图)及Flag特异性抗体(下图)来探测墨点以验证经Flag标记之CERT构建体之表达。(B)以Flag-ss-HRP及空载体(黑色条形图)、PKD1-GFP激酶失活型(KD，白色条形图)、Flag-CERT野生型(WT，阴影条形图)或Flag-CERT-S132A(深灰色条形图)共转染之HEK293T细胞之上清液中的HRP活性测量。培养基改变后在所指示时点测绘相对光单位(RLU)。值对应于三份样本之平均值，误差杆二SEM。(C)GFP-CERT(绿色)与顺面/中间高尔基体标记物GSM(红色)在COS7细胞中之共焦免疫焚光。所示影像为若干共焦截面之重迭。比例尺，20pm。(D)展示GFP-CERT(绿色)及HRP-Flag(红色)在COS细胞中之共定位之共焦影像的重迭。比例尺，20pm及5pm(放大)。图8:因RNA干扰之CERT下调抑制分泌运送(A)以模拟-(白色)、lacZ-(浅灰色=lacZ特异性siRNASEQIDNo9)或CERT特异性siRNA寡核苷酸(深灰色-siCERT#lSEQIDNo7及黑色=siCERT#2SEQIDNo.8)处理之COS7细胞之上清液中HRP活性的定量4企测。展示三个重复实验之相对光单位(RLU)，误差杆SEM。(B)用抗运铁蛋白受体抗体所探测之(A)的细胞裂解产物的Western印迹图。藉由使用抗微管蛋白特异性抗体来证实等量装载。图9:START域之共有关系共有性按照符合此共有序列的蛋白数目给出，而非按照符合的氨基酸的数目给出。即，对于80%共有序列而言，所比较的START域蛋白80。/。在特18定位置具有给定氨基酸，例如缩写为"h"的疏水性氨基酸。此共有序列通过使用基于WEB之程序"SMART"产生(亦参见Ponting&Aravind,1999,TIBS24，第130-132页)。(A)START域蛋白的80%共有序列(SEQIDNO28)。(B)已自START域蛋白之氨基酸比对推导出START域共有序列。比对包括50%、65%及80%共有序列。参见以下基于缩写之氨基酸分组及相应类别。类别关键残基醇oS,T脂肪族II,L，V任一者A,C,D,E,F，G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y芳族aF，H,W,Y4电荷cD,E,H,K,R疏水性hA，C,F,G,H,I，K，L,M,R,T,V,W，Y阴性-D,E极性pC,D,E,H,K,N,Q，R,S,T阳性+H，K,R小sA,C,D,G,N，P,S,T,V微小uA,G,S转换型(turnlike)tA，C，D,E,G,H，K,N,Q,R,S,T图10:引入CERT增加单克隆抗体生产将模拟(Mock)、CERT-WT或突变CERT-SA之表达构建体稳定？1入分泌人单克隆IgG型抗体之CHO生产细胞林中。接着如图11中(A)在连续储备培养物(serialstockculture)中及(B)在补料分批生产条件下测量转基因对此等稳定克隆中特异性IgG生产力之影响，其中对于各基因型n=3至4。误差杆指示标准差。展示三个独立实验的代表性结果。图ll:异源性CERT增加HSA分泌(A)在系列培养物中效价及比生产力(specificproductivity)提高。用空质粒("模拟")、CERT野生型(CERT-WT)或CERT突变体S132A(CERT-SA)稳定转染分泌人血清白蛋白(HSA)之CHO细胞。自所得稳定细胞群(每种基因型n=3),在3至5次连续传代期间测定HSA效价。对于各基因型计算HSA之比生产力(黑色条形图)及效价(灰色条形图)且将其以三个池之平均值绘图曲线。误差杆表示标准差。(B)及(C)使来自(A)的细胞在摇瓶中生长7天且自第3天起每24小时补料一次。在第3天、第5天及第7天采集细胞培养液之样本且使其经历重组HSA产物之效价测量。计算比生产力(B)及效价(C)且相对于发酵时间绘制曲线。比较以下细胞.'模拟(-口-)、CERT-WT(-A-)及CERT-SA细胞(-參-);误差杆表示来自每种基因型之三个稳定池的标准差。序列表的说明SEQIDNO1:人DNACERT-S132A的PCR1物SEQIDNO2:人DNACERT-S132Arev的PCR亏1物SEQIDNO3:人DNACERT隱S272A的PCR1物SEQIDNO4:人DNACERT-S272Arev的PCR亏1物SEQIDNO5:人DNACERT-138截短的PCR1物SEQIDNO6:人DNACERT-138截短rev的PCR1物SEQIDNO7:siRNA/DNAsiCERT-1SEQIDNO8:siRNA/DNAsiCERT-2SEQIDNO9:siRNA/DNAsiLacZSEQIDNO10:人:CERTcDNASEQIDNO11:人:CERT蛋白SEQIDNO12:人:CERTLcDNASEQIDNO13:人:CERTL蛋白SEQIDNO14:人:CERTS132AcDNASEQIDNO15:人:CERTS132A蛋白SEQIDNO16:人:START域CERTcDNASEQIDNO17:人:START域CERT蛋白SEQIDNO18:人:START域CERTLcDNASEQIDNO19:人:START域CERTL蛋白SEQIDNO20:人:StarD4cDNASEQIDNO21:人:StarD4蛋白SEQIDNO22:人:StarD5cDNASEQIDNO23:人:StarD5蛋白SEQIDNO24:人:StarD6cDNASEQIDNO25:人:StarD6蛋白SEQIDNO26:人:PCTPcDNASEQIDNO27:人:PCTP蛋白SEQIDNO28:START域共有序列(图9)实施方式磷酸化对蛋白之翻译后修饰为诱发调节酶活性、介导蛋白间相互作用或调节亚细胞定位之构型变化的常见机制。PKD为高尔基复合体处之关键调节因子，其中PI4KIII(3为迄今所鉴别出之唯一局部底物。为测试高尔基复合体定位之CERT蛋白可否充当PKD之底物，我们利用称为pMOTIF之磷酸化特异性底物抗体，其系对抗由PKD磷酸化之共有基元而产生(Doppler等人，2005)。用编码经Flag标记之CERT及CERTL的表达载体来转染HEK293T抗体进行Western印迹法来分析(图4A)。检测对应于CERT之分子量及更弱地对应于CERTY之分子量的pMOTIF信号(图4A)。经磷酸化之CER丁L同功异型物之较弱检测可能与其形成聚集体之已知行为有关，此行为可影响激酶之磷酸化位点可达性(Raya等人，2000)。为研究pMOTIF抗体对CERT之识别是否取决于PKD,我们使CERT连同PKD1之激酶失活型变体(K621W)—起在HEK293T细胞中表达。此突变体已展示定位于高尔基复合体且以显性负性方式抑制PI4KIIII3磷酸化(Hausser等人，2005)。非活性PKD之共表达破坏pMOTIF抗体对CERT之检测，从而表明pMOTIF信号实际上系归因于PKD介导之CERT磷酸化(图4B)。据认为脂质转移蛋白在MCS处起作用，MCS系形成于ER与TGN之间(Levine及Loewen,2006)，而PKD定位于此处。经Flag标了两种蛋白共定位于高尔基复合体处(图4C)。RNA干扰实验表明需要同时剔除PKD1及PKD2来减少CERT磷酸化，从而指示此两种同功异型物主要负责使CERT磷酸化，而PKD3表达为起较小作用(资料未展示)。此与先前报导之PKD1与PKD2之重迭底物特异性一致。举例而言，PKD1与PKD2均展示使PI4KII印磷酸化，而PKD3不能如此(Hausser等人，2005)。为鉴别CERT中之pMOTIF识别位点，我们搜寻以相对于丝氨酸或苏氨酸处于-5位之亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸残基及处于-3位之精氨酸为特征的潜在PKD共有基元。藉由定点诱变将匹配PKD共有基元且跨物种保守之处于132位及272位之两种丝氨酸(图5A)与丙氨酸交换。在HEK293T细胞中表达此等突变体且测试pMOTIF抗体之识别。有趣的是，丝氨酸132突变为丙氨酸破坏pMOTIF抗体对CERT之检测且引起电泳迁移率增加而指示磷酸化21损失，而S272A突变并不影响pMOTIF信号(图5B)。此表明丝氨酸132为由PKD底物抗体特异性识别之PKD磷酸化位点。为证实PKD能够直接使CERT中之此丝氨酸残基磷酸化，我们使用纯化之PKD1及生产于包含该蛋白之前138个氨基酸之大肠杆菌(E.coli)中的重组CERTGST融合蛋白进行活体外激酶检定。当在[y，P]-ATP存在下将截短野生型CERT融合蛋白与PKD1—起培育时，检测到并入放射性(图5C)。在CERT-S132A融合蛋白的情况下，此被显著削弱。进一步展示野生型而非CERT-S132A之活体外PKD磷酸化产生pMOTIF抗体之识别位点(图5D)。总之，此等结果证明CERT为真正的活体外及活体内PKD底物且鉴别丝氨酸132为CERT中之特异性PKD磷酸化位点。丝氨酸132与CERTPH域(氨基酸23-117)极紧密邻近，从而使得此位点上之磷酸化可能藉由增加局部负电荷而影响PI(4)P结合。因此，我们藉由进行蛋白-脂质覆盖检定来定量野生型CERT及CERT-S132A突变体之PI(4)P结合。此处，将来自瞬时表达CERT变体之HEK293T细胞的胞质与以一定浓度梯度之不同磷酸肌醇点样膜一起培育且经由其GFP标记来检测结合CERT蛋白。如先前报导，全长野生型蛋白展现与若干磷脂物质之较弱结合，但显示与PI(4)P之强相互作用(Hanada等人，2003;Levine及Munro,2002)。CERT-S132A与PI(4)P之结合可在与野生型蛋白相比低两倍至四倍之浓度下;险测到，从而表明CERT-S132A突变体对此磷脂之亲和力增力D(图6A)。此等数据共同暗示CERT在与高尔基复合体结合后即被PKD磷酸化。此接着减小CERT对PI(4)P之亲和力且藉此调节CERT与高尔基体膜之相互作用。CERT蛋白已显示用作脂质转移蛋白(Hanada等人，2003)。因此，我们研究CERT丝氨酸132之磷酸化是否影响其结合及转移神经酰胺于膜间之能力。为此，在HEK239T细胞中瞬时表达野生型CERT及CERT-S132A之GFP标记型式，且使用基于FRET之检定分析胞质部分之神经酰胺特异性脂质转移活性(图6B)。在此4企定中，使用含有芘(pyrene)标记之神经酰胺作为荧光供体及淬火量之头部基团标记之TNP-PE之单层小嚢泡(Olayioye等人，2005;Somerharju，2002)。当此等供体脂质体与过量之未标记接受体脂质体混合时，芘荧光之增加可忽略，显示最小自发之神经酰胺转移至接受体膜(数据未显示)。添加含有野生型CERT的胞质后，注意到荧光稳定增加，在使用经载体转染的细胞之对照胞质时观察不到此现象(图6B)。与野生型蛋白相比，CERT-S132A显示较高脂质转移速率，由芘荧光之较快增加而显见(图6B)。此表明CERT丝氨酸132之磷酸化通过减少该蛋白与膜之締合而下调神经酰胺转移活性。先前数据已显示PKD藉由磷酸化介导之PI4KIII卩活化来调节PI(4)P在高尔基复合体之含量(Hausser等人，2005)。有趣的是，PI4KIIII3对于ER与高尔基复合体之间神经酰胺之运送至关重要(Toth等人，2006)。因此，结合本文所提供之数据，PKD在维持高尔基体膜之脂质稳态中之双重作用可由控制CERT之结合速率(on-rate)(经由PI(4)P含量)及解离速率(off-rate)(经由直接磷酸化)显现。人，2003)。高尔基体定位之SM合成酶1(SMS1)利用神经酰胺及PC产生SM及DAG(Perry及Ridgway，2005),后者为PKD募集及活化之先决条件(Baron及Malhotra，2002)。阻断TGN处DAG生产之化合物抑制PKD与TGN膜之结合且干扰分泌运送(Baron及Malhotra，2002)。因此，神经酰胺自ER转移至TGN因CERT过度表达而增加将引起局部DAG池增多且可因此刺激PKD活性及分泌运送。为测试此假设，我们在HEK293T细胞中瞬时表达CERT野生型及CERT-S132A且分析内源性PKD之自磷酸化。如由使用磷酸化特异性PKD抗体分析所揭示，与对照物相比，CERT野生型与CERT-S132A两者之表达均提高PKD活性(图7A)。此展示PKD活化很可能由于神经酰胺传递增加及SM/DAG合成加强而受CERT蛋白调节。最近已描述脂质转移蛋白Nir2经由调节CDP-胆碱路径维持高尔基体处之DAG含量的相似功能(Litvak等人，2005)。RNAi介导之Mr2之剔除降低高尔基复合体处之DAG及PKD之含量且阻断分泌运送。有趣的是，此效应可藉由添加外源性C6-神经酰胺来挽救(Litvak等人，2005),从而指示神经酰胺在DAG合成及向高尔基复合体募集PKD中之关键作用。为解决CERT介导之PKD活化是否真正转化为分泌运送增强之问题，我们利用与信号序列(ss)融合之编码辣根过氧化酶之质粒。融合蛋白ss-HRP可用作组成性蛋白分泌之报导体(Bard等人，2006)。在对照细胞中，ss-HRP之分泌可在1小时内被检测到且随着时间增加(图7B)。共表达抑制货物蛋白(cargoprotein)分泌运送之激酶失活型PKDl(Hausser等人，2005;Liljedahl等人，2001)几乎完全削除ss-HRP分泌至上清液中。此证实在我们之检定中HRP系以PKD依赖性方式分泌。CERT野生型及CERT-S132A之共表达强烈增加所分泌HRP之量(图7B)。有趣的是，与对于CERT野生型蛋白所观测到之增加相比，我们对于CERT-S132A突变体仅可检测到微小分泌增加。此与CERT及CERT-S132A对PKD之可比性活化一致(图7A)，但未预料到CERT突变体之活体外脂质转移活性显著增强(图6B)。然而，神经酰胺之含量增加并非必定转化为同等DAG增加，因为DAG合成可能受限于PC之可用性及SM合成酶之活性。已知神经酰胺之累积影响高尔基体膜稳定性且诱发嚢泡分裂(Fukunaga等人，2000;Weigert等人，1999)。因此，我们研究CERT-S132A突变体之过度表达是否影响其定位和/或是否引起高尔基体之形态变化。已证明CERT与顺面/中间高尔基体标记物GS28共定位(Hanada等人，2003)。在COS7细胞中表达之经GFP标记之CERT的免疫荧光分析展示蛋白定位于GS28阳性高尔基体区域(图7C)。相比之下，除在高尔基复合体处与GS28之部分共定位以外，CERT-S132A突变蛋白显示分散性、点状染色。值得注意的是发现一些此等嚢泡结构含有货物蛋白ss-HRP,从而为此等结构真正代表高尔基体源运送载体提供证明(图7D)。此发现与由于神经酰胺含量局部增加而观测到之高尔基体膜结构之改变一致(Fukunaga等人，2000;Weigert等人，1999)。总之，我们已鉴别出CERT为PKD底物且为膜脂质生物发生与蛋白分泌之间的新颖关系提供证据。我们展示CERT藉由提供神经酰胺作为高尔基体膜处PKD活化因子DAG合成之底物而在嚢泡运送过程中起重要作用。我们进一步证明该系统系受负反馈回路紧密调节活性PKD使CERT丝氨酸132磷酸化，藉此减小CERT对其脂质标靶PI(4)P之亲和力以确保脂质自ER转移至高尔基体代谢区之连续循环。本发明之资料清楚地证明CERT之过度表达增强蛋白分泌。为研究相反情况是否亦成立(意谓CERT表达降低是否会引起分泌减少)，进行siRNA实验。3小时后检测HRP之活性且在两种对照细胞中展示相等可比性含量。相比之下，在已用CERT特异性siRNA寡核苷酸中之任一者处理的细胞中测量到HRP活性显著降低(图8)。此指示CERT含量减少引起细胞之HRP分泌减少且进一步强调CERT在分泌运送中之重要作用。有趣的是，不仅蛋白分泌，而且跨膜蛋白运铁蛋白受体之丰度亦受CERT减少影响(图8B)。当汇集来自图8A的细胞且在Westem印迹实验中用运铁蛋白受体特异性抗体探测溶解产物时，运铁蛋白受体之量明显剧烈减少，而在两种对照细胞中检测到相似运铁蛋白受体含量。此发现表明脂质转移蛋白CERT不仅与所分泌蛋白之运送相关联而且与膜驻留细胞表面蛋白之运送相关联。此可能并不令人惊讶，因为两种类型的蛋白系在脂嚢泡中自ER经由高尔基体被同等地运送至细胞膜且因此使用相同细胞出口路径，如我们在本发明中首次证明其系受CERT影响。本发明中所描述之关于高尔基复合体至细胞膜之分泌蛋白运送之调节的发现及所得新颖模型可应用于生物药蛋白制造。CERT之过度表达增加多种蛋白之生物药蛋白生产，该等蛋白诸如抗体、细胞激素、诸如红血球生成素或胰岛素之生长因子、诸如表皮生长因子之表面受体及膜结合蛋白酶。虽然本发明中所描述之方法通常可用于所有蛋白生产过程，但此策略之成功程度(如藉由所生产蛋白之量之增加所测量)当然可视目标蛋白之特定性质而定。将CHO或其它生产细胞用编码诸如CERT、StarD4或StarD5之START域蛋白或其突变体或衍生物之表达构建体转染。值得注意的是在表达不可磷酸化CERT突变体S132A的细胞中检测到最高效价。CERT及尤其突变CERT在CHO细胞中之异源表达可增强在瞬时转染水平上(例如)单克隆抗体的蛋白分泌。此可尤其适用于快速生产较小数量之医药研究及研发中所必需之药物候选物或药物标靶。在本发明之另一实施方式中，用与上述相同之DNA构建体来转染生产细胞抹且随后使其经历选择以获得稳定细胞群(cdlpool)。对于选择程序之后六次细胞培养继代，收集培养物上清液以分析目标蛋白之含量。在单克隆抗体的情况下，藉由ELISA来测定蛋白产物之浓度且将其除以细胞平均数目以计算比生产力。此外，最高值系见于携有CERT突变体的细胞群中。与模拟或未经转染的细胞相比，在含有START域构建体的细胞中，目标蛋白之表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果。在所述每一种设置中，在瞬时以及稳定转染之CHO细胞抹中START域蛋白之过度表达引起抗体、单细胞蛋白及表面受体之表达增强，从而指示诸如CERT或StarD4及StarD5之START域蛋白能够增强细胞在发酵条件下之比生产能力。定义一般实施方式"包含"或"所包含"涵盖更特定实施方式"由…组成"。另外，单数及复数形式并非以限制方式使用。本发明中所使用之术语具有以下含义。25术语"START域"代表类固醇合成急性调节蛋白(StAR)相关脂质转移(START)域。约200至210个氨基酸之此域最初被鉴别为脂质结合域(Soccio及Breslow，2003;Tsujishita及Hurley，2000)。START域之长度可视START域家族成员在116与250个氨基酸之间，或在180与223个氨基酸之间，或更特定言之在219与223个氨基酸之间变化。START域结构之最显著特征为用以结合大亲脂性化合物(如胆固醇)之单个分子之几乎延伸蛋白整个长度之主要疏水性通道。START域家族成员MLN64-START之结构解析揭示由九股扭转反平行(3-折迭及四个a-螺旋组成之a/p型结构(Tsujishita及Hurley，2000)。可见于各种真核蛋白中之域称为"经典START域"(CSD)，而对植物具特异性之相似域称为桦木过敏原START域(BA-START)。.术语"CERT"涵盖两种拼接形式之CERT:CERT(SEQIDNO.ll)及CERTL(SEQIDNo.13)。术语"CERT"另外涵盖衍生自核苷酸序列SEQIDNo.12之任何其它可能4并接形式之CERT。术语"CERT"进一步涵盖hCERT蛋白及其重组体，hCERT、hCERTA、PH蛋白、hCERTAMR蛋白及hCERTAST蛋白及另外PHhCERT蛋白、MRhCERT蛋白及SThCERT蛋白(亦参见EP1652530、(Hanada,2006)、(Hanada等人，2003))。一般而言，术语"衍生物"包括适用于实现本发明之目标用途之序列，此意谓该等序列介导细胞中之分泌运送增加。如在本发明中所使用，术语"衍生物"意谓与原始序列或其互4卜序列在序列上至少70。/。相同之多肽分子或核酸分子。优选地，多肽分子或核酸分子与原始序列或其互补序列在序列上至少80%相同。更优选地，多肽分子或核酸分子与原始序列或其互补序列在序列上至少90%相同。最佳为与原始序列或影响的多肽分子或核酸分子。序列差异可能基于不同生物体之同源序列中之差异。其亦可能基于藉由一或多个核香酸或氨基酸(优选为l、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)之取代、插入或缺失之序列靶向修饰。缺失、插入或取代突变体可使用位点特异性诱变和/或基于PCR之诱变技术来产生。相应方法由(Lottspeich及Zorbas,1998)以额外参考描述于第36.1章中。参考序列(在本发明中为(例如)START域SEQIDNo.16，17或18,19)之序列一致性可藉由使用(例如)标准"比对"算法，例如"BLAST"来测定((Altschul等人，1990);(Madden等人，1996);(Zhang及Madden,1997))。序列在其序列配合在一起时经比对且可藉助于标准"比对"算法来鉴别。另外，在本发明中，术语"衍生物"意谓与SEQIDNo.lO、12、14、16、18、20、22、24、26或与其片^:或书亍生物或与SEQIDNo.10、12、14、16、18、20、22、24、26之互补序列杂交的核酸分子(单股或双股)。优选在严格杂交条件及洗涤条件下进行杂交(例如，在65。C下在含有5xSSC之緩沖液中杂交；在42。C下使用0.2xSSC/0.1%SDS洗涤)。相应4支术净皮例示性描述于(Ausubel等人，2002)中。术语"衍生物"进一步意谓蛋白缺失突变体，尤其丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位置处之磷酸化突变体，PKD结合位点之缺失或CERTSerl32A突变。术语"活性"描述及定量蛋白在细胞内或在活体外检定中之生物功能。如何测量"活性"之实例描述于专利申请案EP1652530(Hanada等人)中，其检测自膜之神经酰胺释放促进活性。必须制备含有神经酰胺之脂膜以使其每样本含有以由衍生自蛋黄之磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺以4:1比率组成之混合脂质计12.5nCi(225pmol)之[软脂酰基-l-I4C]N-软脂酰基-D-赤-神经鞘胺醇(以下可称为I4C-神经酰胺)。因此，其神经酰胺浓度为2.5mg/mL。对于活性测量之一个样本而言，此脂膜之需要量为20pL。已将活性测量所需量之脂质分配于Eppendorf管中后，必须藉由喷雾氮气来使其干燥。此后，必须将緩冲液1[已添加50mMNaCl及lmMEDTA之20mMHepes-NaOH緩冲液(pH7.4)]添加至经干燥之脂膜，以使浓度变为2.5mg/mL。必须使用水浴型超声发生器[由Branson,Co.,Ltd.制造之型号221O]来进行緩和超声处理。超声处理必须在25。C下进行3分钟。接着必须将样本混合(旋转)30秒钟且接着将超声处理重复3分钟。将以此方式制备之脂膜用于神经酰胺释放检定中。如下进行脂膜之神经酰胺释放反应及其检测使用緩沖液2[已添加100mMNaCl及0.5mMEDTA之50mMHepes國NaOH緩冲液(pH7.4)]将CERT蛋白或其重组蛋白(在标准条件下，使用对应于450皮莫耳的蛋白量，其为供体膜中所含神经酰胺之2倍莫耳当量)混合直至30pL。此处，藉由添加20pL含有神经酰胺之脂膜起始反应。磷脂之最终浓度为lmg/mL。与总磷脂量相比，神经酰胺之所含比率为约0.3%。已在37。C下将此等之混合物培育30分钟后，将其在50,000xg下离心30分钟且使脂膜沉淀。在使用来自大肠杆菌之CERT27蛋白的情况下，大多数蛋白在此等离心条件下保留于上清液中。因此，当I4C神经酰胺与CERT蛋白结合时，其自脂膜释放且转移至上清液部分中。关于CERT促进神经酰胺释放之活性通过使用液体闪烁计数器测量上清液部分中1%之放射活性来计算测量"活性"之另种一可能为使用含有CERT之重组材料或细胞裂解产物之活体外神经酰胺转移检定。因此，如先前所描述来测量神经酰胺在SUV之间的蛋白介导转移(Olayioye等人，2005)。转移检定混合物含有供体嚢泡(2nmol脂质/ml)，其由猪脑脂质(AvantiPolarLipids)、芘标记之C!6-神经酰胺及2，4,6-三硝基苯基-磷脂酰乙醇胺(TNP-PE)(88.6:0.4:11mol。/o)构成，由P.Somerharju提供；及10倍过量之由猪脑脂质构成之接受体嚢泡。在添加来自瞬时表达GFP标记之CERT野生型及S132A蛋白之HEK293T细胞的75pg胞质之前及之后，在395nm(激发，345nm;狭缝宽度，4nm)下记录荧光强度(参见上文)。将荧光强度相对(i)添加TritonX-100(0.5。/。最终浓度)后获得之最大强度及(ii)最大GFP荧光正规化以说明不同蛋白表达含量。测量"活性"之另一可能为(例如)藉由在Western印迹法中使用抗磷酸化特异性抗体对CERTS132A进行磷酸化状态分析。全细胞提取物通过使细胞裂解于NP40提取緩冲液(NEB)[50mMTris(pH7.5)、150mMNaCl、1%NP40、1mM原钒酸钠、10mM氟化钠及20mM|3-甘油磷酸酯加上完全蛋白酶抑制齐'J]中来获得。藉由在16，000xg下离心10分钟使溶解产物澄清。将全细胞提取物或免疫沉淀蛋白煮沸于样本緩冲液中且使其经历SDS-PAGE。将蛋白点于聚偏氟乙烯膜(Roth)上。在含有0.1%吐溫20之PBS中用0.5。/。封闭试剂(Roche)封闭后，用磷酸化特异性抗体(诸如称为pMOTIF，对抗由PKD磷酸2005)。使用增强之化学发光检测系统(Pierce)用过氧化酶偶联的第二抗体使蛋白显影。测量"活性"之另一检定为(例如)针对模型蛋白、抗体或目标蛋白之分泌检定。用ss-HRP-Flag质粒分别与空载体、pEGFP-Nl-PKDlKD及编码CERT、任何START家族蛋白之CERT变体的质粒以1:6.5之比率来共转染细胞。转染24小时后，用无血清培养基洗涤细胞且藉由用ECL试剂培育澄清细胞上清液而在0、1、3及6小时后定量HRP分泌。测量系使用光度计(Lucy2,Anthos)在450nm下完成。测量"活性"之另一方式为藉由使用荧光神经酰胺类似物(例如Bodipy标记之C5-神经酰胺)，在完整细胞中进行追踪实验且测量高尔基复合体中蛋白之累积。800^丫@1^€5-神经酰胺在高尔基体与ER之间分布之定量在获取后使用Metamorph软件之线扫描功能来定量荧光神经酰胺之运送。在不同时间点所摄取之共焦照片中穿过细胞画线且测量细胞质中及细胞之高尔基复合体上之荧光强度。由高尔基体中之荧光强度除以细胞质中所测量之强度来计算"吸收率"。在37。C下培育25分钟后在对照细胞中测量到最大吸收率且将此值视为100%。定量由三个独立实验之数据获得，其中在12个不同时间点内摄取共焦照片且在各时间点分析7个细胞。术语"生产力"或"比生产力(specificproductivity)"描述在规定时间内由规定数目的细胞所生产之特异蛋白的量。因此，比生产力为细胞表达/合成/生产目标蛋白之能力的定量量度。在工业制造之情形下，比生产力通常被表示为每细胞每天所生产之以皮克为单位的蛋白量("pg/细胞^^天"或"pcd")。测定所分泌蛋白之"比生产力"之一种方法为藉由酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测量分泌至培养基中之目标蛋白之量。为达成此目的，将细胞以规定密度接种于新鲜培养基中。在规定时间后，例如在24、48或72小时后，釆集细胞培养液之样本且使其经历ELISA测量以测定目标蛋白之效价。如何测量细胞之"比生产力"之另一实例通过均相时差式荧光(HTRF0)检定来提供。细胞内、膜相关或跨膜蛋白的细胞"生产力"亦可藉由Westem印迹法来检测及定量。首先洗涤细胞且随后使其于含有诸如Triton-X、NP-40或SDS之清洁剂或者高盐浓缩物之緩冲液中溶解。接着使细胞裂解产物内的蛋白经SDS-PAGE按照尺寸分离，转移至尼龙(nylon)膜，随后在此处检测目标蛋白且藉由使用特异性抗体来显影。测定细胞之"比生产力"之另一方法为藉由荧光标记的对抗目标蛋白而产生之抗体来免疫性检测目标蛋白且在流式细胞仪中定量荧光信号。在细胞内蛋白的情况下，首先将细胞固定于(例如)聚曱醛緩冲液中，且接着使其透性化以允许检测抗体渗入细胞中。细胞表面蛋白无需预先固定或透性化即可在活细胞上定量。细胞之"生产力"可另外藉由测量诸如绿色荧光蛋白(GFP)之报导蛋白之表达来间接测定，该报导蛋白系以与目标蛋白之融合蛋白形式或自与目标蛋白相同之mRNA以双重、三重或多重表达单元之部分形式表达。术语"生产力之增强/提高"包含提高/增强细胞之比生产力之方法。若在所研究的细胞中生产力高于各别对照细胞且若此差异具有统计学显著性，则比生产力提高或增强。所研究的细胞可为经处理、经转染或经基因修饰的细胞之异源群体或克隆化细胞林，未经处理、未经转染或未经小爹饰的细胞可充当对照细胞。如本发明中所使用，术语"抑制剂"或"抑止剂"意谓起到抑制或抑止START域蛋白(如CERT)之表达或活性之作用的任何分子。该术语包括小化合物；核酸，诸如反义DNA、反义RNA或siRNA;阻断CERT转录及翻译之单链抗体及蛋白；以及干扰START域蛋白(诸如CERT)之脂质结合之肽或蛋白。在本发明之含义中，"宿主细胞"为诸如仓鼠细胞的细胞，优选为BHK21、BHKTK-、CHO、CHO画Kl、CHO-DUKX、CHO-DUKXBl及CHO-DG44细胞或该等细胞株中任一者之衍生物/子代。尤其优选为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-Kl及BHK21,且甚至更优选为CHO-DG44及CHO-DUKX细胞。在本发明之另一实施方式中，宿主细胞亦意谓鼠科骨髓瘤细胞，优选为NS0及Sp2/0细胞或该等细胞抹中任一者之衍生物/子代。在本发明之含义中亦可使用彼等细胞之衍生物/子代，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、猴及啮齿动物细胞林之其它哺乳动物细胞，或包括G旦不限于)酵母、昆虫及植物细胞之真核细胞，尤其用于生产生物药蛋白。表l:真核生产细胞株<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>CHO-DUKXATCCCRL-9096(=CHOduk-,CHO/dhfr-)CHO-DUKXBllATCCCRL掘0CHO-DG44(Urlaub等人，1983)CHOPro-5ATCCCRL-1781V79ATCCCCC-93B14AF28-G3ATCCCCL-14HEK293ATCCCRL-1573COS陽7ATCCCRL-1651U266ATCCTIB-196HuNSlATCCCRL-8644CHLECACC第87111906号宿主细胞最佳系在无血清条件下及视情况在不含源自动物之任何蛋白/肽之培养基中建立、调适及完全培养。诸如哈姆F12(Ham'sF12)(Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640(Sigma)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)(DMEM;Sigma)、最低必需培养基(MEM;Sigma)、伊思柯夫改良杜尔贝科培养基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium)(IMDM;Sigma)、CD-CHO(Invitrogen,Carlsbad,CA)、CHO-S(Invtirogen)、无血清CHO培养基(Sigma)及无蛋白CHO培养基(Sigma)之市售培养基为例示性适当营养溶液。该等培养基中之任一者均可视需要补充多种化合物，其实例为激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、表皮生长因子、类胰岛素生长因子)、盐(诸如氯化钠、磷酸钙、磷酸镁)、緩冲液(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷、胸苦)、麸胺酰胺、葡萄糖或其它等效能量来源、抗生素、痕量元素。亦可包括本领域技术人员应已知适当浓度之任何其它必需补充剂。在本发明中，优选使用无血清培养基，但补充适量血清之培养基亦可用于培养宿主细胞。对于表达可选择基因之经基因修饰细胞之生长及选择，将合适选择剂添加至培养基中。术语"蛋白"可与氨基酸残基序列或多肽互换使用，且系指任何长度之氨基酸之聚合物。此等术语亦包括经由包括(但不限于)糖基化、乙酰化、磷酸化或蛋白加工之反应而被翻译后修饰的蛋白。可在分子维持其生物功能活性的同时在多肽结构中进行修饰及改变，例如与其它蛋白融合、氨基酸序列取代、缺失或插入。举例而言，可在多肽或其基本核酸编码序列中进行特定氨基酸序列取代且蛋白可获得相似特性。31术语"多肽"意谓具有10个以上氨基酸之序列且术语"肽"意谓至多10个氨基酸长度之序列。本发明适合于产生用于生产生物医药多肽/蛋白之宿主细胞。本发明尤其适合于由展示增强细胞生产力的细胞以高产率表达许多不同目标基因。"目标基因"(GOI)、"所选序列"或"产物基因"在本文中具有相同含义且系指编码目标产物或"目标蛋白"之任何长度之多核苷酸序歹'J，其亦藉由术语"所要产物"被提及。所选序列可为全长或截短基因、融合或经标记基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段，优选为cDNA。其可为自然序列，亦即天然产生形式，或可视需要经突变或另外修饰。此等修饰包括密码子最优化以最优化所选宿主细胞中之密码子选择、人源化或标记。所选序列可编码分泌、细胞质、细胞核、艇结合或细胞表面多肽。"目标蛋白"包括蛋白、多肽、其片段、肽，其所有均可在所选宿主细胞中表达。所要蛋白可为(例如)抗体、酶、细胞激素、淋巴激素、教附分子、接受体及其衍生物或片段，及可充当促效剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途之任何其它多肽。所要蛋白/多肽之实例亦在下文中给出。在诸如单克隆抗体之较复杂分子的情况下，GOI编码两条抗体链中之一或两者。"目标产物"亦可为反义RNA。"目标蛋白"或"所要蛋白"为以上提及之彼等。尤其，所要蛋白/多肽或目标蛋白为(例如，但不限于)胰岛素、类胰岛素生长因子、hGH、tPA，细胞激素，诸如介白素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-13、IL画14、IL-15、IL陽16、IL-17、IL-18,干扰素(IFN)a、IFN卩、IFNy、IFNco或IFNt，肿瘤坏死因子(TNF)，诸如TNFa及TNF卩、TNFy，TRAIL;G-CSF、GM-CSF、M國CSF、MCP-1及VEGF。亦包括生产红血球生成素或任何其它激素生长因子。本发明之方法亦可有利地用于生产抗体或其片段。该等片段包括(例如)Fab片段(抗原结合片段=Fab)。Fab片段由经相邻恒定区结合在一起之两条链之可变区组成。此等片段可由习知抗体藉由蛋白酶消化(例如用木瓜蛋白酶)而形成，但相似Fab片段亦可同时藉由基因工程化来生产。其它抗体片段包括F(ab')2片段，其可藉由使用胃蛋白酶的蛋白裂解来制备。目标蛋白优选系以分泌多肽形式自培养基回收，或若在无分泌信号之情况下表达，则其可自宿主细胞裂解产物回收。需要以获得目标蛋白之大体上均质制剂之方式来自其它重组蛋白及宿主细胞蛋白纯化目标蛋白。作为第一步骤，自培养基或溶解产物移除细胞和/或微粒细胞碎片。此后，(例如)藉由在免疫亲和或离子交换管柱上分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、Sephadex层析法、硅石或阳离子交换树月旨(诸如DEAE)上之层析法自污染性可溶蛋白、多肽及核酸纯化目标产物。一般而言，教示本领域技术人员如何纯化由宿主细胞异源表达的蛋白的方法为本领域熟知。该等方法(例如)由(Harris及Angal，1995)或(RobertScopes,1988)描述。使用基因工程化方法，可生产仅由重链之可变区(VH)及轻链之可变区(VL)组成的缩短抗体片段。此等片段被称为Fv片段(可变片段=可变部分之片段)。由于此等Fv片段缺少经由恒定链之半胱氨酸之两条链之共价键结，因此Fv片段通常经稳定化。有利的为重链之可变区与轻链之可变区经由(例如)10至30个氨基酸，优选15个氨基酸之短肽片段连接。以此方式，获得由经肽连接子连接之VH及VL组成之单股肽链。此类抗体蛋白称为单链Fv(scFv)。先前技术中已知之此类scFv抗体蛋白之实例描述于(Huston等人，1988)中。近年来，已针对制备多聚体衍生物形式之scFv研发出各种策略。此意欲尤其产生具有改良之药物动力学及生物分布特性以及具有增加之结合亲和力的重组抗体。为达成scFv之多聚化，将scFv制备为具有多聚化域之融合蛋白。多聚化域可为(例如)IgG之CH3区或巻曲螺旋结构(螺旋构造)，诸如亮氨酸拉链域。然而，亦存在其中将scFv之VH/VL区之间的相互作用用于多聚化之策略(例如，双功能抗体(diabodies)、三功能抗体(tribodies)及五功能抗体(pentabodies))。提到双功能抗体时，本领域技术人员是指，二{介同二聚体scFv衍生物。scFv分子中之连接子缩短至5至10个氨基酸引起其中发生链间VH/VL重迭之同二聚体形成。另外，可藉由并入二硫4定桥而使双功能抗体稳定化。先前技术之双功能抗体-抗体蛋白之实例可见于(Perisic等人，1994)中。提到微型抗体(minibody)时，本领域技术人员是指，二价、同二聚体scFv衍生物。其由融合蛋白组成，该融合蛋白含有免疫球蛋白，优选IgG,更优选lgGl之CH3区作为二聚化区，且该二聚化区经由铰链区(例如，亦来自IgG1)及连接子区与scFv连接。先前4支术之孩么型抗体-抗体蛋白之实例可见于(Hu等人，1996)中。提到三功能抗体时，本领域技术人员是指，三价均三聚体scFv衍生物(Kortt等人，1997)。ScFv衍生物中VH-VL无需连接序列而直接融合时，这种衍生物导致形成三聚体。提到"骨架蛋白(scaffoldprotein)"时，本领域技术人员是指，藉由基因克隆或藉由与另一蛋白或与具有另一功能的蛋白的一部分共翻译加工而偶联之任何功能域。本领域技术人员亦将熟悉具有二价、三价或四价结构且衍生自scFv之所谓微型抗体。多聚化通过二聚体、三舉体或四聚体巻曲螺旋结构进行(Lovejoy等人，1993;Pack等人，1993;Pack等人，1995)。就定义而言，引入宿主细胞中之任何序列或基因，即使所引入序列或基因与宿主细胞中之内源序列或基因相同时，仍被称作相对于宿主细胞之"异源序列"或"异源基因"或"转基因"。因此，"异源"蛋白为自异源序列表达的蛋白。异源基因序列可藉由使用"表达载体"，优选真核生物且甚至更优选哺乳动物表达载体引入标靶细胞中。用以建构载体之方法为本领域技术人员熟知且描述于各种公开案中。详言之，在(Sambrook等人，1989)及其中所引用之参考文献中相当详细地论述了用于建构合适载体之技术，包括对诸如启动子、强化子、终止及多聚腺噤呤信号、选择标记物、复制起点及拼接信号之功能组件之描述。载体可包括(但不限于)质粒载体，噬菌粒、粘粒、人工/微染色体(例如，ACE),或病毒载体，诸如杆状病毒、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、反转录病毒、噬菌体。真核表达载体通常亦将含有促进载体在细菌中繁殖的原核序列(诸如复制起点)及用于在细菌中选择之抗生素抗性基因。含有可操作地连接多核苷酸之克隆位点之多种真核表达载体为本领域熟知且其中一些可购自诸如Stratagene(LaJolla，CA);Invitrogen(Carlsbad,CA);Promega(Madison，WI)或BDBiosciencesClontech(PaloAlto，CA)之公司。在一优选实施方式中，表达载体包含至少一个作为编码目标肽/多肽/蛋白之核苦酸序列之转录及翻译所必需之调节序列的核酸序列。如本文中所使用，术语"表达"系指宿主细胞内异源核酸序列之转录和/或翻译。所要产物/目标蛋白在宿主细胞中之表达含量可基于细胞中所存在34之相应mRNA之量，或如本发明实例中由所选序列编码之所要多肽Z目标蛋白之量来测定。举例而言，自所选序列转录之mRNA可藉由北方墨点杂交、核糖核酸酶RNA保护、原位杂交细胞RNA或藉由PCR来定量(参见最新(Sambrook等人，1兆9);(Ausubel等人，2002))。由所选序列编码的蛋白可藉由多种方法来定量，例如藉由ELISA、藉由Western印迹法、藉由》丈射免疫分析、藉由免疫沉淀、藉由检定蛋白之生物活性、藉由将蛋白免疫染色接着进行FACS分析(参见最新(Sambrook等人，I989);(Ausubel等人，2002))或藉由均相时差荧光(HTRF)试验。用多核苷酸或表达载体"转染"真核宿主细胞而产生经基因修饰的细胞或转基因细胞可藉由本领域熟知及描述(例如)于最新(Sambrook等人，1989)或(Ausubel等人，2002)中的任何方法来进行。转染方法包括(但不限于)脂质体介导之转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(诸如DEAE-葡聚糖)介导之转染、原生质体融合、病毒感染及显微注射。优选地，转染为稳定转染。提供异源基因在特定宿主细胞抹及细胞型中之最佳转染频率及表达的转染方法受到欢迎。合适方法可藉由常规程序来判定。对于稳定转染物而言，将构建体整合于宿主细胞之基因组或人工染色体/微染色体中或游离定位以致稳定地保持于宿主细胞中。除非另有指示，否则本发明之实践将采用此项技术者所熟习的细胞生物学、分子生物学、细胞培养、免疫学及其类似学科之习知技术。此等技术充分揭示于当前文献中。例如参见Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology(1987，最杀斤片反)；Brown编，EssentialMolecularBiology,IRLPress(1991);Goeddel编，GeneExpressionTechnology,AcademicPress(1991);Bothwell等人编，MethodsforCloningandAnalysisofEukaryoticGenes，BartlettPubl.(1990);Wu等人编，RecombinantDNAMethodology,AcademicPress(1989);Kriegler,GeneTransferandExpression,StocktonPress(1990);McPherson等人，PCR:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress(1991);Gait编，OligonucleotideSynthesis(1984);Miller及Calos编，GeneTransferVectorsforMammalianCells(1987);Butler编,MammalianCellBiotechnology(1991);Pollard等人编，AnimalCellCulture,HumanaPress(19卯)；Freshney等人编，CultureofAnimalCells,AlanR.Liss(1987);Studzinski编，CellGrowthandApoptosis,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPresss(1995);Melamed等人编,FlowCytometryandSorting,Wiley-Liss(1990》CurrentProtocolsinCytometry,JohnWiley&Sons,Inc.(最新版)；Wirth及Hauser，GeneticEngineeringofAnimalsCells,于Biotechnology第2巻，Piihler编，VCH,Weinheim663-744中；系列MethodsofEnzymology(AcademicPress,Inc.),及Harlow等人编，Antibodies:ALaboratoryManual(1987)。实施方式本发明涉及在细胞中生产目标异源蛋白之方法，其包含提高具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的表达或活性，及实现该目标蛋白之表达。在本发明之一优选实施方式中，该方法特征在于异源蛋白为膜蛋白或分泌蛋白。在本发明之一特定实施方式中，该方法之特征在于START域蛋白为哺乳动物START域家族成员，诸如PCTP(SEQIDNO.27)、StarD7、GPBP、StarD10、StarD8、StarD13、DLC-1、StarD4(SEQIDNO.21)、StarD6(SEQIDNO.25)、StarD5(SEQIDNO.23)、MLN64、StAR、THEA-2、CACH或StarD9或其衍生物或突变体。在本发明之另一特定实施方式中，该方法之特征在于START域蛋白系以受ER应力诱导为特征和/或在结构上以系仅由START域组成为特征，诸如StarD4(SEQIDN0.21)、StarD5(SEQIDNO.23)、StarD6(SEQIDNO.25)或磷脂酰胆碱转移蛋白(PCTP)(SEQIDNO.27)。在本发明之另一特定实例中，该方法之特征在于START域蛋白系选自由CERT(SEQIDNO.11或13)、StarD4(SEQIDNO.21)及StarD5(SEQIDNO.23)組成之群。在本发明之另一实施方式中，该方法之特征在于START域蛋白为StarD6(SEQIDNO.25)。在一优选实施方式中，StarD6由具有SEQIDNO.24之核香酸编码。在本发明之一优选实施方式中，该方法之特征在于START域包含至少CERTL(SEQIDNO.19)之219个氨基酸START域、或至少CERT及CERTSI32A(SEQIDNO.17)之223个氨基酸START域、或至少StarD4(SEQIDNO.3621)之START域或至少StarD5(SEQIDNO.23)之START域或其衍生物或突变体。在本发明之一尤其优选实施方式中，该方法之特征在于START域蛋白为神经酰胺转移蛋白CERT(CERT=SEQIDNO.II或CERTl-SEQIDNO.13)或其衍生物或突变体。在本发明之另一特定实施方式中，该方法之特征在于START域蛋白为突变的神经酰胺转移蛋白CERT且该突变使CERT之任一丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位置处之磷酸化位点无能和/或缺失。在本发明之另一特定实施方式中，该方法之特征在于START域蛋白为突变的神经酰胺转移蛋白CERT且该突变使CERT位置132处的蛋白激酶D(PKD)磷酸化位点无能和/或缺失。在本发明之一尤其优选实施方式中，该方法之特征在于突变CERT为CERTS132A(SEQIDN0.15)。在本发明之另一实施方式中，该方法之特征在于与表达该目标蛋白之对照细胞相比，该方法使该细胞中该目标蛋白之比细胞生产力提高，但其中该对照细胞并未使具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的表达或活性提高。在本发明之另一特定实施方式中，该方法之特征在于生产力提高约5%至约10%、约11%至约20%、约21%至约30%、约31%至约40%、约41%至约50%、约51%至约60%、约61%至约70%、约71%至约80%、约81%至约90%、约91°/。至约100°/。、约101%至约149%、约150%至约199°/。、约200%至约299%、约300%至约499%或约500%至约1000%。在本发明之一优选实施方式中，该方法之特征在于该细胞为真核细胞，诸如酵母、植物、虫、昆虫、禽类、鱼类、爬虫类或哺乳动物细胞。在本发明之一特定实施方式中，该方法之特征在于该细胞为动物细胞。在本发明之另一特定实施方式中，该方法之特征在于该细胞为诸如线虫之后生动物细胞。在本发明之另一特定实施方式中，该方法之特征在于该细胞为诸如黑腹果蝇(Dmyop/2z7awe/""ogaWer)之两侧对称动物细胞。在本发明之另一实施方式中，该方法之特征在于该细胞为脊推动物细胞，诸如禽类、鱼类、爬虫类或哺乳动物细胞。在本发明之一特定实施方式中，该方法之特征在于该细胞为人类细胞，诸如人类骨髓瘤细胞抹U266、HEK293、HeLa、HepG2或HT1080。在本发明之一优选实施方式中，该方法之特征在于该细胞为啮齿动物细胞，诸如鼠科NSO、Sp2/0或Ag8653细胞、YO或YB2.0。在本发明之另一实施方式中，该方法之特征在于该真核细胞为哺乳动物细月包。在本发明之一特定实施方式中，该方法之特征在于该哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)、猴肾CV1、猴肾COS、人类晶状体上皮PER,C6TM、人类胚肾、HEK293、幼仓鼠肾、非洲绿猴肾、人类子宫颈癌、犬肾、布法罗大鼠肝、人类肺、人类肝、小鼠乳腺肿瘤或骨髓瘤细胞、犬、猪或猕猴细胞、大鼠、兔、猫、山羊细胞，优选为CHO细胞。在本发明之一优选实施方式中，该方法之特征在于该CHO细胞为CHO野生型、CHOKl、CHODG44、CHODUKX-Bll、CHOPro-5，优选为CHODG44。在本发明之一特定实施方式中，该方法之特征在于目标蛋白为膜蛋白或分泌蛋白。在本发明之一优选实施方式中，该方法之特征在于目标蛋白为抗体或抗体片段。在本发明之另一优选实施方式中，该方法之特征在于抗体为单克隆、多克隆、哺乳动物、鼠科、嵌合、人源化、灵长类化、灵长类、人类抗体或抗体片段或其衍生物，诸如抗体、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链及重链、Fab、F(ab')2、Fc、Fc-Fc融合蛋白、Fv、单链Fv、单域Fv、四价单链Fv、二硫键连接之Fv、域缺失抗体、孩i型抗体、双功能抗体，或以上片段之一与另一肽或多肽、Fc-肽融合物、Fc-毒素融合物、骨架蛋白之融合多肽。本发明进一步涉及增加细胞中目标膜蛋白或分泌蛋白之分泌的方法，其包含表达该目标蛋白及表达具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白。本发明进一步涉及在细胞中生产目标膜蛋白或分泌蛋白之方法，其包含提高具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的表达，及实现该目标蛋白之表达，其中可逆转顺序或步骤a及b。在本发明之一特定实施方式中，该方法之进一步特征在于步骤a)系在步骤b)之前进行。在本发明之另一特定实施方式中，该方法之进一步特征在于步骤a)与步骤b)系同时进行。在本发明之另一实施方式中，该方法之进一步特征在于步骤b)系在步骤a)之前进行。在本发明之一优选实施方式中，该方法进一步包含回收目标蛋白之额外步骤。在本发明之一尤其优选实施方式中，该方法进一步包含分离并纯化目标蛋白之额外步骤。在本发明之一特定实施方式中，该方法包含藉由用编码具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸转染细胞来提高具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的表达。在本发明之一特定实施方式中，该方法包含用编码具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的第一多核苷酸来转染该细胞及用编码目标蛋白之第二多核苦酸来转染该细胞。在本发明之一特定实施方式中，该方法之START域蛋白系以受ER应力诱导为特征和/或在结构上系以除START域之外不具有其它结构基元为特征，诸如StarD4(SEQIDN0.21)、StarD5(SEQIDNO.23)、StarD6(SEQIDNO.25)或PCTP(SEQIDNO.27)。在本发明之一个优选实施方式中，该方法包含提高具有含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域的氨基酸序列的蛋白或其衍生物或突变体的表达，优选通过用编码具有含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域的氨基酸序列的蛋白或其衍生物或突变体之第一多核苦酸转染该细胞，其中该提高系与未经转染的细胞比较测量，用编码目标蛋白之第二多核苷酸来转染该细胞。在本发明之一个优选实施方式中，该方法之特征在于在步骤a)及b)中所表达的蛋白并不相同。本发明进一步关于一种在细胞中生产目标膜蛋白或分泌蛋白之方法，其包含提高具有含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域的氨基酸细胞中之表达。本发明另外关于一种在细胞中生产目标膜蛋白或分泌蛋白之方法，其包含提高具有含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域的氨基酸序蛋白。在本发明之一特定实施方式中，该方法之特征在于与先前用编码目标蛋白之多核苷酸转染之对照细胞相比，该方法使该细胞中该目标蛋白之比细胞生产力提高，但其中该对照细胞并未使具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的表达提高。在本发明之一特定实施方式中，该方法之特征在于目标蛋白为穿过高尔基复合体的蛋白。本发明进一步涉及提高细胞中目标膜蛋白或分泌蛋白之比细胞生产力的方法，其包含将一或多个包含编码至少两种多肽之核酸序列之载体系统引入细胞中，其中第一多核芬酸编码具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白且第二多核香酸编码目标蛋白，且其中目标蛋白及具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白被该细胞表达。本发明另外涉及提高在细胞中表达目标膜蛋白或分泌蛋白的细胞之转染效率的方法，其包含用编码具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的第一多核普酸来转染该细胞，随后用编码目标蛋白之第二多核苦酸来转染该细胞，其中该第一及第二多核苷酸系位于不同载体系统上。在另一实施方式中，本发明涉及提高细胞之转染效率的方法，其包含转染报导基因之额外步骤，该报导基因诸如GFP、YFP、HRP、SEAP或LacZ，其可与目标蛋白融合，位于同一表达构建体或分离质粒上。在一优选实施方式中，本发明涉及提高细胞之转染效率的方法，其包含藉由检测目标蛋白或表达报导基因来检测和/或测量转染效率的额外步骤。本发明进一步涉及表达载体，其包含两种多肽，编码具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的第一多核苷酸及编码目标蛋白之第二多核苷酸。在本发明之一特定实施方式中，表达载体之特征在于START域蛋白为哺乳动物START域家族成员，诸如PCTP(SEQIDNO.27)、StarD7、GPBP、StarDlO、StarD8、StarD13、DLC-1、StarD4(SEQIDNO.21)、StarD6(SEQIDNO.25)、StarD5(SEQIDNO.23)、MLN64、StAR、THEA-2、CACH或StarD9或其衍生物或突变体。在本发明之在另一实施方式中，表达载体之特征在于START域蛋白为神经酰胺转移蛋白CERT(CERT=SEQIDNO.II或CERTl-SEQIDNO.13)或其衍生物或突变体。在本发明之一特定实施方式中，表达载体之特征在于突变的CERT为CERTS132A(SEQIDNO.15)。在本发明之一特定实施方式中，表达载体之特征在于该第一多核苷酸提高细胞中经由分泌路径的蛋白运送。在本发明之一特定实施方式中，表达载体之特征在于START域蛋白为突变的神经酰胺转移蛋白CERT且该突变使CERT蛋白内之任一丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位置处之磷酸化位点无能和/或缺失。在本发明之另一实施方式中，表达载体之特征在于START域蛋白为突变的神经酰胺转移蛋白CERT且该突变使CERT位置132处的蛋白激酶D(PKD)磷酸化位点无能和/或缺失。本发明进一步涉及包含本发明的表达载体的细胞。在本发明之一特定实施方式中，细胞之特征在于该细胞为真核细胞，漆如酵母、植物、虫、昆虫、禽类、鱼类、爬虫类或哺乳动物细胞。在本发明之一特定实施方式中，细胞之特征在于该真核细胞为哺乳动物细胞。在本发明之一特定实施方式中，细胞之特征在于该哺乳动物细胞为中国仓鼠印巢(CHO)、猴肾CV1、猴肾COS、人类晶状体上皮PER,C6TM、人类胚肾、HEK293、幼仓鼠肾、非洲绿猴肾、人类子宫颈癌、犬肾、布法罗大鼠肝、人类肺、人类肝、小鼠乳腺肿瘤或骨髓瘤细胞、犬、猪或猕猴细胞、大鼠、兔、猫、山羊细胞，优选为CHO细胞。在本发明之一特定实施方式中，细胞之特征在于该CHO细胞为CHO野生型、CHOKl、CHODG44、CHODUKX-Bll、CHOPro-5，优选为CHODG44。在本发明之一特定实施方式中，细胞之特征在于该细胞为动物细胞，优选为诸如线虫之后生动物细胞。在本发明之另一实施方式中，细胞之特征在于该细胞为诸如黑腹果蝇之两侧对称动物细胞；优选为脊推动物细胞，41诸如禽类、鱼类、爬虫类或哺乳动物细胞。在本发明之一特定实施方式中，细胞之特征在于该真核细胞为哺乳动物细胞，优选为诸如人类骨髓瘤细胞抹U266、HEK293、HeLa、HepG2或HT1080之人类细胞，更优选为诸如鼠科NSO、Sp2/0或Ag8653细胞、YO或YB2.0之啮齿动物细胞。本发明还涉及藉由所描述方法中之任一者所生产之目标蛋白，优选为抗体。本发明进一步涉及药物组合物，其包含适用于阻断或降低具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白之表达的多核苷酸序列。本发明另外涉及药物组合物，其包含阻断或降低具有包含START域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白之表达的多核苷酸序列。在本发明之一特定实施方式中，药物组合物之特征在于START域序列为神经酰胺转移蛋白CERT(CERT-SEQIDNO.II或CERTl-SEQIDNO.13)或其衍生物或突变体。在本发明之另一特定实施方式中，药物组合物之特征在于START域为(SEQIDNO.17或19)或其衍生物或突变体。在本发明之一特定实施方式中，药物组合物之特征在于多核苷酸序列为RNAi、siRNA或反义RNA。在本发明之一优选实施方式中，药物组合物之特征在于START域蛋白为哺乳动物START域家族成员，诸如PCTP(SEQIDNO.27)、StarD7、GPBP、StarDlO、StarD8、StarD13、DLC-1、StarD4(SEQIDNO.21)、StarD6(SEQIDNO.25)、StarD5(SEQIDNO.23)、MLN64、StAR、THEA-2、CACH或StarD9或其衍生物或突变体。在本发明之一尤其优选实施方式中，药物组合物之特征在于该多核苷酸与CERT核普酸序列或其部分互补，尤其与START域互补。在本发明之一最佳实施方式中，药物组合物之特征在于该多核苷酸与CERT基因或CERT启动子结合。在本发明之另一实施方式中，药物组合物之特征在于该多核苷酸为CERT基因或其部分之反义寡核普酸。本发明进一步涉及药物组合物，其包含具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域的氨基酸序列的蛋白，优选CERT(SEQIDNO.11或SEQIDNO.13)或其衍生物或突变体的抑制剂或抑止剂。在本发明之一特定实施方式中，药物组合物之特征在于该抑制剂或抑止剂为化学物质或肽抑制剂或抑制性蛋白，诸如(i)与CERT启动子结合的蛋白，藉此抑制CERT表达；(ii)与CERT或PKD结合的蛋白，藉此防止PKD与CERT结合且阻碍PKD对CERT磷酸化；(iii)类似于CERT但并不实现CERT功能的蛋白，其意谓"显性负性"CERT变体；或(iv)充当CERT与PKD之骨架的蛋白，从而引起CERT与PKD不可逆地结合(二稳定之PKD/CERT复合物)，其由于PKD对CERT之抑制性磷酸化及CERT自该复合物中之解离受阻而不具有功能性。在本发明之一特定实施方式中，药物组合物之特征在于该抑制剂或抑止剂为CERT活性之抑制剂或抑止剂。本发明进一步涉及鉴别START域蛋白功能，优选CERT功能之调节因子的方法，其包含提供具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白，优选为CERT,使步骤a)之该蛋白与测试剂接触，测定与蛋白分泌或细胞表面蛋白之表达增加或减少相关的凌文应。本发明进一步涉及包含将如所描述的药物组合物用于治疗癌症的方法。本发明另外系关于START域蛋白或编码START域蛋白之多核苷酸用以增加目标蛋白之分泌和/或生产的用途。本发明还涉及如所描述之方法、表达载体、细胞或药物组合物中之任一者的诊断用途。在一特定实施方式中，本发明进一步涉及在细胞中生产目标异源蛋白之方法，其包含提高具有包含如以下所列之类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域共有序列或其衍生物或突变体的氨基酸序列的蛋白的表达或活性，并表达该目标蛋白共有/80。/。(SEQIDNO28)imnhnnnhhntminniintWppiihniinnminnnnnnnlithlpiihtiisnnnnnniisiiliihnnntnnhiimihnsiiR-hhhhlzizih-htsminniizmpiihhpiilihtiithimhhpnnnnhtthptntnp其中类别关键残基如下(以单字母氨基酸代码表示)醇oS，T脂肪族lI，L，V任一者A,C，D,E，F,G,H,I，K,L,M,N,P,Q，R,S,T,V,W，Y芳族aF,H,W,Y4电荷cD,E,H,K,R疏水性hA,C，F，G,H,I,K,L,M,R,T，V,W,Y阴性-D,E极性pC,D，E,H,K,N,Q,R,S,T阳性+H,K,R小sA,C，D,G,N,P,S,T，V微小uA,G，S转换型(turnlike)tA，C，D，E，G,H,K,N,Q,R,S,T在本发明之其它优选实施方式中，先前实施方式(例如，表达载体、细胞、蛋白、药物组合物、方法及用途)之任一者中具有包含类固醇合成急性调节相关脂质转移(START)域的氨基酸序列的蛋白由包含如以上所列之START域共有序列或其衍生物或突变体(SEQIDNO28,亦参见图9)界定。参看以下实例将更易于理解以上大体描述之本发明，该等实例仅为达成说明本发明之特定实施方式之目的而包括于本文中。以下实例不具有限制性。其仅展示本发明之可能实施方式。本领域技术人员可易于调整条件以使其适用于其它实施方式。实验材料及方法j元体及试剂抗体为兔抗PKD底物(substrate)多克隆抗体(CdlSignaling),小鼠抗Flag单克隆抗体(Sigma-Aldrich)，小鼠抗GFP单克隆抗体(Roche),兔抗PKD多克隆抗体(C-20，SantaCruzBiotechnology),小鼠抗GS28(BDBiosciences)及小鼠抗微管蛋白(Neomarkers)。用于监测PKD自磷酸化的磷酸化特异性抗pS916PKD抗体已于别处描述(Hausser等人，2002)。过氧化酶标记之抗小鼠及抗兔IgG第二抗体来自Amersham,碱性磷酸酶标记之抗小鼠IgG第二抗体来自Sigma,AlexaFluor488及AlexaFluor546标记之抗小鼠及抗兔IgG第二抗体来自MolecularProbes。DNA构建体使用pcDNA3-Flag-CERT作为模板、并使用含有EcoRI限制性位点之引物藉由PCR使全长CERTcDNA扩增且将其克隆至pEGFPCl载体中。CERT之点突变体通过按照制造商说明书(Stratagene)进行Quikchange定点PCR诱变而产生。截短CERT变体通过插入终止密码子而产生。使用以下寡核苷酸CERT-S132A(SEQIDNO,1:5，-cgtcgacatggcgcaatggtgtccctgg-3')、CERT-S132Arev(SEQIDNO,2:5'-ccagggacaccattgcgccatgtcgacg-3，)、CERT-S272A(SEQIDNO.3:5'-ggttaaacgtgaggacgcctggcagaagagactgg-3')、CERT-S272Arev(SEQIDN0.4:5'-ccagtctcttctgccaggcgtcctcacgtttaacc-3，)、CERT在氨基酸138处截4豆(SEQIDNO.5:5'誦ggtgtccctggtgtcttgagcaagtggctactc画3')、CERT138截短rev(SEQIDNO.6:5，-gagtagccacttgctcaagacaccagggacacc-3，)。^夺Flag隱CERTcDNA使用EcoRI限制性位点亚克隆至pGEX6Pl中。pEGFP-Nl-PKD及pEGFP-N1-PKDk6uw先前已有描述(Hausser等人，2005)。编码ss-HRP-Flag之质粒由VivekMalhotra(UCSD)友情提供。cDNA和蛋白人CERTcDNA(SEQIDNO.10):atgtcggataatcagagctggaactcgtcgggctcggagggggccgcctgtggagcgctgcggggtcctcagtaagtggaicaggatcgttgggtagttttgasa^ataaitgctctgagttacagagtatggctgcagaggatccatctgtcttagcaaggtttgatgaatgtcgatttgatattagtgtaaatgatagtggatccagatcata^gacagc3atggatagatgccattgsactatggatctgaatccagcttgcgtcgacatggctcaatggagtggctactctgcaacatccacctcttcattcaagaaagttggctga_aa_tgga^scatttagaigacatcttaLtgta_ga_ctactttgatgcctgtgctgatgctgtctctaaggatgaacgaagatgatgaagatgactttcctacaacgcgttctgatgaacggcaataaagaaaagttaitttccacstgtgacaccaatttaaaggggaLagcgatsaicttttaaagcaaictactgctgcattgtattgaactaatggttaaacgtgaggacagctggcactgagaiagaaasgsagaacaigaggaagcatataaaaatgaaatcccactttggaggaccagattatgaagaaggccctagagttctttgatgctgttgaagctgctcttgacagacaagcagsgtgaaaaggtgagattacattggcctacatccttgctctgtggggacacatagatttgtccaaaaggttgaagagatactcattacaggatgtaggcggagatgccaattggcagtatgaaggtatacagaagagaagtagaagaaaatgggattgacccatgcagttaaaggcgtcacaggacatgaagtctgcagttcgcaatgactgggaaacaactatagaaaactttcatgaLatgcaaitcaitcatttatcaaacaicacaagagggtg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RP-Flag质粒分别与空载体、pEGFP-Nl-PKDlKD、pcDNA3-Flag-CERTwt及pcDNA3-Flag-CERT-S132A以1:6.5之比率来共转染HEK293T细胞。转染24小时后，细胞用无血清培养基洗涤，澄清的细胞上清液与ECL试剂一起保温O、1、3及6小时后，定量HRP分泌。所述测量使用发光仪(Lucy2，Anthos)在450nm完成。siRNA检定将COS7细胞用编码ssHRP-Flag之载体转染，8小时后收集，再重复铺至三个孔中，且接着根据制造商说明书使用OligofectamineTM试剂(Invitrogen)以CERT特异性siRNA寡核普酸(siCER!Wl,SEQIDN0.7:5'-c.ca-cau-gac-uua-cuc-auu-att-3';siCERT#2，SEQIDNO.8:5'-gaa-cag-agg-aag-cau-aua-att-3')来转染。对照细胞用模拟物转染或用lacZ特异性siRNA(SEQIDN0.9:5'-gcg画gcu-gcc-gga-auu-uac-ctt-3')转染。48小时后，洗涤细胞，添加新鲜培养基。用上述化学发光法测量分泌至上清液中的HRP量。最后，使细胞裂解，汇集三份裂解物，通过用微管蛋白-特异性及运铁蛋白受体-特异性抗体进行免疫印迹来分析。实施例实施例l:胞内产物累积指示分泌瓶颈。用表达人IgG抗体之三种不同CHO生产者细胞克隆进行补料分批制程(分别为制程A、B及M，参见图l)。每隔一天，采集细胞样本，经FACS分析测定胞内抗体量。简言之，细胞用PBS/4%PFA固定，透化，以FITC偶联抗人K轻链抗体染色。在最初4天内，胞内IgG含量保持恒定。然而，自第5天至第9天，胞内产物之含量持续升高，指示错误折迭之轻链或甚至完整抗体产物在细胞内累积。这些情报代表不同生产者细胞克隆及产物之三个独立生产过程之结果，其有力地表明，与分泌至培养基中的蛋白相比，细胞转录更多抗体RNA，且因此造成翻译后瓶颈，阻碍所产抗体的充分分泌(图l)。实施例2:CERT用PKD底物抗体来^r测。PKD为高尔基复合体处的关键调节因子，在那里，PI4KI邵是迄今鉴别出的唯一底物。为测试高尔基复合体处的CERT蛋白(SEQIDN0.11及13)是否充当PKD底物，我们利用称为pMOTIF的磷酸化特异性底物抗体，其抗被PKD磷酸化的共有基元(Doppler等人，2005)。用编码Flag标记之CERT(SEQIDNO.10)及CERH(SEQIDNo.l2)的表达载体来转染HEK293T细胞。用Flag特异性抗体使CERT同功异型物(isoform)发生免疫沉淀，用pMOTIF抗体进行Western印迹法来分析(图4A)。检测对应于CERT(SEQIDNO.ll)之分子量且更弱地对应于CERTiXSEQIDNo.l3)之分子量的pMOTIF信号。经》粦酸化之CER几同功异型物之较弱检测可能与其形成聚集体之已知行为有关，此行为可影响激酶^粦酸化位点的可达性(Raya等人，2000)。为研究pMOTIF抗体识别CERT是否依赖PKD，我们使CERT连同PKD1之激酶失活型变体(K621W)—起在HEK293T细胞中表达。此突变体位于高尔基复合体且以显性阴性方式抑制PI4KIIip磷酸化(Hausser等人，2005)。非活性PKD之共表达破坏pMOTIF抗体对CERT之检测，从而表明pMOTIF信号实际上归因于PKD介导之CERT磷酸化(图4B)。据认为脂质转移蛋白在形成于ER与TGN之间的膜接触位点(Levine及Loewen，2006)处起作用，而PKD也位于此处。在共表达GFP标记之PKD1之COS7细胞中，对Flag标记之CERT进行免疫荧光染色，结果表明，这两种蛋白都位于高尔基复合体处(图4C)。总之，这些情报证实CERT为高尔基体处的PKD底物。实施例3:PKD使CERT在丝氨酸132磷酸化。为鉴别CERT中的pMOTIF识别位点，我们按照以丝氨酸或苏氨酸为起点，-5位置为亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸残基及-3位置为精氨酸的特征，搜寻潜在PKD共有基元。通过定点诱变，将132位及272位的两个与PKD共有基元匹配且跨物种保守的丝氨酸(图5A)替换为丙氨酸。在HEK293T细胞中表达所述突变体，测试pMOTIF抗体识别。有趣的是，丝氨酸132突变为丙氨酸时，破坏pMOTIF抗体对CERT的检测，并引起电泳迁移率增加，表明失去磷酸化，而S272A突变并不影响pMOTIF信号(图5B)。此表明，丝氨酸132是被PKD底物抗体特异性识别的PKD磷酸化位点。为证实PKD能够直接使CERT中的该丝氨酸残基磷酸化，我们用纯化PKD1及大肠軒菌产生的含前138个氨基酸的重组CERTGST融合蛋白进行体外激酶检定。当在[Y，P]-ATP存在下将截短的野生型CERT融合蛋白与PKD1—起培育时，检测到有放射性掺入(图5C)。这种现象在CERT-S132A融合蛋白的情况下被显著削弱。此外还表明，野生型而非CERT-S132A(SEQIDN0.15)的体夕卜PKD磷酸化产生pMOTIF抗体的识别位点(图5D)。总之，这些结果证明CERT为真正的在体外及体内的PKD底物，并将丝氨酸132鉴定为CERT的特异性PKD磷酸化位点。实施例4:CERT在丝氨酸132处的磷酸化调节PI(4)P结合及神经酰胺转移活性。丝氨酸132非常接近CERTPH域(氨基酸23-117)，从而使得此位点上之磷酸化可能因增加局部负电荷而影响PI(4)P结合。为此，我们进行蛋白-脂质覆盖检定，来定量野生型CERT及CERT-S132A突变体(SEQIDNCU5)的PI(4)P结合。此处，将瞬时表达CERT变体的HEK293T细胞的胞质与点有不同浓度梯度的磷酸肌醇的膜一起培育，利用其GFP标记来检测结合的CERT蛋白。如先前报导所示，全长野生型蛋白与若干磷脂物质弱结合，但与PI(4)P强结合(Hanada等人，2003;Levine及Munro,2002)。CERT-S132A可在与野生型蛋白相比低两倍至四倍的浓度检测到与PI(4)P的结合，这表明，CERT-S132A突变体对这种磷脂的亲和力增加(图6A)。这些数据共同暗示，CERT在与高尔基复合体结合后即被PKD磷酸化，这使CERT对PI(4)P的亲和力减小，由此调节CERT与高尔基体膜的相互作用。鉴于CERT蛋白已被证实有脂质转移蛋白的作用(Hanada等人，2003),我们研究CERT丝氨酸132之磷酸化是否影响其结合能力及在膜间转移神经酰胺的能力。为此，在HEK239T细胞中瞬时表达野生型CERT(SEQIDNO.10)及CERT-S132A(SEQIDN0.14)的GFP标记形式，用基于FRET的试验分析胞质级分的神经酰胺特异性脂质转移活性(图6B)。此试验使用单层小嚢泡，其含有芘标记的神经酰胺作为荧光供体，并含有淬灭量的、头部基团标记的TNP-PE(Olayioye等人，2005;Somerharju,2002)。当将此等供体脂质体与过量且未标记的接受体脂质体混合时，芘荧光的增加是可忽略的，这指示，神经酰胺向接受体膜之自发转移是最小的(数据未展示)。添加含野生型CERT的胞质后，发现萸光稳定增加，此现象在使用载体转染的细胞的对照胞质时观察不到(图6B)。与野生型蛋白相比，CERT-S132A(SEQIDNo.l5)显示较高脂质转移速率，表现为芘荧光较快增加。此表明，CERT丝氨酸132之磷酸化因减少该蛋白与膜的结合而下调神经酰胺转移活性。先前资料表明，PKD通过磷酸化介导的PI4KI耶活化来调节PI(4)P在高尔基复合体处之含量(Hausser等人，2005)。有趣的是，PI4KI即对ER与高尔基复合体之间的神经酰胺运送至关重要(Toth等人，2006)。因此，结合本文所得数据可得出结论，在维持高尔基体膜的脂质稳态方面，PKD通过控制CERT结合速率(经由PI(4)P含量)及CERT解离速率(经由直接磷酸化)而起双重作用。实施例5:CERT调节PKD活化及分泌运送。我们假设，CERT通过转移神经酰胺而过度表达将引起DAG含量上升且可能因此刺激PKD活性。为测试此假设，在HEK293T细胞中瞬时表达Flag标记之CERT野生型(SEQIDNO.10)及CERT-S132A(SEQIDN0.14)。转染24小时后，制备全细胞裂解产物，使其经历SDSPAGE。用磷酸化特异性pS916PKD抗体进行免疫印迹，来分析PKD活化(图7A,上图)。用PKD特异性抗体再次探测，来验证等量装载(图7A,中图)。用Flag特异性抗体进行免疫印迹，来验证CERT蛋白的表达(图7A，下图)。如用磷酸化特异性PKD抗体分析所示，与对照物相比，CERT野生型与CERT-S132A两者之表达均提高PKD活性。这表明，PKD活化受CERT蛋白调节，这很可能是由于神经酰胺传递增加及SM/DAG合成加强。为弄清CERT介导的PKD活化是否真正导致分泌运送增强，我们使用了编码分泌型辣根过氧化酶(HRP-ss)的质粒，HRP-ss可用作蛋白组成性分泌之报导体。分别用编码Flag-ss-HRP之表达质粒或空载体与PKDl-GFP激酶失活型(KD)、Flag-CERT野生型(WT)及Flag-CERT-S132A共转染HEK293T细胞。转染24小时后，洗涤细胞且添加新鲜培养基。在0、1、3及6小时后，通过化学发光分析上清液的过氧化酶活性。在对照物细胞中，ss-HRP之分泌可在1小时内被检测到且随着时间增加(图7B)。抑制货物蛋白分泌性运送的激酶失活型PKDl的共表达几乎完全消除ss-HRP向上清液中的分泌。此证实，在此检定中，HRP以PKD依赖性方式分泌。相反，CERT野生型及CERT-S132A之共表达强烈增加HRP分泌量(图7B)，且该突变体的值甚至略高于野生型CERT的。此实验证明，CERT过度表达刺激PKD磷酸化，并在功能检定中使细胞外蛋白分泌至培养基中的水平增强约2倍。我们还研究了CERT-S132A突变体之过度表达是否影响其定位和/或是否引起高尔基体之形态变化。CERT已被证明与顺/间(cis/medial-)高尔基体标记物GS28共定位(Hanada等人，2003)。对在COS7细胞中表达的经GFP标记的CERT进行免疫焚光分析，结果表明，该蛋白定位于GS28阳性高尔基体区域(图7C)。而CERT-S132A突变蛋白除在高尔基复合体处与GS28有部分地共定位以外，显示分散的点状染色。值得注意的是发现一些此等嚢泡结构含有货物蛋白ss-HRP,表明此等结构真正代表高尔基体来源的运送载体(图7D)。此发现符合因神经酰胺含量局部增加而观测到的高尔基体膜结构之改变(Fukunaga等人，2000;Weigert等人，1999)。实施例6:CERT因RNA干扰所孓I起的下调抑制分泌运送。本发明至此所呈现之数据清楚地证明，CERT之过度表达增强蛋白分泌。为研究相反情况是否亦成立(即CERT表达降低是否会引起分泌减少)，进行siRNA实验。将COS7细胞以编码ssHRP-Flag之载体转染，8小时后收集，再重复铺至三个孔中，用CERT特异性siRNA寡核苷酸(SEQIDN0.7及8)或作为对照的模拟物或lacZ特异性siRNA(SEQIDN0.9)转染，48小时后，洗涤细胞，以新鲜培养基覆盖，经过所示时间后，测量分泌至上清液中的HRP量。如图8A中所示，3小时后检测HRP活性，发现两种对照细胞中含量相等。而在用^f壬一种CERT特异性siRNA寡核苷酸处理的细胞中，测量到HRP活性显著降低。这表明CERT含量减少引起细胞的HRP分泌减少，这还强调CERT在分泌运送中之重要作用。有趣的是，不仅蛋白分泌，而且跨膜蛋白运铁蛋白受体之丰度亦受CERT减少的影响(图8B)。当汇集来自图8A的细胞且在Western印迹实验中用运铁蛋白受体特异性抗体探测裂解物时，运铁蛋白受体的剧烈减少很明显，而在两个对照细胞中检测到相似的运铁蛋白受体含量。此发现表明，脂质转移蛋白CERT与分泌蛋白和细胞表面膜驻留(membrane-standing)蛋白的运送都有关。此可能并不令人惊讶，因为这两类蛋白在脂嚢泡中自ER经由高尔基体被同等地运送至细胞膜，因此使用相同细胞输出路径，所述路径被我们在本发明中首次证明其受CERT影响。实施例7:CERT的过度表达增加抗体的生物药蛋白生产。(a)能产生抗体的CHO细胞抹(CHQDG44)用载体转染，所述细胞^朱分泌人源化抗CD44v6IgG抗体BIWA4，所述载体是空载体0莫拟对照物)或编码野生型CERT(SEQIDNO.10及12)或带点突变Serl32A的CERT突变体(SEQIDN0.14)的表达构建体，选出稳定的细胞群。在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，用ELISA测定IgG效价，将所得效价除以细胞平均数，算出比生产力(图10A)。最高值见于携有CERT突变体(SEQIDNo.l4)的细胞群中，其次见于携有野生型CERT(SEQIDNo.l0或12)的细胞群中。在两者中，与经模拟转染或未经转染的细胞相比，IgG表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果(图10B)。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起抗体分泌增加，从而指示CERT能增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或补料分批培养物中生长的细胞的这种比生产能力。(b)首先以编码野生型CERT(SEQIDNO.10或12)或带点突变Serl32A的经受选择压力，挑出有CERT或CERT突变体的异源表达的细胞抹。所述细胞抹以及CHODG44野生型细胞随后都用编码目标基因的载体转染，所述目标基因编码人源化抗CD44v6IgG抗体BIWA4。第二轮选择后，在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，用ELISA测定IgG效价，将其除以细胞平均数，算出比生产力。最高值见于携有CERT突变体(SEQIDNo.l4)的细胞群中，其次见于携有野生型CERT(SEQIDNo.lO或12)的细胞群中。在两者中，与并未异源表达CERT或CERT突变体的细胞相比，IgG表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得;f及相似结果。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起抗体分泌增加，从而指示CERT能够增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或#卜料分批培养物中生长的细胞的这种比生产能力。此指示，CERT,及尤其突变CERT，它们的异源表达可增强经瞬时转染以及稳定转染的CHO细胞林中的抗体分泌。实施例8:CERT的过度表达增加单核细胞趋化蛋白l(MCP-l)的生物药蛋白生产。(a)CHO细胞株(CHODG44)用载体转染，所述细胞抹分泌单核细胞趋化蛋白l(MCP-l),所述载体是空载体(模拟对照物)或编码野生型CERT(SEQIDNO.10及12)或带点突变Serl32A的CERT突变体(SEQIDN0.14)的表达构建体，选出稳定的细胞群。在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，用ELISA测定MCP-1效价，将所得效价除以细胞平均数，算出比生产力(图10A)。最高值见于携有CERT突变体(SEQIDNo.l4)的细胞群中，其次见于携有野生型CERT(SEQIDNo.l0或12)的细胞群中。在两者中，与经模拟转染或未经转染的细胞相比，MCP-1表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果(图10B)。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起MCP-1分泌增加，从而指示CERT能增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或补料分批培养物中生长的细胞的这种比生产能力。(b)首先以编码野生型CERT(SEQIDNO.10或12)或带点突变Serl32A的CERT突变体(SEQIDN0.14)的载体转染CHO宿主细胞(CHODG44)。使细胞经受选择压力，挑出有CERT或CERT突变体的异源表达的细胞抹。所述细胞抹以及CHODG44野生型细胞随后都用编码目标基因的载体转染，所述目标基因编码单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。第二轮选择后，在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，经ELISA测定MCP-1效价，将其除以细胞平均数，算出比生产力。最高值见于携有CERT突变体的细胞群中，其次见于携有野生型CERT的细胞群中。在两者中，与并未异源表达CERT或CERT突变体的细胞相比，MCP-1表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起抗体分泌增力口，从而指示CERT能够增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或补料分批培养物中生长的细胞的这种比生产能力。此指示，CERT,及尤其突变CERT，这二者的异源表达可增强经瞬时转染以及稳定转染之CHO细胞抹中单细胞蛋白之分泌。实施例9:CERT的过度表达增加跨膜蛋白表皮生长因子受体(EGFR)的生物药蛋白生产。(a)CHO细胞抹(CHODG44)用载体转染，所述细胞抹表达跨膜蛋白表皮生长因子受体(EGFR),所述载体是空载体(模拟对照物)或编码野生型CERT(SEQIDNO.10及12)或带点突变Serl32A的CERT突变体(SEQIDN0.14)的表达构建体，选出稳定的细胞群。在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物中采集细胞，用FACS或Western印迹法测定EGFR表达量。最高值见于携有CERT突变体的细胞群中，其次见于携有野生型CERT的细胞群中。在两者中，与经模拟转染或未经转染的细胞相比，EGFR^达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起EGFR表达增加，从而指示CERT能够增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或补料分批培养物中生长的细胞的这种比生产能力。(b)首先以编码野生型CERT(SEQIDNO.10或12)或带点突变Serl32A的CERT突变体(SEQIDN0.14)的载体转染CHO宿主细胞(CHODG44)。使细胞经受选择压力，挑出有CERT或CERT突变体的异源表达的细胞抹。所述细胞抹以及CHODG44野生型细胞随后都用编码目标基因的载体转染，所述目标基因编码EGFR。第二轮选择后，从六次连续传代的所有稳定细胞群的接种储备培养物中采集细胞，用FACS或Western印迹法测定EGFR表达量。最高值见于携有CERT突变体的细胞群中，其次见于携有野生型CERT的细胞群中。在两者中，与并未异源表达CERT或CERT突变体的细胞相比，EGF"达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起EGFR表达增加，从而指示CERT能够增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或补料分批培养物中生长的细胞的这种比生产能力。此指示，CERT,及尤其突变CERT，这二者的异源表达可增强经瞬时转染以及稳定转染的CHO细胞抹中表面受体的表达。实施例10:STARD4的过度表达增加抗体的生物药蛋白生产。(a)能产生抗体的CHO细胞抹(CHODG44)用载体转染，所述细胞林分泌人源化抗CD44v6IgG抗体BIWA4,所述载体是空载体(对莫拟对照物)或编码StarD4(SEQIDNO.20)的表达构建体，选出稳定的细胞群。在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，经ELISA测定IgG效价，将其除以细胞平均数，算出比生产力。最高值见于携有StarD4的细胞群中。与经模拟转染或未经转染的细胞相比，IgG表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果。在所述每一种设置中，StarD4之过度表达能够增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或补料分批培养物中生长的细胞之比生产能力。(b)首先以编码StarD4之载体转染CHO宿主细胞(CHODG44)。使细胞经受选择压力，挑出有StarD4的异源表达的细胞抹。所述细胞抹以及CHODG44野生型细胞随后都用编码目标基因的载体转染，所述目标基因编码人源化抗CD44v6IgG抗体BIWA4。第二轮选择后，在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，经ELISA测定IgG效价，将其除以细胞平均数，算出比生产力。最高值见于携有StarD4的细胞群中。与未异源表达StarD4的细胞相比，IgG表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果。在所述每一种设置中，StarD4之过度表达能细胞的这种比生产能力。此指示，StarD4之异源表达可增强经瞬时转染以及稳定转染的CHO细胞抹中的抗体分泌。实施例11:CERT的过表达增加人血清白蛋白(HSA)的生物药蛋白生产。(a)CHO细胞林(CHODG44)用载体转染，所述细胞林分泌单链蛋白HSA，所述载体是空载体0莫拟对照物)或编码野生型CERT(SEQIDNO.10及12)或带点突变Serl32A的CERT突变体(SEQIDNO,14)的表达构建体，选出稳定的细胞群。在随后4次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，经ELISA测定HSA效价，将其除以细胞平均数，算出比生产力(图IIA)。与经模拟转染之对照物相比，HSA效价与HSA生产细胞的比生产力两者均因两种CERT变体的异源表达而显著增强。最高值见于携有CERT突变体的细胞群中，其引起与对照物相比，比生产力提高51。/。且HSA效价提高46。/。；其次见于携有野生型CERT的细胞群中，其使比生产力提高49%。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果(图IIB)。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起HSA分泌增力口，从而指示CERT能够增强在系列培养物中或在工业生产条件下(诸如在生物反应器的分批或补料分批培养物中)生长的细胞的这种比生产能力。(b)及(c)首先以编码野生型CERT(SEQIDNO.10或12)或带点突变Serl32A的CERT突变体(SEQIDN0.14)的载体转染CHO宿主细胞(CHODG44)。使细胞经受选择压力，挑出有CERT或CERT突变体的异源表达的细胞抹。所述细胞抹以及CHODG44野生型细胞随后都用编码目标基因的载体转染，所述目标基因编码人血清白蛋白。第二轮选择后，在随后6次传代期间，自所有稳定细胞群之接种储备培养物取上清液，经ELISA测定HSA效价(图11C),将其除以细胞平均数，算出比生产力(图11B)。最高值见于携有CERT突变体的细胞群中，其次见于携有野生型CERT的细胞群中。在两者中，与并未异源表达CERT或CERT突变体的细胞相比，HSA表达显著增强。使稳定转染物经历分批或补料分批发酵，可获得极相似结果。在所述每一种设置中，野生型与突变CERT两者之过度表达引起抗体分泌增加，从而指示CERT能够增强在系列培养物中或在生物反应器的分批或补料分批培养物中生长的细胞的这种比生产能力。此指示，CERT,尤其突变CERT，这二者的异源表达可增强经瞬时转染以及稳定转染的CHO细胞株中单链蛋白的分泌。参考文献1.a-Rubeai,M.及Singh,R.P.(1998).Apoptosisincellculture.Curr.Opin.Biotechnol.9，152-156。2.Alpy，F.及Tomasetto，C.(2005).GivelipidsaSTART:theStAR墨rdatedlipidtransfer(START)domaininmammals.J.CellSci.118，2791-2801。3.Altschul,S.F.,Gish,W.，Miller，W.,Myers，E,W.,及Lipman,D丄(1990).Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.2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尔·弗洛林,莫尼洛拉·奥莱伊奥耶,蒂姆·富格曼申请人:贝林格尔英格海姆法玛两合公司