植物中的蛋白生产的制作方法

专利名称：：植物中的蛋白生产的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在植物中生产蛋白的方法。本发明还提供可用于在植物中生产蛋白的核苷酸序列。本发明的目标是提供一种在植物中生产蛋白的改进方法。本发明提供一种在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(A)，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以获得经修剪的植物或所述植物的经修剪部分，ii)将与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接的编码目的蛋白的一种或多4种核酸序列以瞬时方式引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中，禾口iii)将所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。所述目的蛋白可为抗体、抗原、疫苗或酶。本发明还涉及上文所述方法，其中在所述引入步骤(步骤ii)中，两种或两种以上的核酸序列可被引入所述植物中。此外，所述两种或两种以上的核酸序列之一可编码沉默抑制子。例如，所述沉默抑制子可为HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV_p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO。本发明还包括上文所述方法，其中在所述引入步骤(步骤ii)中，可用农杆菌(agronacteri咖)将一种或多种核酸序列引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中。所述农杆菌可在真空下或通过使用注射器被引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中。此外，在上述引入步骤(步骤ii)中，所述调控区包括一种来自光合基因的启动子。例如，所述调控区可包括质体蓝素启动子，质体蓝素3'UTR转录终止序列，或既包括质体蓝素启动子又包括3'UTR转录终止序列。本发明还涉及一种在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(B)，包括i)以瞬时方式引入一种或多种编码目的蛋白的核酸序列，所述核酸序列与在所述植物或所述植物的一部分中有活性的来自光合基因的调控区可操作地连接，禾口ii)将所述植物或所述植物的一部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。所述目的蛋白可为抗体、抗原、疫苗或酶。本发明还涉及上文所述方法(B)，其中在所述引入步骤(步骤i)中，两种或两种以上的核酸序列被引入所述植物中。此外，所述两种或两种以上的核酸序列之一可编码沉默抑制子。例如，所述沉默抑制子可为HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO。本发明还包括上文所述方法(B)，其中在所述引入步骤(步骤i)中，一种或多种核酸序列可用农杆菌引入所述经修剪的植物或所述植物的经剪部分中。所述农杆菌可在真空下或通过使用注射器被引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中。此外，在上述引入步骤(步骤ii)中，所述调控区包括一种来自光合基因的启动子。例如，所述调控区可包括质体蓝素启动子，质体蓝素3'UTR转录终止序列，或既包括质体蓝素启动子又包括3'UTR转录终止序列。本发明还提供一种在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(方法C)，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以获得经修剪的植物或所述植物的经修剪部分，ii)以瞬时方式引入一种或多种编码目的蛋白的核酸序列，所述序列与在所述植物或所述植物的一部分中有活性的来自光合基因的调控区可操作地连接，禾口iii)将所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分保持在允许编码所述目的蛋5白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。所述目的蛋白可为抗体、抗原、疫苗或酶。本发明还涉及上文所述方法(C)，其中在所述引入步骤(步骤ii)中，两种或两种以上的核酸序列被引入所述植物中。此外，所述两种或两种以上的核酸序列之一可编码沉默抑制子。例如，所述沉默抑制子可为HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVpl9、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV_p23、GLRaV-2p24、GBV_pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO。本发明还包括上文所述方法(C)，其中在所述引入步骤(步骤ii)中，一种或多种核酸序列可用农杆菌引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中。所述农杆菌可在真空下或通过使用注射器被引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中。此外，在上述引入步骤(步骤ii)中，所述调控区包括一种来自光合基因的启动子。例如，所述调控区可包括质体蓝素启动子，质体蓝素3'UTR转录终止序列，或既包括质体蓝素启动子又包括3'UTR转录终止序列。本发明提供一种用瞬时表达系统于在植物中驱动目的蛋白表达的简化植物表达系统。根据本文所述的方法，目的蛋白可获得高产。本文所述的瞬时共表达系统避免了现有技术(例如Bakker，2005)所述的长生产时间，以及原种突变或糖工程转基因系的选择过程及其作为亲本品系的应用。这也同时避免了突变或糖工程植物在生产力、花粉生产、种组(Bakkeretal2005)和生存力(Boissonetal.，2005)的方面中经常遇到的问题。本文所述的瞬时转移系统达到每千克叶重含1.5g高质量抗体表达水平，超过有报道的在任何使用其他表达系统(包括多病毒基系统和转基因植物)的植物中的抗体累积表达水平。如本文所述，在所需核酸构建体浸润之前，将植物修剪至可观察到表达水平(以总合成蛋白的％表示)和产量(每kg鲜重的蛋白mg数)有所增加。这是用包括但不限于注射器浸润或真空浸润的若干浸润方法观察到的。多种修剪方法例如但不限于机械修剪或化学修剪都增加了表达水平和蛋白产量。使用来自光合基因的调控区，例如但不限于来自编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大/小亚基或者质体蓝素的基因的调控区，或者使用来自光合基因的调控区被发现可增加表达水平和产量。此外，发现使用结合光合基因的调控区和修剪可增加表达水平和蛋白产量。浸润技术允许在小型试验设备中每天生产数量以克计的此抗体，这允许使用这种瞬时表达系统在极短的时限内生产临床试验材料和在每年为规模多至千克级别的市场提供特许产品。单次亲和色谱步骤后可从被浸润的叶子中获得高质量抗体。此发明的内容并不必描述本发明的所有方面。本发明的这些和其他方面会通过下面对附图的描述更加清楚，其中图1A示出了为表达若干蛋白而装配的表达盒的实例。R612包括都处于一个质体蓝素启动子和5'UTR控制下的编码C5-1LC和C5-1HC的核苷酸序列，以及一个质体蓝素终止子。R610包括都处于一个质体蓝素启动子和5'UTR控制下的编码C5-1LC和C5-1HC-KDEL的核苷酸序列，以及一个质体蓝素终止子。R514包括都处于2X35S烟草蚀纹病毒(TEV)启动子前导序列控制下的编码C5-1LC(C5-1LC:C5-1轻链编码序列)和C5-1HC的核苷酸序列，以及一个N0S终止子；C5-1LC:C5-1轻链编码序列；C5-1HC:C5_1重链编码序列。935包括都处于一个质体蓝素启动子和5'UTR控制下的编码人IgG-LC和人IgG-HC的核苷酸序列，以及一个质体蓝素终止子。312包括处于一个质体蓝素启动子和5'UTR控制下的编码流感抗原的核苷酸序列，以及一个质体蓝素终止子。图1B示出了所述质体蓝素启动子和5'UTR的核苷酸序列(SEQIDNO:19)，其中转录起始位点以粗体表示，翻译起始位点以下划线标出。图1C示出了所述质体蓝素3'UTR和终止子的的核苷酸序列(SEQIDNO:20)，其中终止位点以下划线标出。图1D示出了用于R512和R513装配(assembly)的中间质粒中的2X35S(SEQIDNO:33)和N0S(SEQIDNO:34)序列。NOS终止子(SEQIDNO:34)以斜体示出；2X35S启动子以粗体表示(SEQIDNO:33)。限制酶切位点以下划线标出。图2示出了用各种表达盒浸润的本氏烟草(Nicotianabenthamiana)叶中C5-1抗体的积聚。图2A示出了在有或没有共表达沉默抑制子如HcPro的情况下，注射器浸润R514(35S基表达盒)、R610和R612(质体蓝素基表达盒)后产生的C5_l抗体的积聚情况。图2B示出了在有或没有共表达沉默抑制子(如HcPro)的情况下，用R610和R612(质体蓝素基表达盒)在真空浸润或注射器浸润的叶子中产生的C5-1抗体的积聚情况。所示值对应对3个植物(注射器)的6次测量或对约12个植物(250g)的各个浸润批次的6次测量的平均积聚水平和标准偏差。图3示出了对注射器和真空浸润植物的提取物中C5-l积聚的蛋白印迹分析。图3A示出了用过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG(H+L)对用R612(用于分泌，泳道l)或用R610(用于内质网滞留，泳道2)浸润的植物的提取物的免疫印迹。Cl:100ng商品化小鼠IgGl(SigmaM9269)，上样作为电泳迁移率对照；C2:12iig从假浸润生物质(空载体)中提取的总蛋白。C3:加入(spike)到12iig从假浸润的生物质(空载体)中提取的总蛋白中的100ng商品化小鼠IgGl(SigmaM9269)。图3B示出了用过氧化物酶缀合的人IgG对用R612(用于分泌，泳道l)或用R610(用于内质网滞留，泳道2)浸润的植物的提取物的活性免疫印迹。Cl:2yg从杂交瘤细胞(Khoudietal.，1999)中纯化的对照C5-1;C2:75yg从假浸润的生物质(空载体)中提取的总蛋白。图4示出了对从用R612(用于分泌，泳道1)或R610(用于内质网滞留，泳道2)浸润的植物中纯化的抗体的分析。图4A显示在非还原条件下对粗提取物和纯化抗体进行的SDS-PAGE。图4B显示在还原条件下对纯化抗体进行的SDS-PAGE。图4C显示用过氧化物酶缀合的人IgGl进行纯化抗体的活性免疫印迹。图4D示出了对从不同浸润批次纯化的6组C5-l中污染物的比较。C:2.5iig商品化小鼠IgGl(SigmaM9269)，上样作为电泳迁移率对昭。图5A示出了用于天然(R622)和杂交(R621)形式的半乳糖基转移酶的表达装配的盒实例的示意图。GNTI-CTS:N-乙酰葡萄糖胺转移酶I的CTS结构域；GalT-CAT:人P-l，4-半乳糖基转移酶的催化结构域；GalT:人P-l，4-半乳糖基转移酶。图5B示出了GalT(UDP-Gal:betaGlcNacP_1，4_半乳糖基转移酶多肽1;P_1，4_半乳糖基转移酶I)的核苷酸序列(SEQIDN0:14)，其中ATG起始位点以下划线标出；跨膜结构域以下划线和斜体表示；粗体序列对应人P-l，4-GalT的催化结构域；FLAG表位以斜体表示。图5C示出了GalT(UDP-Gal:betaGlcNacP_1，4_半乳糖基转移酶多肽1;P_1，4_半乳糖基转移酶I)的氨基酸序列(SEQIDNO:15)。跨膜结构域以下划线和斜体表示；粗体序列对应人13-1，4-GalT的催化结构域；FLAG表位以斜体表示。图5D示出了GNTIGalT的核苷酸序列(SEQIDN0:17)，其中ATG起始位点以下划线标出；跨膜结构域(CTS)以下划线和斜体表示；粗体序列对应人P-l，4-GalT的催化结构域；FLAG表位以斜体表示。图5E示出了GNTIGalT的氨基酸序列(SEQIDNO:18)。跨膜结构域(CTS)以下划线和斜体表示；粗体序列对应人P-l，4-GalT的催化结构域；FLAG表位以斜体表示。图5F示出了N_乙酰葡萄糖胺转移酶(GNT1;SEQIDNO:21)的CTS结构域(胞质尾区，跨膜结构域，干区)。图5G示出了CTS的氨基酸序列(SEQIDNO:22)。图6示出了来自表达C5-1的植物并进行了蛋白质染色或蛋白质印迹分析的提取物的图。顶图示出了考马斯染色的PAGE凝胶。上数第二图示出了用与P-l，4-半乳糖特异性结合的鸡冠剌桐凝集素(Erythrinacristagaliagglutinin,ECA)进行的亲和检测。上数第三图示出了用抗_a1，3-岩藻糖抗体进行的蛋白印迹分析。底图示出了用抗_131，2_木糖特异抗体进行的蛋白印迹分析。R612:C5-1单独表达；R612+R622:C5_1与GalT共表达(共浸润);R612+R621:C5_1与GNTl-GalT共表达。图7示出了机械或化学修剪对表达的影响的实例。图7A示出了在真空农杆菌浸润植物中修剪(包括浸润之前12小时的机械修剪和浸润之前7天的化学修剪)对抗原表达(流感表达，参见图1，312)的影响。图7B示出了在真空农杆菌浸润植物中浸润之前12小时的机械修剪对抗体表达(人IgG，参见图1，935)的影响。图7C示出了在注射器农杆菌浸润植物中机械修剪对抗原(流感，参见图1，312)表达的影响；条件1:对照，未修剪植物；条件2:机械修剪的植物。图8示出了在真空农杆菌浸润植物中，转化当天，转化之前3、2或1天的修剪(机械修剪)或未修剪(对照)对抗原积聚(流感抗原)的影响的实例。图9示出了在真空浸润植物中沉默抑制子(HcPro)和修剪(浸润之前12小时的机械修剪)对抗体表达(人IgG，参见图1，935)的综合作用的实例。Plasto-HcPro-修剪935单独表达(不修剪，无沉默抑制子的共表达)；Plasto-HcPro+修剪用935转化之前12小时的机械修剪(无沉默抑制子的共表达)；Plast0+HCPr0-修剪935和HcPro的共表达(沉默抑制子；不修剪)；Plasto+HcPro+修剪935和HcPro共表达之前12小时的机械修剪。具体实施例方式本发明涉及在植物中生产蛋白的方法。本发明还提供可用于在植物中生产蛋白的核苷酸序列。本发明提供一种在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(A)。在其基本形式中，所述方法包括以瞬时方式引入一种或多种编码目的蛋白的核酸序列，所述序列与在所述植物或所述植物的一部分中有活性的来自光合基因的调控区可操作地连接，并将所述植物或所述植物的一部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。所述方法可进一步包括，首先修剪所述植物或所述植物的一部分，然后引入编码目的蛋白的一种或多种核酸序列。在此方法中，在修剪所述植物或所述植物的一部分之后，将与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接的编码目的蛋白的一种或多种核酸序列以瞬时方式引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中。然后将所述植物或所述植物的一部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。当将使用这种方法生产所述目的蛋白与用不包括使用来自光合基因的调控区或修剪步骤或两者都不包括的相似瞬时转化方法生产相同目的蛋白进行比较时，可发现使用所述方法可获得高产量的所述目的蛋白。已发现设计用于稳定的转基因表达系统的表达盒中所用的启动子在用于瞬时表达系统时效率较低(Giritchetal.2006，Fisher，1999a)。Giritchetal(12206)显示使用每种IgG亚基的不同载体(一种基于TMV，另一种基于PVX)的共表达，连同一种重组酶和两种病毒复制酶可获得范围在200mg/kg之内的表达水平。如本文所述，已经发现包括叶表达效率已知的增强子序列的启动子在瞬时表达中是有效的。一个非限制性的实例包括用于调控质体蓝素表达的启动子(PweeandGray1993，其以引用的方式纳入本文中)。不希望受理论约束，光合基因的上游调控元件与核基质的连接可介导强表达(Sandhuetal.，1998;Chuaetal.，2003)。例如从豌豆质体蓝素基因的翻译起始位点向上游多至784的序列可用于介导强报告基因表达。依照本发明，可使用光合基因的调控区，例如但不限于来自质体蓝素的调控区(US7，125，978，其以引用的方式纳入本文中)或者来自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)的调控区(US4，962，028，其以引用的方式纳入本文中)，叶绿素a/b结合蛋白(CAB;Leutwileretal.，1986，其以引用的方式纳入本文中)，ST-LS1(与光合系统II的放氧复合物缔合；Stockhausetal.1989，其以引用的方式纳入本文中)。人们发现来自编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大/小亚基或者质体蓝素的基因的调控区，或者使用来自光合基因的调控区与修剪，可增加表达水平和产量。例如，如图2A所述，由所述光合启动子(来自质体蓝素；参见图2A，R610，R612)驱动的目的编码区浸润后的表达水平与由35S驱动的相同编码序列相比更高。因此，本发明提供一种在植物或植物的一部分中合成目的蛋白的方法(A)，包括i)以瞬时方式引入一种或多种编码目的蛋白的核酸序列，所述序列与在所述植物或所述植物的一部分中有活性的来自光合基因的调控区可操作地连接，禾口ii)将所述植物或所述植物的一部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。可在引入一种或多种核酸序列的步骤之前修剪所述植物或所述植物的一部分。已经发现在所需核酸构建体浸润之前，修剪植物可增加表达水平(以总合成蛋白的％表示)和产量(每kg鲜重的蛋白mg数)。这是使用若干浸润方法(包括但不限于注射器浸润或真空浸润)和各种修剪方法(例如但不限于机械修剪或化学修剪)观察到的。不希望受理论约束，浸润前修剪可导致生长顶端优势的丧失，并可导致生长剂如赤霉酸或乙烯含量的减少。这转而可剌激叶中光合能力增加和光合基因转录速率增加。因此使用来自光合基因的调控区可导致更高的蛋白产量。此外，结合使用来自光合基因的调控区和降低生长抑制剂(如乙烯或赤霉酸)含量的化学修剪可导致更高的蛋白产量。根据本文所述的方法，通过使用机械或化学修剪方法，和真空或注射器浸润可观察到修剪对目的蛋白产量增加的影响。当例如注射器浸润之后损伤所述植物时，可观察到由于修剪导致的的产量增加(参见图7C)。这表明，蛋白表达的增加不仅是对植物损伤的应答。修剪是指去除一个或多个腋芽、一个或多个顶芽、或者既去除一个或多个腋芽又去除一个或多个顶芽。修剪也可包括杀死、诱死或只降低顶芽和腋芽的生长而不将所述芽从植物上去除。所述芽的生长的降低(或降低芽生长)是指所述芽与未经处理的芽相比在例如代谢活性、或限定时间内大小增长上表现出约50-100%，或其间任何量的降低。修剪也可通过采用降低顶端优势的化合物实现。如果出于修剪的目的使用化合物，那么所使用的剂量一般为所述化合物的厂商推荐的剂量。修剪(机械或化学修剪)可在浸润之前约20天到浸润之后约2天或其间任何时间，例如浸润之前约7天(168小时)到浸润之后约2天(48小时)或其间任何时间，例如浸润之前约48小时(2天)到浸润后约1天(24小时)或其间任何时间，或者从浸润之前约20天、19天、18，天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天或168、144、120、96、72、60、50、40、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1小时到浸润之后约1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时或其间任何时间进行。如果修剪发生在浸润之前72小时或更早，那么所述修剪方法优选化学修剪，因为使用机械修剪方法可发生再生。如果所述修剪方法为化学修剪，那么可在浸润之前采用更长的浸润前时间，例如2、3、4、5、6或7天，或其间任何时间。技术人员可容易地确定修建之前的适合间隔。修剪可通过本领域技术人员所知的任何方法实现，所述方法包括但不限于所述芽的机械去除，例如但不限于切下、剪下、摘心、挤压(例如使用钳子等)，以及局部冷冻(例如将液氮流局部引到所述芽上或用已被合适冷源冷却的钳子或其他设备环绕所述芽，所述冷源包括液氮、干冰、乙醇干冰、冰等，从而使所述芽的温度降低以降低所述芽的生长或将所述芽杀死)。修剪还包括化学修剪，例如，采用杀死或降低所述芽生长的除草剂(化合物；修剪剂)，或采用杀死或降低所述芽生长的生长调节剂。使用化学修剪是一种修剪处理的有效方式，可通过将化合物喷涂、雾溅、浸泡在植物上，或将植物浸在含有所述化合物的溶液中而容易地处理所述植物。植物可在浸润步骤之前被处理一次或多次。可以使用的化合物的实例包括但不限于除草剂例如植物生长调节剂乙烯利(Eth印hon)(如Bromeflor、Cerone、Chloreth印honEthrel、Florel、Prep禾口Flordimex)、比久(Daminozide)(丁二酸单_2，2-二甲肼、琥珀酸_2，2-二甲酰肼、如B-nine、Alar、Kylar、SADH、B-nine、B-995、丁酰肼(aminozide))、Atrimmec(舌夂草克納(dikegulacsodium))、马来酉先月井(maleichydrazide)(1，2-二氢-3，6-哒嗪二酮)、2-4-D(2，4-二氨苯氧乙酸)，并包括赤霉酸合成抑制剂，例如但不限于Cycocel(矮壮素(chlormequatchloride))、A-Rest(嘧啶醇)、三唑类，例如Bonzi(多效唑(paclobutrazol))、S丽gic(烯效P坐(uniconazole))或3-氨基-l，2，4三唑(3-AT)。这些化合物可在用于植物生长改良的已知剂量范围内使用，例如所用的剂量范围可为所述化合物厂商推荐的剂量。这些化合物也可在低于用于植物生长改良的已知剂量的剂量范围内使用，例如所用的剂量范围可为所述化合物厂商推荐的剂量的75%、50%、25%、10%。根据所选生长调节剂，这些化合物的使用剂量可以从约0.2ppm到约5000卯m，和其间任何量。此外，所述修剪剂(化合物)可被使用一次，或按需要补充使用。例如，所10述化合物可被使用一次，或可被使用多次，以在浸润之前或之后对所述植物进行化学修剪。如果使用化学修剪，那么可从浸润之前约20天到浸润之后约12天或其间任何时间使用所述化合物，例如在浸润之前14天、7天或5天有效地使用化合物。如图7A、7B、7C、8和9所示，浸润之前修剪植物导致所述目的蛋白表达的增加。使用机械或化学修剪都可观察到此效果。因此，本发明提供一种在植物或植物的一部分中合成目的蛋白的方法，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以获得经修剪的植物或所述植物的经修剪部分，ii)将与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接的编码目的蛋白的一种或多种核酸序列以瞬时方式引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中，禾口iii)将所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。编码所述目的蛋白的核酸序列可通过任何本领域技术人员所知的合适方法被引入所述植物或所述植物的一部分中，例如通过，不应被视为限制的，真空浸润或注射器浸润。真空浸润方法是本领域已知的，可包括但不限于K即ilaetal.(1997)所述的方法，此文献以引用的方式纳入本文中。浸润还指使用注射器浸润将编码所述目的蛋白的核酸序列引入植物或植物的一部分中(LiuandLomonossoff，2002，其以引用的方式纳入本文中)。本发明所用方法和前人所述方法(例如Kapilaetal.，1997或LiuandLomonossoff，2002)在含有乙酰丁香酮的培养基中培养农杆菌，以用于瞬时转化。已知乙酰丁香酮或其他苯酚信号分子可正向调控农杆菌的毒性机制(virmachinery)。当将农杆菌在存在或缺少乙酰丁香酮的条件下培养时，观察到了本文所述目的蛋白的表达水平的增加。转录后基因沉默(PTGS)可参与限制植物中转基因的表达，马铃薯病毒Y的沉默抑制子(HcPro)的共表达可用于减少转基因mRNA的特异性降解(Brignetietal.，1998)。备选的沉默抑制子为本领域所熟知，并可如本文所述使用(Chibaetal.，2006，Virology346:7-14，其以引用的方式纳入本文中)，例如但不限于TEV-pl/HC-Pro(烟草蚀纹病毒-pl/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的P19(TBSVp19)、番茄皱縮病毒的衣壳蛋白(TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯X病毒的p25(PVX-p25)、马铃薯M病毒的pll(PVM-pll)、马铃薯S病毒的pll(PVS-pll)、蓝莓枯黄病毒的pl6(BScV-p16)、柑橘衰退病毒的p23(CTV-p23)、葡萄巻叶伴随病毒2的p24(GLRaV_2p24)、葡萄A病毒的pl0(GVA-p10)、葡萄B病毒的pl4(GVB-p14)、独活潜隐病毒的p10(HLV-p10)、或者大蒜普通潜隐病毒的pl6(GCLV-p16)。因此，沉默抑制子，例如但不限于，HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-p10、GCLV-pl6或GVA-p10，可与编码所述目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保植物内蛋白生产的高水平。如图9所示，沉默抑制子与编码所述目的蛋白的核酸序列的共表达导致所述目的蛋白的产量明显增加。如果在浸润之前修剪植物，也能观察到所述效果。因此，本文所述的合成目的蛋白的方法可包括将两个或两种以上的核酸序列引入所述植物或所述植物的一部分中。例如，所述两种或两种以上的核酸序列之一可编码沉默抑制子。为举例说明目的蛋白的高产方法，本发明描述了一种驱动目的蛋白(如复合蛋白，例如抗体)表达的植物表达系统。复合蛋白在农杆菌浸润植物例如本氏烟草(Nicotianabenthamiana)中的表达产生了达到1.5g/kgFW(约25XTSP)的蛋白水平。所述目的蛋白的分泌和内质网滞留形式分别达到了558和757mg/kg/FW的平均水平。在所提供的非限制性实施例中，所获得的这种抗体表达水平为用多病毒瞬时表达系统生产的抗体的表达水平的3倍(Giritchetal.2006)，并远高于非病毒性农杆菌浸润表达系统的水平(如V卿eroetal.1999)。在本文所提供的不应被看作限制性的实施例中，所述抗体包括较少岩藻糖基化、木糖基化以及同时岩藻糖基化和木糖基化J-聚糖的修饰糖基化模式。植物和一般哺乳动物之间N-糖基化不同的影响是围绕用植物进行治疗药物生产的概念的关注重点。植物-特异性聚糖的存在可有助于縮短植物生产蛋白在血液中的半衰期，或者相同聚糖会在患者中引起超敏反应。在这种方式，所述目的蛋白可以高产量被生产并缺少可引起超敏反应或参与过敏反应的聚糖。然而，应理解，本文所述的瞬时蛋白生产方法可用于任何目的蛋白，包括不含修饰糖基化的蛋白。本发明描述了一种在特征为具有修饰糖基化模式的植物中合成目的蛋白的方法。所述方法包括目的蛋白连同表达人P-l，4-半乳糖基转移酶(hGalT，也称为GaltT;SEQIDNO:14)的核苷酸序列的共表达。hGalT也可与N-乙酰葡萄糖胺转移酶(GNT1;SEQIDNO:21，图5f;氨基酸SEQIDN0:22，图5g)的CTS结构域融合以产生GNTl-GalT杂交酶，所述杂交酶与所述目的蛋白共表达。使用杂交GNTl-GalT序列可将hGalT的催化结构域定位到其中存在复合N_聚糖成熟的早期阶段的顺面高尔基体中。所述目的蛋白也可与包含与GalT融合的CTS结构域的杂交酶如GNTl-GalT(R621;图5a;SEQIDNO:18，由SEQIDN0:17编码)共表达。然而，如果目的蛋白包含低水平的岩藻糖基化，然而却仍然需要包含木糖基化和半乳糖基化的蛋白，那么，GalT可与所述目的蛋白共表达。目的蛋白的"修饰糖基化"是指包含修饰糖基化的所述目的蛋白的N-聚糖谱(profile)(例如，如本文所述)与野生型植物产生的目的蛋白的N-聚糖谱不同。糖基化修饰可包括所述目的蛋白一种或多种聚糖的增加或减少。例如，所述目的蛋白可显示木糖基化减少、岩藻糖基化减少，或者同时显示木糖基化和岩藻糖基化都减少。或者，所述目的蛋白的N-聚糖谱可以这样一种方式被修饰，所述方式可使得半乳糖苷化的数量增加，并且任选地，木糖基化减少、岩藻糖基化减少或者木糖基化和岩藻糖基化均减少。此外，当生产复合目的蛋白时，其核苷酸序列可编码一种以上所述复合蛋白的肽或结构域。例如，如果所述目的蛋白是一种抗体，则其核苷酸序列可包含两种核苷酸序列，其中每种序列均编码所述抗体的一部分，例如一种核苷酸序列可编码抗体轻链，第二种序列编码抗体重链。图1给出了这种构建体的非限制性实例，其中构建体R612和R610的每一个都包括两种核苷酸序列，其中一个编码与在植物中有活性的调控区(例如但不限于US7，125,978中所述的质体蓝素启动子，所述文献以引用的方式纳入本文中)可操作地连接的C5-1LC(C5-1的轻链)，第二个编码与在植物中有活性的调控区(例如但不限于所述质体蓝素启动子，US7，125，978，所述文献以引用的方式纳入本文中)可操作地连接的C5_l的重链(C5-1HC)。如图1所示，对于R610，KDEL序列可与肽2A或2B之一的C末端区融合，例如，但不应被看做限制性的，所述KDEL序列可与所述抗体的重链融合以确保所述抗体被内质网滞留。由所述核苷酸序列编码的每种蛋白都可被糖基化。对用瞬时表达生产的纯化产物的考马斯染色显示存在多种低丰度的杂质。这些片段似乎是产物相关的，并且所有70kDa以上的杂质都含有至少一个Fab，如活性印迹所示(图3B)。植物提取物中存在的产物相关的杂质的成分和含量与在哺乳动物细胞生成系统中观察到的那些类似。因此，一般用于治疗性抗体纯化的纯化步骤(例如阴离子交换、亲和与阳离子交换)可容易地获得调控机构对治疗用途的蛋白所要求的纯度。如图6所示，通过使用本文所述的方法，可生产表现修饰糖基化谱的目的蛋白。例如，当目的蛋白与GNTl-GalT共表达时，产生具有免疫遗传学上不可检测的岩藻糖或木糖残基的目的蛋白。对目的蛋白的表位的MALDI-T0F分析表明，当目的蛋白与GalT或GNTl-GalT共表达时，可获得具有修饰糖基化模式的目的蛋白。所述植物、所述植物的一部分或植物材料可用作饲料，可对所述植物或所述植物的一部分进行最低程度的加工，或者所述目的蛋白可从所述植物或所述植物的一部分中提取出来，并且如果需要的话，所述可用标准方法分离和纯化所述目的蛋白。可对编码所述目的蛋白的核苷酸序列进行额外修饰以确保高产量。编码所述目的蛋白的核酸序列也可与编码这样一种活性序列的序列(例如但不限于，KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)或其他已知的ER滞留序列，如HDEL)融合，所述活性序列将所述蛋白滞留在内质网(ER)中。本文所述的蛋白生产的方法可包括使用可用作生产目的蛋白的"平台"的植物。例如，所述平台植物一般以稳定的方式表达一种或多种以某种方式修饰所述目的蛋白生产的蛋白，例如，产生具有修饰N-糖基化的目的蛋白。例如，所述平台植物可表达一种或多种编码GalT、GNTl-GalT、或GalT和GNTl-GalT的第一种核苷酸序列。为生产所述目的蛋白，在修剪所述植物形成平台植物或平台植物的一部分后，用瞬时转化将编码所述目的蛋白的第二种核苷酸序列引入所述平台植物中，然后所述第二种核苷酸序列被表达从而产生的所述目的蛋白，在这种情况下包含具有修饰的N-糖基化的聚糖。然而应理解，可根据需要使用稳定表达其他蛋白的平台植物用于修饰所述目的蛋白。所述植物或所述植物的一部分可用作饲料，或者可对所述植物或所述植物的一部分进行最低程度的加工，或者所述目的蛋白可从所述植物或所述植物部的一分中提取出来，并且如果需要的话，所述可用标准方法分离和纯化所述目的蛋白。本发明提供一种用平台植物或平台植物的一部分表达具有修饰糖基化的目的蛋白的方法，所述平台植物或平台植物的一部分包括编码GalT、GNTl-GalT、GalT和GNTl-GalT的核苷酸序列或它们的组合，其中每种序列都与在所述平台植物中有活性的调控区可操作地连接。所述平台植物或平台植物的一部分因此可用于表达编码一种或多种目的蛋白的第二种核苷酸序列，所述第二种核苷酸序列与一个或多个在所述平台植物中有活性的第二调控区可操作地连接。对所述第一种核苷酸序列、第二种核苷酸序列或第一种核苷酸序列和第二种核苷酸序列进行密码子优化，以在所述平台植物或平台植物的一部分中表达。所述方法包括，首先修剪所述平台植物或所述平台植物的一部分。修剪后，将与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接的编码目的蛋白的一种或多种核酸序列以瞬时方式引入所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分中。然后将所述植物或所述植物的一部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。对编码目的蛋白或修饰所述目的蛋白糖基化的酶的核苷酸序列(例如GalT、GNTl-GalT、GalT和GNTl-GalT或它们的组合)进行密码子优化以提高在所述植物中的表达水平。密码子优化是指选择用于合成结构基因或其片段的寡核苷酸构建块的以及它们随后的酶装配的合适DNA核苷酸，从而接近植物中的密码子选择。所述序列可为用与由Sardana等人(PlantCellR印orts15:677-681;1996)概述的方法类似的方法针对植物中的密码子选择而优化的合成序列。来自双子叶植物的高表达基因的密码子选择表可从若干来源获得，包括Murrayetal.(NucAcidsRes.17:477-498;1989)。此外，序列优化也可包括减少密码子串联重复、消除隐蔽剪切位点、减少重复序列(包括反向重复)并可使用例如Leto1.0(Entelechon，Germany)石角定。"可操作地连接"是指特定序列直接或间接相互作用以执行预期功能如介导或调节基因表达。例如，可操作地连接的序列的相互作用可被与所述可操作地连接的序列相互作用的蛋白所介导。当目标序列被功能性地连接从而允许所述目标序列的转录被所述转录调控区介导或调节时，所述转录调控区就与所述目标序列可操作地连接。术语"植物的一部分"是指从植物获得的任何部分，包括整个植物，来自所述植物的组织例如但不限于叶、叶和茎、根，空中部分包括叶、茎，以及任选地所述植物的花齐部分、来自所述植物的细胞或原生质体。术语"植物材料"是指来自植物的任何材料。植物材料可包括整个植物、组织、细胞或它们的任何组分。此外，植物材料可包括细胞内植物成分、细胞外植物成分、植物的液体或固体提取物，或它们的组合。此外，植物材料可包括植物、植物细胞、组织、液体提取物或它们的组合，并来自植物叶、茎、果实、根或它们的组合。植物材料可包括未经任何加工步骤处理的植物及其一部分。然而，也应涵盖，所述植物材料可经过如下定义的最低程度的加工步骤处理或更严格的加工处理，包括用本领域公知的技术(包括但不限于色谱、电泳等)进行部分或大量蛋白纯化。术语"最低程度的加工"是指植物材料(例如包含目的蛋白的植物或其一部分)被部分纯化以得到植物提取物、匀浆物、植物匀浆物组分等(即最低程度的加工)。部分纯化可包括但不限于，打破植物细胞结构从而获得包含可溶性植物成分的组合物，以及可通过例如但不限于离心、过滤或其组合分离的不溶性植物成分。在这点上，在叶或其他组织的细胞外空间中分泌的蛋白可用真空或离心提取容易地得到，或者组织可在压力下通过穿过滚筒或研磨等而被提取以从所述细胞外空间中榨出或释放所述蛋白。最低程度的加工也可包括制备可溶性蛋白的粗提取物，因为这些制品会含有来自副植物产物的微量杂质。此外，最低程度的加工可包括水相提取叶中的可溶性蛋白，然后用任何合适的盐沉淀。其他方法可包括大规模浸渍和汁液提取以允许直接使用所述提取物。所述植物材料可以植物材料或组织的形式口服递送给受试者。所述植物材料可作为膳食补充剂的一部分连同其他植物一起给予，或以胶囊封装的形式给予。也可根据需要浓縮所述植物材料或组织以提高或增加适口性，或连同其他材料、组分或药物赋形剂一起提供。应涵盖，可根据需要和情况以各种方式将包含目的蛋白的植物给予受试者，例如动物或人类。例如，可提取来自所述植物的目的蛋白，然后以粗制、部分纯化或纯化形式使用。如果所述蛋白将被纯化，那么它可从可食用或不可食用的植物中生产。此外，如果所述蛋白通过口服给予，那么可收集所述植物组织并直接喂送给所述受试者，或者所收集的组织可在喂送前被干燥，或者不进行收集而使动物直接啃食所述植物。将所收集的植物组织作为动物饲料中的食品增补剂提供也被认为在本发明的范围之内。如果将所述植物组织在几乎不进行或不进行进一步加工的情况下喂送给动物，那么优选所给予的植物组织是可食用的。如在实施例中更详细地描述的，将GalT、GNTl-GalT和所述目的蛋白以瞬时方式引入植物中。用合适的抗体进行的免疫分析表明，所述转化细胞中存在分子量为150kDa的蛋白(图2、3A和3B)。此外，在来自表达任一构建体的植物的提取物中检测到了GalT或GNTl-GalT，并且当GNTl-GalT在所述植物中表达时，观察到了目的蛋白的N-糖基化的改变(图6)。因此，重组表达的GalT或GNTl-GalT在植物中是有生物学活性的。"类似物"或"衍生物"包括对编码GalT(SEQIDNO:14)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17)的核苷酸序列的任何取代、删除或加入，只要所述序列编码可修饰目的蛋白的糖基化谱的蛋白，所述修饰为，例如与在无GalT(SEQIDNO:14)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17)的情况下产生的目的蛋白的糖基化谱相比，减少所述目的蛋白的聚糖的岩藻糖基化、木糖基化或者岩藻糖基化和木糖基化二者，或者增加所述目的蛋白的半乳糖苷化。例如由所述序列编码的蛋白可在N-聚糖成熟过程中加上一个末端半乳糖。核酸序列的衍生物和类似物一般与所述核酸序列具有80%以上的相似性(同一性)。对于两种或两种以上的核酸或多肽序列，术语"同一的"或"同一性"百分比是指，当用序列比较算法(例如Altschuletal.，Nuc.AcidsRes.25:3389—3402(1977)禾口Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)以及这些算法的任何升级版)或通过手动比对和肉眼检查，在一个比较窗口或指定区域上进行最大对应的比较和比对时，测得两种或两种以上序列或子序列相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即对特定区域为60%同一性，优选65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的同一性)。序列相似性可通过使用默认参数(Program:blastn;Database:nr;Expect10;filter:lowcomplexity;Alignment:pairwise;Wordsize:11)，用BLAST算法来测定。所述序列的类似物或衍生物也包括在严格杂交条件下(参见Maniatisetal.，inMolecularCloning(ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory,1982，p.387-389，或Ausubel，etal.(eds)，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1，GreenPublishingAssociates,Inc.，andJohnWiley&Sons,Inc.，NewYork,atp.2.10.3)，与本文所述的GalT(SEQIDNO:14)和GNTl-GalT(SEQIDN0:17)序列中的任何一个杂交的那些核苷酸序列，只要所述序列编码可修饰目的蛋白糖基化谱(例如，与在无GaIT(SEQIDNO:14)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17)的情况下产生的目的蛋白的糖基化谱相比，减少所述目的蛋白的聚糖的岩藻糖基化、木糖基化或岩藻糖基化和木糖基化二者，或者增加所述目的蛋白的半乳糖苷化)的蛋白。例如由所述序列编码的蛋白可在N-聚糖成熟过程中加上一个末端半乳糖。这种严格杂交条件的实例可为在7%SDS、lmMEDTA、0.5MNa2HP04、pH7.2中在65。C下与合适探针例如但不限于[gama_32P]dATP标记的探针杂交16-20小时。然后在5%SDS、lmMEDTA、40mMNa2HP04、pH7.2中洗涤30分钟。然后在l%SDS、lmMEDTA、40mMNa2HP04、pH7.2中洗涤30分钟。可重复在这种缓冲液中的洗涤以降低背景。"调控区"、"调控元件"或"启动子"是指一般但不总是位于基因的蛋白编码区上游的核酸部分，其可存在于DNA或RNA中，或既存在于DNA又存在于RNA中。当调控区具有活性，并与目的基因可操作的关联或可操作地连接时，可导致所述目的基因的表达。调控元件可介导器官特异性或者控制发育基因或时序基因活化。"调控区"包括启动子元件、具有基础启动子活性的核心启动子元件、可由外界剌激诱导的元件、介导启动子活性的元件如负调控元件或转录增强子。如本文所用，"调控区"也可包括转录后有活性的元件，例如，调节基因表达的调控元件如翻译和转录增强子、翻译和转录抑制子、上游激活序列以及mRNA不稳定决定子。若干这些后期元件可位于所述编码区的近端。在本发明的上下文中，术语"调控元件"或"调控区"一般是指一般但不总是位于一个结构基因的编码序列上游(5')的一段DNA序列，其通过提供对RNA聚合酶和/或转录所需的其他因子的识别以在特定位点起始，从而控制所述编码区的表达。然而，应理解，位于内含子中或所述序列的3'端的其他核苷酸序列也可有助于调控目的编码区的表达。用于提供对RNA聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点起始的调控区的一个实例为启动子元件。大多数但非全部真核细胞启动子元件含有TATA盒——通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处的由腺嘌呤和胸腺嘧啶的核苷酸碱基对构成的一段保守核酸序列。启动子元件包括负责起始转录的基础启动子元件以及调整基因表达的其他调控元件(如上所述)。组成型调控区在植物的各个部分和在植物的整个发育中持续指导基因表达。已知组成型调控元件的实例包括与CaMV35S转录物(0de11etal.，1985，Nature,313:810-812)、水稻肌动蛋白l(actin1)(Zhangetal，1991，PlantCell,3:1155-1165)、肌动蛋白2(Anetal.，1996，PlantJ.，10:107-121)或tms2(U.S.5，428，147，其以引用的方式纳入本文中)，以及磷酸丙糖异构酶1(Xuet.al.，1994，PlantPhysiol.106:459-467)基因、玉米泛素1基因(Cornejoetal，1993，PlantMol.Biol.29:637-646)、拟南芥(Arabidopsis)泛素1和6基因(Holtorfetal，1995，PlantMol.Biol.29:637-646)以及烟草翻译起始因子4A基因(Mandeletal，1995PlantMol.Biol.29:995-1004)关联的启动子。本文所用的术语"组成型"并非必然表示处于所述组成型调控区控制下的基因在所有细胞类型中都以相同水平表达，而是所述基因在广泛范围的细胞类型中表达，尽管经常观察到丰度的变化。来自光合基因的调控区或启动子也适用于本发明。例如，调控区或启动子可来自编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的大/小亚基(rubisco;US4，962，028，其以引用的方式纳入本文中)、质体蓝素(US7，125，978，其以引用的方式纳入本文中；图lb;SEQIDNO:19)、叶绿素a/b结合蛋白(CAB;Leutwileretal.，1986，其以引用的方式纳入本文中)，ST-LS1(与光合系统II的放氧复合物关联；Stockhausetal.1989，其以引用的方式纳入本文中)的基因。—种或多种本发明的核苷酸序列可在任何合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于拟南芥(Arabidopsis)、苜蓿、油菜、芸苔属(Brassicaspp.)、玉米、烟草属(Nicotianaspp.)包括本氏烟草(Nicotianabenthamiana)禾口普通烟草(Nicotianatobaccum)、苜蓿、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花等。—个或多个本发明的嵌合遗传构建体可进一步包含3'非翻译区。3'非翻译区是指包含如下DNA片段的基因部分，所述DNA片段含有多聚腺苷酸化信号和任何其他能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号。所述多聚腺苷酸化信号的一般特征为影响所加入的多聚腺苷酸定位到mRNA前体的3'末端。多聚腺苷酸信号通常与标准形式5'AATAAA-3'的存在同源性而被识别，尽管变体并不少见。一个或多个本发明的嵌合遗传构建体也可根据需要进一步包括增强子(翻译或转录增强子)。这些增强子区对本领域技术人员来说是广为人知的，并且可包括ATG起始密码子和邻近序列。所述起始密码子必须与编码区的开放阅读框同相(inphase)以确保整个序列的翻译。合适的3'区的非限制性实例为包括质体蓝素3'UTR的3'转录非翻译区，包括转录终止序列(SEQIDNO:20);农杆菌致瘤(Ti)质粒基因(如本领域所知的)如胭脂碱合酶(Nosgene)，和植物基因如大豆储存蛋白基因和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基的多聚腺苷酸化信号。如果需要，本发明的构建体可进一步被操作以包括选择性标记。然而，这可能不需要。可用的选择性标记包括提供对化学药品如抗生素(例如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素)或除草剂(如草胺膦、草甘膦、氯磺隆，等等)的抗性的酶。类似地，可使用产生可通过颜色改变识别的化合物的酶如GUS(13-葡萄糖醛酸酶)，或产生可通过发光识别的化合物的酶，如荧光素酶或GFP。所考虑到的本发明的一部分还包括含有本发明嵌合基因构建体，可用作适于本文所述的瞬时蛋白表达的平台植物的转基因植物、植物细胞或种子。从植物细胞再生整个植物的方法也为本领域所知。通常，将转化的植物细胞在合适的培养基中培养，所述培养基可含有选择性试剂如抗生素，其中选择性标记用于方便对转化的植物细胞的确认。一旦形成愈伤组织，就可依据已知方法通过采用合适的植物激素促进芽形成，并且将所述芽转移至植物再生的根培养基中。因此所述植物可用于从种子或使用植物繁殖技术重复产生。转基因植物也可不使用组织培养而生成。稳定转化和再生这些生物体的方法已在本领域中建立并为本领域技术人员所知。获得转化和再生植物的方法对本发明并非关键性的。"转化"是指在基因型、表型或两者上均表现出的遗传信息(核苷酸序列)的物种间转移。遗传信息从嵌合构建体到宿主的物种间转移可为可遗传的且所述遗传信息的转移被认为是稳定的，或者所述转移可为瞬时的且所述遗传信息的转移不是可遗传的。本发明还包括如下合适载体，其包含适于与稳定或瞬时表达系统配合使用的所述嵌合构建体。所述遗传信息也可存在于一个或多个构建体中。例如，可将编码目的蛋白的核苷酸序列引入一个构建体中，将编码可修饰所述目的蛋白糖基化的蛋白的第二种核苷酸序列引入另一个构建体中。因此这些核苷酸序列可在本文所述的植物中以瞬时方式共表达。还可使用如下构建体，其包含既编码目的蛋白又可编码修饰所述目的蛋白糖基化谱的蛋白的核苷酸序列。在此情况下，所述核苷酸序列包括包含与启动子或调控区可操作地连接的编码所述目的蛋白的第一种核酸序列的第一序列，和包含编码可修饰所述目的蛋白糖基化谱的蛋白的第二种核酸序列的第二序列，所述第二序列与启动子或调控区可操作地连接。"共表达"是指两种或两种以上的核苷酸序列在所述植物中在大致相同的时间并且在所述植物的相同组织中表达。然而，所述核苷酸序列不需在完全相同的时间表达。而是，所述两种或两种以上核苷酸序列的表达方式使所编码的产物有机会相互作用。例如，可修饰所述目的蛋白糖基化的蛋白可在所述目的蛋白表达的时期之前或之中表达，从而使得发生对所述目的蛋白的糖基化的修饰。所述两种或两种以上核苷酸序列可用瞬时表达系统共表达，其中在两种序列都能表达的条件下，在大致相同的时间将所述两种或两种以上序列引入所述植物中。或者，包含所述核苷酸序列之一(例如编码可修饰所述目的蛋白糖基化谱的蛋白的序列)的平台植物可以稳定方式被转化，而将编码所述目的蛋白的另一种核苷酸序列以瞬时方式引入所述平台植物中。在这种情况下，编码可修饰所述目的蛋白糖基化谱的蛋白的序列可在所需发育阶段中在所需组织内表达，或者其表达可使用诱导启动子来诱导，并且编码所述目的蛋白的另一种序列可在相似条件下和相同组织中表达，以确保所述核苷酸序列共表达。可用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如WeissbachandWeissbach，MethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress,NewYorkVIII，pp.421-463(1988);GeiersonandCorey，PlantMolecularBiology,2dEd.(1988);以及MikiandIyer，FundamentalsofGeneTransferinPlants.InPlantMetabolism,2dEd.DT.De皿is，DHTurpin，DDLefebrve，DBLayzell(eds)，AddisonWesly，LangmansLtd丄ondon，pp.561-579(1997)。其他方法包括直接DNA导入、使用脂质体、电穿孔，例如使用原生质体、微注射、微粒或晶须、以及真空浸润。参见，例如，Bilang，etal.(Gene100:247-250(1991)，Scheidetal.(Mol.Gen.Genet.228:104-112，1991)，Guercheetal.(PlantScience52:111-116，1987)，Neuhauseetal.(Theor.ApplGenet.75:30-36，1987)，Kleinetal.，Nature327:70-73(1987);Howelletal.(Science208:1265，1980)，Horschetal.(Science227:1229-1231，1985)，DeBlocketal.，PlantPhysiology91:694-701，1989)，MethodsforPlantMolecularBiology(WeissbachandWeissbach，eds.，AcademicPressInc.，1988)，MethodsinPlantMolecularBiology(SchulerandZielinski，eds.，AcademicPressInc.，1989)，LiuandLomonossoff(JVirolMeth，105:343-348，2002，)，美国专利4,945,050;5,036,006和5，100，792，以及1995年5月10日提交的美国专利申请流水号08/438，666和1992年9月25日提交的07/951，715(全部所述文献都以引用的方式纳入本文中)。如下所述，瞬时表达方法可用于表达本发明的构建体(参见LiuandLomonossoff，2002，JournalofVirologicalMethods,105:343-348，其以引用的方式纳入本文中)。或者，可使用如K即ilaetal.，1997(其以引用的方式纳入本文中)所述的基于真空的瞬时表达方法。这些方法可包括，例如但不限于，农杆菌接种或农杆菌浸润、注射器浸润的方法，然而也可使用上述其他瞬时方法。用农杆菌接种、农杆菌浸润或注射器浸润时，包含所需核酸的农杆菌混合物进入组织(如叶、所述植物的空中部分(包括茎、叶或花)、所述植物的其他部分(茎、根、叶)或整个植物)的细胞间隙。穿过表皮后，农杆菌感染所述细胞并将t-DNA拷贝转移到所述细胞中。所述t-DNA作为游离基因被转录并且其mRNA被翻译，导致在感染细胞中产生所述目的蛋白，然而，t-DNA进入核内是暂时的。"目的基因"、"目的核苷酸序列"或"目的编码区"(这些术语可互换使用)是指将要在植物或植物的一部分中表达的任何基因、核苷酸序列或编码区。这种目的核苷酸序列可包括但不限于产物为目的蛋白的序列或编码区。目的蛋白的实例包括，例如但不限于，工业用酶例如纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、过氧化物酶、枯草杆菌蛋白酶；用于饲料、食品或饲料和食品两者的蛋白质补充料、保健品、增值产品或其组分；药物活性蛋白，例如但不限于生长因子、生长调节剂、抗体、抗原及其片段，或者它们用于免疫或疫苗的衍生物；等等。其他目的蛋白可包括但不限于，白细胞介素如IL-1到IL-24、IL-26和IL-27中的一个或多个、细胞因子、促红细胞生成素(EP0)、胰岛素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它们的组合，干扰素(例如干扰素a、干扰素|3、干扰素Y)、凝血因子(如因子VIII、因子IX或tPAhGH)、受体、受体激动剂、抗体、神经多肽、胰岛素、疫苗，生长因子(例如但不限于表皮生长因子、角质细胞生长因子、转化生长因子)、生长调节剂、抗原、自身抗原、它们的片段，或它们的组合。如果所述目的核苷酸序列编码对所述植物直接或间接有毒的产物，那么通过使用本发明的方法，可通过瞬时表达所述目的基因而在整个所述植物中下降这种毒性。如在以下实施例中详细描述的，目的蛋白例如但不限于具有修饰N-糖基化的抗体C5-l，在瞬时共表达GalT(SEQIDNO:14;Figurelb)或GNTl-GalT(SEQIDNO:17;Figurelc)的植物中被合成。如本文所述，瞬时表达方法的优点为用于抗体瞬时表达的农杆菌株的数目被最小化，这降低了费用、简化了操作并提高了系统的坚固性。由Giritchetal.(2006)提出的瞬时表达倚赖两个非竞争性病毒载体上的抗体的轻链和重链的表达。该系统还需要用于表达provector组件、重组酶和两种病毒复制酶的6种不同农杆菌培养物的共浸润。从商业前景上来说，6种接种物的同时制备代表在设备和验证时间上以及扩大经营的高额费用。此外，增加细菌载体的数量可影响倚赖多种转基因协同表达的表达系统的坚固性。通过比较，本文提出的系统只需要两种不同农杆菌培养物的共浸润。通过将编码沉默抑制子如HcPro或任何其他调节所述目标蛋白的序列加入与所述抗体表达盒相同的质粒中，农杆菌培养菌的数目可减少到一个。序列表序列SEQIDN0:序列SEQIDN0:XmaI-pPlas.c1GNT-GalT(氨基酸)18SacI_ATG_pPlas.r2质体蓝素启动子和5'UTR19SacI-PlasTer.c3质体蓝素3'UTR和终止子20EcoRI-PlasTer.r4GNT1的CTS结构域(核苷酸)2119<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例实施例1:表达盒R610、R612、R514(图1)、R621和R622(图5)的装配所有操作都是使用SambrookandRussel(2001)中的常规分子生物方案完成的。所用的寡核苷酸引物如下Xmal-pPlas.c:SEQIDNO:15'-AGTTCCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTC-3'SEQIDNO:1SacI-ATG-pPlas.r:SEQIDNO:25'-AATAGAGCTCCATTTTCTCTCAAGATGATTAATTAATTAATTAGTC-3'SEQIDNO:2SacI-PlasTer.c:SEQIDNO:35'-AATAGAGCTCGTTAAAATGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGG-3,SEQIDNO:3EcoRI-PlasTer.r:SEQIDNO:45'-TTACGAATTCTCCTTCCTAATTGGTGTACTATCATTTATCAAAGGGGA-3'SEQIDNO:4Plasto-443c:SEQIDNO:55'-GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC-3'SEQIDNO:5Plas+LC-C51.r:SEQIDNO:65'-ATCTGAGGTGTGAAAACCATTTTCTCTCAAGATG-3,SEQIDNO:6LC-C51.c:SEQIDNO:75'-ATGGTTTTCACACCTCAGATACTTGG-3'SEQIDNO:7LC-C51XhoSac.r:SEQIDNO:85'-ATATGAGCTCCTCGAGCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3，SEQIDNO:8Plas+HC-C51.r:SEQIDNO:95'-CAAGGTCCACACCCAAGCCATTTTCTCTCAAGATG-3,SEQIDNO:9HC-C51.c:SEQIDNO:105'-ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC-3'SEQIDNO:10HC-C51XhoSac.r:SEQIDNO:115'-ATAAGAGCTCCTCGAGTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3'SEQIDNO:11HC-C51KDEL(SacI).r:SEQIDNO:125'-ATAAGAGCTCTCAAAGTTCATCCTTTTTACCAGGAGAGTGGG-3'SEQIDNO:12XhoTEV.c:SEQIDNO:235'-TTTGGAGAGGACCTCGAGAAATAACAAATCTCAACAC-3'SEQIDNO:23TEV+LC-C5-1.r:SEQIDNO:245'-ATCTGAGGTGTGAAACCATTGCTATCGTTCGTAAATGGTG-3'SEQIDNO:24LC-C5-1.c:SEQIDNO:255'-ATGGTTTTCACACCTCAGATACTTGG-3'SEQIDNO:125LC-C5-lSphSac.r:SEQIDNO;265'-ATATGAGCTGCGATGCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3，SEQIDNO:26第一个克隆步骤包括装配含有苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件的受体质粒。用寡核苷酸引物XmaI-pPlas.c(SEQIDN0:1)和SacI-ATG-pPlas.r(SEQIDNO:2)从苜蓿基因组DNA中扩增质体蓝素启动子(US专利7，125，978，其以引用的方式纳入本文中)和5'UTR序列。用Xmal和Sacl消化获得的扩增产物并连接到预先用相同酶消化的pCAMBIA2300中，以生成pCAMBIA-PromoPlasto。类似地，用如下引物:SacI-PlasTer.c(SEQIDNO:3)和EcoRI-PlasTer.r(SEQIDNO:4)从苜蓿基因组DNA中扩增质体蓝素基因的3，UTR序列和终止子(图lc;SEQIDNO:20的1-399位核苷酸)，并用Sacl和EcoRI消化所得产物，再插入pCAMBIA-PromoPlasto的相同位点中以生成pCAMBIAPlasto。制备质粒R610和R612以使得含有处于苜蓿的质体蓝素启动子调控下的C5_l轻链和C5-l重链编码序列，作为串联构建体；R610被设计为允许装配的IgG滞留在内质网上，并包含与C5-l的重链融合的KDEL序列，而R612被设计为允许分泌。C5-l表达盒的装配是用Darveauetal.(1995)所述的PCR介导的连接方法进行。为将所述轻链编码序列装配到所述质体蓝素启动子的下游，第一步包括用pCAMBIAPlasto为模板并用如下引物Plasto-443c(SEQIDN0:5)和Plas+LC-C51.r(SEQIDN0:6，重叠部分以下划线标出)通过PCR扩增起始ATG下游的D'Aoust等人(US专利7，125，978，其以引用的方式纳入本文中)描述的苜蓿质体蓝素启动子的前443个碱基对(bp)(图lb或SEQIDNO:19的556-999位核苷酸)。并行地，用如下引物LC-C51.C(SEQIDNO:7)和LC_C51XhoSac.r.(SEQIDNO:8，重叠部分以下划线标出)从质粒pGA643-ka卯a(Khoudietal.，1999)中PCR扩增所述轻链编码序列。将所获得的两个扩增产物混合在一起并在以Plasto-443c(SEQIDNO:5)和LC-C51XhoSac.r(SEQIDNO:8)为引物的第三个PCR反应中用作模板。用于第一个反应的引物Plas+LC-C51.r(SEQID)NO:6)和LC-C51.C(SEQIDNO:7)之间的重叠部分导致在第三个反应中所述扩增产物的装配。用DraIII和Sacl消化从第三个PCR反应中获得的装配产物并将其连接到用DraIII和Sacl消化的pCAMBIAPlasto中以生成质粒R540。通过用如下引物:Plasto-443c(SEQIDNO:5)和Plas+HC-C51.r(SEQIDNO:9;重叠部分以下划线标出)以pCAMBIAPlasto为模板通过PCR扩增质体蓝素的起始ATG上游的443bp(图lb和SEQIDNO:19的556-999位核苷酸)，将所述重链编码序列与质体蓝素上游调控元件融合。将这些反应的产物混合并使用引物Plasto-443c(SEQIDNO:5)和HC-C51XhoSac.r(SEQIDNO:11)在第三个PCR反应中装配。用DraIII和Sacl消化获得的片段并连接到pCAMBIAPlasto的DraIII和Sacl位点之间。将获得的质粒命名为R541。以质粒R541为模板用引物Plasto-443c(SEQIDNO:5)和HC-C51KDEL(Sacl)r(SEQIDNO:12)通过PCR扩增将KDEL标签加入所述重链编码区的C末端。用DraIII和Sacl消化获得的片段并将其克隆到pCAMBIAPlasto的相同位点上，生成质粒R550。将轻链和重链表达盒装配在同一个二元质粒上的步骤如下用EcoRI消化R541和R550、钝化、用HindIII消化并将其连接到R540的HindIII和Smal位点上以生成R610(带有KDEL)和R612(不带KDEL;参见图1)。R514(图5a)所用的其他寡核苷酸引物如下Tev+HC-C51.2:SEQIDNO:165'-CAAGGTCCACACCCAAGCCATTGCTATCGTTCGTAAATGGTG-3,SEQIDNO:16HC-C51SphSac.rSEQIDNO:325'-ATAAGAGCTCGCATGCTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3，SEQIDNO:32全长C5-l轻链和重链基因(LC和HC)由H6ma-Qu6bec提供并使用Darveau(1995)所述的聚合酶链式反应(PCR)介导的方法将其克隆到植物二元表达载体的表达框架中。所述烟草蚀纹病毒(TEV)增强子首先用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和TEV+LC-C51(SEQIDNO:24)通过对TEV基因组RNA(Acc.No.NC001555)的RT-PCR进行扩增。并行地，使用LC引物LC-C51.C(SEQIDNO:25)和LC_C51XhoSac.r.(SEQIDNO:26)从质粒pGA643(Khoudietal.，1999)中通过PCR扩增C5_l轻链编码序列。将TEV和轻链扩增片段混合并使用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和LC_C51XhoSac.r(SEQIDNO:26)通过另一轮PCR反应装配。然后将所获得的TEV/C5-1LC片段纯化并以Xhol-Sacl消化的形式克隆到一个中间载体上2X35S启动子和NOS终止子之间的位置。图Id示出了所用的2X35S启动子(以粗体表示；SEQIDNO:33)和NOS终止子(以斜体表示；SEQIDNO:34)的序列以及所述限制位点的位置(以下划线示出)。然后将此表达盒以HindIII-EcoRI片段的形式转移到所述pCAMBIA2300二元质粒中以生成质粒R512。为生成pR513，通过用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和TEV+LC-C51.r(SEQIDNO:16)对TEV基因组RNA(Acc.No.NC001555)的RT-PCR来扩增TEV增强子。并行地，用引物HC-C51.c(SEQIDNO:10)和HC_C51SphSac.r(SEQIDNO:32)通过PCR来扩增所述抗体的重链编码序列。将获得的TEV和重链扩增片段混合并用引物XhoTEV.c(SEQIDNO:23)和HC-C51XhoSac.r(SEQIDNO:32)通过PCR装配。然后将所获得的TEV/C5-1HC片段纯化、用Xhol和Sacl消化并克隆到中间载体上2X35S启动子和NOS终止子之间的相同位点。图Id示出了所用的2X35S启动子(SEQIDNO:33)和NOS终止子(SEQIDNO:34)的序列以及所述限制位点的位置。然后将所获得的含有2X35S/TEV/C5-1HC/NOS片段的质粒用EcoRI消化，用Klenow片段聚合酶钝化末端，然后再用HindIII消化。然后将此HindIII-EcoRI(钝化)片段连接到HindIII-SmaI消化的R512中以生成质粒R514。R621和R622(图5a)——所用的寡核苷酸引物如下FgalTSEQIDNO:275'-GACTCTAGAGCGGGAAGATGAGGCTTCGGGAGCCGCTC-3，SEQIDNO:27RgalTFlagStuSEQIDNO:285'-AAGGCCTACGCTACTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCGCACGGTGTCCCGAAGTCCAC-3'SEQIDNO:28FGNTSEQIDNO:295'-ATCGAAATCGCACGATGAGAGGGAACAAGTTTTGC-3，SEQIDNO:29RGNTSpeSEQIDNO:305'-CGGGATCCACTAGTCTGACGCTTCATTTGTTCTTC-3'SEQIDNO:30FgalTSpeSEQIDNO:315'-GGACTAGTGCACTGTCGCTGCCCGCCTGC-3，SEQIDNO:31从pBLTI121装配了用于GalT和GNTlGalT表达的质粒(Pagnyetal.，2003)。通过用EcoRI消化从pUC19-hGalT(Watzeleetal.，1991)中分离人P(1，4)-半乳糖基转移酶(hGalT)基因(UDP-半乳糖13-N-乙酰葡萄糖胺P_(1，4)-半乳糖基转移酶；EC2.4.1.22)。Klenow处理后，将1.2kb的hGalT片段克隆到pBLTI221的Smal位点上，生成质粒pBLTI221hGalT。然后用引物FGalT(SEQIDNO:27)和RGalTFlagStu(SEQIDNO:28)通过PCR扩增将flag标签融合到所述编码区的C末端。然后通过将此Xbal-Stul片段克隆到二元载体pBLTI121中生成R622。用FGNT(SEQIDNO:29)和RGNTSpe(SEQIDNO:30)为引物并用编码N-GNTI的普通烟草(N.tobacum)cDNA为模板，通过PCR扩增对应于所述跨膜结构域的N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GNTI)的前77个氨基酸。首先将所得扩增产物克隆到PGEM-T载体中，再用Apal和BamHI消化获得的质粒，然后将其连接到pBLTI221中生成名为pBLTI221-GNTI的质粒。通过用引物FGalTSpe(SEQIDNO:31)和RgalTFlagStu(SEQIDNO:28)对pBLTI221hGalT的PCR扩增来获得hGalT的催化结构域，并分别在5'和3'末端形成Spel和Stul位点。然后用相同位点(Spel和Stul)将所述Spel/StulhGalT片段克隆到pBLTI221-GNTI中，生成pBLTI221-GNTIGalT。最后，用XbaI和Stul消化pBLTI221-GNTIGalT，分离GNTIGalT编码片段，然后将此片段克隆到所述二元载体pBLTI121中生成R621。将所有克隆测序以确认所述构建体的完整性。按照E.coli转化的方法(W.S.Dower，Electroporationofbacteria,In"GeneticEngineering〃，Volume12，PlenumPress,NewYork,1990，J.K.Setloweds.)使用GenePulserII装置(Biorad，Hercules,CA，USA)通过电穿孔法(H6fgenandWillmitzer,1988)用所述质粒转化根癌农杆菌(Agrobacteiumt聽faciens)(AGL1;ATCC，Manassas,VA20108，USA)。通过限制酶图谱确认全部根癌农杆菌株的完整性。按Hamiltonetal.(2002)所述制备HcPro构建体。輔你l2纖物薩燃、辭亂她辦織驗在装满商品化泥煤苔基质的平板中将本氏烟草的种子培养成植株。所述植株可在16/8的光照时间和白天25t:/夜晚2(rC的温度范围内的温室中生长。播种之后3周，挑出单个植株，移植到盆中并使其在相同环境条件的温室中再生长3周。转化前，在下述各个时间通过从植株上摘心或通过化学处理所述植株来去除顶芽和腋芽。在添加有10mM2-[N-2吗啉代]乙磺酸(MES)、20yM乙酰丁香酮、50yg/ml卡那霉素和25iig/ml羧节青霉素，pH5.6的YEB培养基中培养农杆菌株R612、R610、R621、R622或35SHcPro至0D6。。达到0.6_1.6。用前将农杆菌悬浮液离心并在浸润培养基(10mMMgC12和10mMMES，pH5.6)中重悬浮。按Liu禾口Lomonossoff(2002，JournalofVirologicalMethods,105:343-348)所述进行注射器浸润。对真空浸润，将根癌农杆菌悬浮液离心，在所述浸润培养基中重悬浮，并贮存在fC下过夜。浸润当天，将培养物批次稀释2.5倍并可在用前加热。将本氏烟草的整个植株倒置在真空度为20-40Torr的密封不锈钢箱中的细菌悬浮液中2分钟。注射器或真空浸润后，将植株转移回温室培养4-5天至收获。叶采样和总蛋白提取培养后，收获植物的空中部分，在-S(TC下冷冻，压碎并分成1.5或7.5g的子样品。通过将冷冻压碎的植物材料的全部子样品在3倍体积的冷的50mMTrispH7.4、0.15MNaC1、0.1%TritonX-100、lmM苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride)和lOiiM胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymostatin)中匀浆来提取总可溶性蛋白。匀浆后，将浆料在4t:下以20000g离心20分钟，并保存这些澄清的粗提取物(上清液)以待分析。用牛血清白蛋白作为参考标准，通过Bradford法(Bio-Rad，Hercules，CA)测定澄清的粗提取物中的总蛋白含量。实施例3:蛋白质分析、免疫印迹和ELISAC5-l是一种抗人小鼠IgG，因此其检测和定量可通过其与人IgG的特征性亲和力(活性印迹)或者通过其与抗小鼠IgG的免疫反应活性来进行。通过SDS-PAGE分离总粗提取物中的蛋白或纯化抗体，并用考马斯亮蓝R-250或G-250染色或者将其电转化到聚偏氟乙烯膜(RocheDiagnosticsCorporation,Indian即olis，IN)上以进行免疫检测。免疫印迹之前，在4t:下用含有5%脱脂牛奶和0.1%Tween-20的Tris缓冲盐溶液(TBS-T)封闭所述膜16-18小时。通过用如下抗体孵育进行免疫印迹过氧化物酶缀合的羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA，Cat#l15-035-146)(在含2^脱脂牛奶的TBS-T中为0.04iig/ml)、过氧化物酶缀合的人IgG抗体Gam騰xBayerCorp.，Elkhart，IN)(在含2^脱脂牛奶的TBS-T中为0.2iig/ml)或多克隆羊抗小鼠IgG抗体(重链特异的)(Sigma-Aldrich，St-Louis，MO)(在含2%脱脂牛奶的TBS-T中为0.25yg/ml)。用过氧化物酶缀合的驴抗山羊IgG抗体(JacksonlmmunoResearch)(在含2%脱脂牛奶的TBS-T中为0.04g/ml)作为用所述重链特异性抗体处理的膜的第二抗体。通过用鲁米诺(luminol)(RocheDiagnosticsCorporation)做为底物的化学发光来检测免疫反应复合物。人IgG抗体和辣根过氧化物酶的缀合是通过使用EZ-LinkPlusActivatedPeroxidase缀合试剂盒(Pierce,Rockford，IU进行。EIISA定量检测法在4。C下用含有2.5iig/ml对IgGl重链特异的山羊抗小鼠抗体(SigmaM8770)的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.0)包覆多孔板(Immulon2HB，ThermoLabSystem,Franklin,MA)16-18小时。然后通过在37。C下在含有1%酪蛋白的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(PierceBiotechnology,Rockford,II)中孵育1小时来阻断多孔板。用纯化的小鼠IgGl对照(SigmaM9269)的稀释液获得标准曲线。当进行所述免疫检测时，全部稀释液(对照和样品)都在来自被浸润植物组织的植物提取物中进行并用模拟接种物孵育，从而消除任何基体效应。在37t:下用蛋白样品和标准曲线稀释物孵育板1小时。用含有O.1%Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤3次后，在37t:下用过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(在阻断溶液中为0.04iig/ml)(JacksonImmunoResearch115-035-146)孵育所述板1小时。重复用PBS-T洗涤并用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)SureBlue过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)孵育所述板。所述反应通过加入INHCl终止并在450nm处读取吸光度。将每个样品都重复检测3次，并在所述标准曲线的直线部分通过插值求得浓度。实施例4:IgG纯化从叶材料中纯化C5-l包括取出冷冻的本氏烟草叶(100-150g)，加入含20mM磷酸钠、150mMNaCl和2mM焦亚硫酸纳，pH5.8_6.0的溶液中，并在室温下用商品化混合器混合2-3分钟。通过在MiraclothTM(Calbiochem，SanDiego，CA)上粗过滤去除不溶性纤维并在滤出液中加入10mM苯甲基磺酰氟(PMSF)。用1MHC1将提取物的pH调节至4.8±0.1并通过在2-8t:下以18000g离心15分钟使其澄清。用2MTRIS将上清液的pH调节至8.0±0.l，通过在2-8"下以18000g离心15分钟再次使其澄清，然后在依次0.8和0.2ym的膜(PallCorporation,Canada)上过滤。用0.2ft2有效面积的截留量为100kDa分子量的超滤膜(GEHealthcareBiosciences,Canada)通过切向流过滤浓縮滤过的材料，以使澄清材料的体积降低到原来的1/10到1/5。然后将所浓縮的样品加到5mmx5cm(lmL柱体积)的重组蛋白G-S印haroseFastFlow柱(Sigma-Aldrich，St-Louis，M0，Cat.#P4691)上。用5倍柱体积的含20mMTRIS-HC1，150mMNaClpH7.5洗涤所述柱。用pH2.9-3.0的lOOmM甘氨酸洗脱所述抗体，并收集到含有计算体积的1MTRIS-HClpH7.5的试管中以立即达到中性PH。将收集的洗脱抗体级分在2-『C下以21000g离心15分钟并贮存在-S(TC下至分析。纯化后，清洗所述亲和柱并按照厂商说明书贮存。相同的色谱填料可重复用于若干次纯化而不发生纯化性能的明显改变(检测最多至10次循环)。实施例5:N-糖基化分析将含有C5-l(50iig)的样品在15%SDS/PAGE上电泳。用考马斯亮蓝显示重链和轻链，切下对应于所述重链的蛋白条带并切成小的片段。将片段用600yL0.1MNH4HC03/CH3CN(1/1)溶液洗涤3次，每次15分钟，然后干燥。通过在56。C下将所述凝胶片段置于600iiL含有O.1MDTT的0.1M朋03溶液中孵育45分钟将二硫键还原。通过在室温下加入600yL含有55mM碘乙酰胺的0.1MNH4HC03溶液进行烷基化30分钟。丢弃上清液，再次在NH4HC030.1M/CH3CN(1/1)中洗涤聚丙烯酰胺片段。然后在37。C下在600iiL的0.05MNH4HC03溶液中用7.5yg胰蛋白酶(Promega)消化蛋白16小时。加入200iiLCH3CN并收集上清液。然后先用200yL0.1M朋03，再用200yLCH3CN，最后用200yL5%甲酸洗涤凝胶片段。将所有上清液集中并冻干。用线性梯度的含0.1%TFA的CH3CN在C18反相柱(4.5x250mm)上进行HPLC来分离肽。收集馏分并冻干，在装有337-nm氮激光器的VoyagerDE-ProMALDI-TOF仪(AppliedBiosystems，USA)上通过MALDI-TOF-MS进行分析。用a-氰基-4-羟基肉桂酸(Sigma-Aldrich)作为基质，以延时提取反射模式进行质谱分析。輔你l6:她辦靴勺站鹏口忡麵IgG表汰说歸为检测基于质体蓝素的强表达盒是否能驱动完整装配的IgG的高度积聚，将一种小鼠抗人IgG(Khoudietel1997)C5-1轻链和重链的编码区装配在串联构建体中质体蓝素启动子和5'非翻译序列的下游，侧面为pCambia二元质粒的相同T-DNA片段上的质体蓝素3'非翻译区和转录终止序列，如实施例1所述和图1所示。在R612和R610表达盒(参见实施例1)中，所述轻链和重链编码序列都含有C5-l的天然信号肽(Khoudietal.1999)，但在R610中，KDEL肽的编码序列被加在所述重链的C末端以阻止所装配的IgG到高尔基体的移动。在克隆步骤和将质粒转到根癌农杆菌(AGL1)中之后，用被R612、R610或R514转化的农杆菌株(图1)注射器浸润三株本氏烟草植物的每片叶子，在温室条件下培养6天后按实施例2所述进行分析。在孵育期后，将每株植株的叶片冷冻、研磨，并且将冷冻的粉末混合以产生同质的样品，从所述通知样品中取2份均1.5克的子样品用于进行提取(来自每株植株，参见实施例3)。通过用一种多克隆山羊抗小鼠IgGl重链捕获并用一种过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)检测，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)对每个样品的总蛋白提取物中C5-l的含量进行定量(参见实施例3)。如图2A所示，在无沉默抑制子(HcPro)时，R610或R612(都含有所述质体蓝素启动子)的浸润与R514相比造成较高水平的蛋白积聚。在存在HcPro时，对R610和R612都观察到了表达水平的极大提高。如图2B所示，R612的农杆菌浸润导致每kg鲜重106mg抗体的积聚，而所述抗体的内质网滞留形式(R610)在相同条件下达到211mg/kgFW。由于已发现转录后基因沉默(PTGS)限制农杆菌浸润的本氏烟草植物中的转基因的表达，以及马铃薯病毒Y的沉默抑制子(HcPro)的共表达减少转基因mRNA的特异性降解(Brignetietal.，1998)，因此检测了一种HcPro构建体(Hamiltonetal.,2002)的共浸润对C5-l表达增加的影响。R612和R610与HcPro的共表达与无HcPro时相比分别使抗体积聚水平增加5.3倍和3.6倍。在存在HcPro时，质体蓝素控制的C5_l表达在用R612浸润时达到558mg/kgFW的平均值、在用R610浸润时达到757mg/kgFW的平均值(图2A)。在R612和R610浸润的叶子的某些提取物中，最大C5-l表达水平都超过1.5g/kgFW(总可溶性蛋白的25%)。为了评估农杆菌浸润表达系统的可扩展性，在实施从K即ilaetal.(1997)改编的真空浸润法后对C5-1的积聚进行定量。在此系列实验中，整个植物的地上部分是用R612+HcPro或R610+HcPro真空浸润的，并在转移回温室6天后收获。为努力提供代表大规模生成系统的数据时，将来自若干植株的大约250g叶/叶柄的批量冷冻、研磨成均匀样品，并在每批中收集3个7.5g的子样品用于分析。如由ELISA定量所示的，C5-1的平均积聚水平对于R612和R610浸润分别达到了238和328mg/kgFW(图2B)。修剪的作用在用被合适质粒转化的农杆菌株真空浸润所述叶子之前1、2或3天，通过摘心从植物上机械地去除或者用乙烯利、B-nine(500卯m)或A-rest(4卯m)化学修剪3株本氏烟草植株的顶芽和腋芽。然后用流感抗原(构建体312，图1)、人IgG(构建体935，图1)浸润植物，并将所述植物在温室中培养6天后按实施例2所述进行分析。对照植物不进行修剪。所述培养时间后，将每株植物的叶子(生物量约20g)冷冻、研磨，并将得到的冷冻粉末混合以得到均匀样品，再从所述样品中取出2个1.5g的子样品用于提取(对于每株植物；参见实施例3)。通过用一种多克隆山羊抗小鼠IgGl重链捕获并用一种过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)检测，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)对每个样品的总蛋白提取物中的C5-1的含量进行定量(参见实施例3)。如图7A所述，在312(流感抗原)浸润前12小时机械修剪以去除顶芽和腋芽，导致与所述对照处理(不修剪)相比抗原积聚增加(150%)。在312浸润后，在用若干已知的抑制顶端优势的生长调节剂(乙烯利，500卯m;B-nine，2500卯m或A-rest，4.0卯m)处理，然后进行512农杆菌浸润的化学修剪的植物中也观察到了表达水平多至200%的增加。当在通过真空浸润(图7B)或注射器浸润(图7C)进行农杆菌浸润后12小时对植物进行机械修剪时，所述机械修剪也会导致免疫球蛋白935(hlgG，图1)的表达水平的增加。在农杆菌浸润前1-3天修剪植物导致如图8(机械修剪的植物)所示的蛋白(流感抗原；312图1)积聚的额外增加。当在浸润前1-2天对植物进行机械修剪时，观察到表达的显著增加。在浸润前3或7天进行化学修剪，也发现蛋白积聚比不修剪的植物增加。如图9所示，当目的编码区被光合启动子质体蓝素(启动子)驱动并且与修剪(真空浸润前12小时的机械修剪)及沉默抑制子的共表达相结合时，观察到抗体(935，图1)浸润后表达水平的增加。修剪后935与沉默抑制子HcPro的共表达导致抗体积聚水平与无HcPro时相比增加3-8倍。当修剪后与HcPro共表达时，质体蓝素(启动子)控制的表达达到280mg/kgFW的平均值。实施例7:所产生抗体的表征使用蛋白印迹分析(参见实施例3)揭示了，在注射器和真空浸润实验之后，在产生所述蛋白的分泌(R612)和内质网滞留(R610)形式的植物中C5-lIgG的装配和片段化的水平。用H+L过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG作为探针的免疫印迹首先用于突现最大量的抗体片段的存在，而不管它们在C5-1分子上的来源。如图3A所示，所有蛋白提取物都含有相似分子大小和相似相对丰度的片段，而不管所用的亚细胞定位方法或浸润方法。在每例中，观察到对应完整抗体的在约150kDa处的主带(>85%)，以及在约135kDa和约lOOkDa处的两个小带，说明所积聚的抗体只要以其完全装配的形式(H2L2)存在。有趣的是，相似电泳迁移率的片段也存在于从小鼠肿瘤细胞系(MOPC-21;Sigma#M9269)纯化的对照IgGl中，表明植物和哺乳动物细胞系中产生的片段化是相似的，并且很可能是由共同的蛋白酶活性导致的。使用检测用抗小鼠重链特异性抗体也获得了相似的结果。为检测所述提取物中存在的抗体片段的同一性，使用了活性印迹，其中用过氧化物酶缀合的人IgGl，即C5-l的抗原作为探针检测所印迹的蛋白。约150kDa的完全装配的抗体的同一性可见于图3B。此外，除了一条100kDa的条带以外，在蛋白质印迹中观察到的片段化模式(见图3A)，在所述活性印迹中也可见(图3B)。并非希望受理论约束，此结果表明该100kDA的片段不含有所述C5-l抗体的Fab区，并且可能，至少部分地，由重链的二聚体——一种抗体装配的中间体构成。輔你l8:碰舰禾口戸應網勿白條ffi使用单ProteinG亲和色谱步骤从所述生物质中纯化所述抗体，并且通过SDS-PAGE对所得抗体进行分析(参见实施例4)。图4A中考马斯染色的凝胶示出了所述ProteinG的洗脱馏分中一条150kDa的主带。这条带在分泌和内质网滞留形式中都代表超过85%的纯化产物，并且对于这两种形式杂质成分是相同的(图4A，泳道4和5)。用多克隆抗小鼠IgG作为探针的蛋白质印迹分析显示所述小鼠IgG来自所述纯化C5-l级分中的主要杂质。在还原条件下，在分别对应轻链和重链分子量的约26kDa和约55kDa处检测到两种主要产物(图4B，泳道2)。所述内质网滞留抗体的重链显示了比质外抗体的重链(图4B，泳道3)更高的电泳迁移率，这被解释为位于C末端的附加KDEL氨基酸和由于内质网中滞留导致的N-糖基化差异的综合结果。图4C显示，所纯化抗体(150kDa)与人IgGl结合，75、90、100和120kDa杂质片段也与人IgGl结合，突显了在这些片段中至少存在一个Fab节段。100kDa片段中存在Fab与粗提取物分析的结果相反，在粗提取物分析中该100kDa带不与人IgG结合。这被假设为在粗提取物中迁移至100kDa的含有Fab的片段的量太低以致用这种活性印迹检测不到；或者迁移至100kDa的片段由两种不同的分子组成，其中一种为重链二聚体(无Fab)而另一种含有抗原结合区。将2个不同浸润批次和每批中3个不同纯化组的纯化产物一起比较来评估这种抗体生产系统的重复性。所述纯化各组的考马斯染色SDS-PAGE分析显示了在所有组中都存在相同的带，并且相对丰度高度相似(图4D)。实施例9:通过人半乳糖基转移酶的共表达对抗体N-糖基化的修饰为研究瞬时共表达是否能用于在瞬时表达过程中控制新生蛋白的糖基化，制备了包含天然人P-l，4-半乳糖基转移酶(GalT)的35S基表达盒。R622包含GalT(图5B)，R621包含与N-乙酰葡萄糖胺转移酶(GNTI)的CTS结构域融合的GalT催化结构域(GNTlGalT;图5A)。选择N-乙酰葡萄糖胺转移酶(GNTI)的CTS结构域作为人GalT催化结构域的膜固着点，是因为GNTl在内质网和顺面高尔基体中的复合N-聚糖合成的早期阶段起作用(Saint-Jore-Dupasetal.，2006)。不希望被理论限制，GalT在蛋白成熟早期阶段的鳌合28活性可导致将13-1，4_半乳糖加在正在成熟的聚糖上并有效抑制核心的岩藻糖基化和木糖基化。这些构建体与C5-l共浸润到植物中。在HcPro的存在下用R612(C5-1的分泌形式)、R612+R621(GNTlGalT)或R612+R622(GalT)浸润本氏烟草植株。图6示出了对从这些生物质样品中纯化的C5_l的免疫学分析。通过用与P-l，4-半乳糖特异性结合的鸡冠剌桐凝集素(Erythrinacristagaliagglutinin,ECA)进行的亲和检测评估了所述抗体的半乳糖苷化。不出所料，当C5_l单独表达时没有检测到半乳糖(R612;图6)。在从R512+R622(GalT)的共浸润物中纯化的C5_l中观察到了半乳糖苷化，但在从R612+R621(GNTlGalT，图6)的共浸润物中纯化的C5_l中没有观察到半乳糖苷化。用抗a-l，3-岩藻糖抗体进行的蛋白质印迹显示了在无半乳糖基转移酶时表达的对照C5-l上的N-聚糖的岩藻糖基化。不管用哪种浸润方法，在与GNTlGalT共表达的抗体上都没有检测到N-聚糖的岩藻糖基化，尽管与天然GalT的共表达并没有导致所述抗体的岩藻糖基化发生可检测的减少(图6)。用抗13-1，2-木糖特异性抗体获得了相似的结果在与GNTlGalT共表达的C5-l上完全不存在木糖特异性免疫信号，而当C5-l与GalT共表达时存在这种信号。对相同的提取物进行了用于直接肉眼评估完全装配的IgG的考马斯染色凝胶电泳，以及蛋白质印迹和活性印迹。基于这一数据，所述抗体表达系列达到1.5g/kg鲜重的产量，在粗产物中超过85%的产物由约150kDa的全长四聚体IgG组成。在所述重链的C末端加上KDEL肽已被前人用于通过介导所述抗体从高尔基体回到内质网的反演来增加抗体积聚(2-10X)(Schillbergetal.，2003)。用本文所述的表达系统，当不使用HcPro沉默抑制子时，在C5-l的重链上加上KDEL肽使C5-1的产量加倍。当使用HcPro以降低沉默时，存在或不存在KDEL时的C5-l的产量的差别明显减小。内质网滞留不影响产物质量，因为在产生内质网滞留和分泌形式的所述抗体的植物的粗提取物中观察到的片段在大小和相对丰度上是相同的。所有引文都以引用的形式纳入本文中。已参照在一或多个实施方案对本发明进行了描述。然而，本领域技术人员应明了，可对本发明进行多种变化和改进而不偏离如权利要求所限定的本发明的范围或精神。参考文献Bakker，H.etal.Anantibodyproducedintobaccoexpressingahybridbeta-l，4一galactosyltransferaseisessentiallydevoidofplantcarbohydrate印itopes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，7577—7582(2006)Boisson，M，etal.ArabidopsisglucosidaseImutantsrevealacriticalroleofN-glycantrimminginseeddevelopment.EMB0J.20，1010—1019(2001).Brigneti，G.etal.ViralpathogenicitydeterminantsaresuppressorsoftransgenesilencinginNicotianabenth咖iana.EMB0J.17，6739-6746(1998).Chua，Y丄，Watson，L.A.，&Gray,J.C.Thetranscriptionalenhancerofthepeaplastocyaningeneassociateswiththenuclearmatrixandregulatesgeneexpressionthroughhistoneacetylation.PlantCell15,1468-1479(2003).Cox，K.M.，etal.GlycanoptimizationofahumanmonoclonalantibodyintheaquaticplantLemnaminor.Nat.Biotechnol.24，1591-1597(2006).D'Aoust，M.A.etal.Efficientandreliableproductionofpharmaceuticalsinalfalfa.MolecularFarming,pp1_12.RainerFischerandStefanSchillberg(eds.)，Wiley-VCH，Weinheim，Germany(2004).Darvean，A.，Pelletier，A.&Perreault，J.PCR-mediatedsynthesisofchimericmolecules.MethodsNeurosc.26，77-85(1995).Elmayan，T.&Vaucheret，H.Expressionofsinglecopiesofastronglyexpressed35Stransgenecanbesilencedpost_transcriptionally.PlantJ.9,787-797(1996).Fischer,R.etal.Towardsmolecularfarminginthefuture:transientproteinexpressioninplants.Biotechnol.Appl.Biochem.30，113-116(1999a)，Fischer,R.，Drossard，J.，Commandeur,U.，Schillberg,S.&Emans，N.Towardsmolecularfarminginthefuture:movingfromdiagnosticproteinandantibodyproductioninmicrobestoplants.Biotechnol.Appl.Biochem.30，101-108(1999b).Giritch，A.etal.Rapidhigh-yieldexpressionoffull-sizeIgGantibodiesinplantscoinfectedwithnoncompetingviralvectors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，14701-14706(2006).Gomord，V.，Chamberlain,P.，Jefferis，R.&Faye，L.Biopharmaceuticalproductioni叩lants:problems，solutionsandopportunities.TrendsBiotechnol.23，559-565(2005).Hamilton,A.，Voi皿et，0.，Chappell，L.&Baulcombe，D.TwoclassesofshortinterferingRNAinRNAsilencing.EMB0J.21，4671-4679(2002).Hiatt，A.，Cafferkey，R.&Bowdish，K.Productionofantibodiesintransgenicplants.Nature342,76-78(1989).Hiatt，A.&Pauly，M.Monoclonalantibodiesfromplants:anewspeedrecord.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，14645-14646(2006).Hibino，Y.，0hzeki，H.，Sugano，N.&Hiraga，K.Transcriptionmodulationbyaratnuclearscaffoldprotein,P130，andarathighlyrepetitiveDNAcomponentorvarioustypesofanimalandplantmatrixorscaffoldattachmentregions.Biochem.Biophys.Res.Co匪n.279，282-287(2000).H6f接eiUR.&Willmitzer,L.StorageofcompetentcellsforAgrobacteriumtransformation.NucleicAcidRes.16,9877(1988).Hull，A.K.etal.Human-derived,plant-producedmonoclonalantibodyforthetreatmentofanthrax.Vaccine23，2082-2086(2005).Kapila，J.，DeRycke，R.，VanMontagu,M.&Angenon，G.AnAgrobacterium—mediatedtransientgeneexpressionsystemforintactleaves.PlantSci.122,101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之一编码一个沉默抑制子。18.权利要求17的方法，其中所述沉默抑制子是HcPro。19.权利要求10的方法，其中所述目的蛋白为抗体、抗原或疫苗。20.—种在植物或植物的一部分中合成目的蛋白的方法，包括i)修剪所述植物或所述植物的一部分以获得经修剪的植物或所述植物的经修剪部分，ii)以瞬时方式引入一个或多个编码目的蛋白的核酸序列，所述序列与在所述植物或所述植物的一部分中有活性的来自光合基因的调控区可操作地连接，禾口iii)将所述经修剪的植物或所述植物的经修剪部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。全文摘要本发明提供一种在植物中或植物的一部分中合成目的蛋白的方法。所述方法包括以瞬时方式引入一个或多个与在所述植物中有活性的来自光合基因的调控区可操作地连接的编码目的蛋白的核酸序列。然后将所述植物或所述植物的一部分保持在允许编码所述目的蛋白的核酸序列在所述植物或所述植物的一部分中表达的条件下。可在引入一个或多个核酸序列之前对所述植物进行修剪。文档编号C12N15/82GK101778943SQ200880102410公开日2010年7月14日申请日期2008年6月13日优先权日2007年6月15日发明者J·贝勒斯-依斯勒斯,L-P·韦齐纳,M·马泰尔,M-A·达奥斯特,N·贝克托尔德,P-O·拉瓦申请人:麦迪卡格公司