专利名称：一株不对称性还原4-羟基-2-丁酮为光学纯(r)-1,3-丁二醇酵母菌株的选育的制作方法
技术领域：
不对称性还原4-羟基-2- 丁酮为光学纯(R)-1,3- 丁二醇，属于生物催化技术领 域。
背景技术：
(R)-l，3-丁二醇，英文名为 l，3-butanediol，简写为(R) _1，3-BD0，无臭，略有苦 甜味，无色粘稠液体，熔点_77°C，沸点207. 5°C，溶于水、丙酮，几乎不溶于脂肪族烃、苯、四
氯化碳等。(R)-1，3_BD0是一种重要的化工原料，例如它可以用于合成光学性化合物氮杂环 丁酮，其是青霉烯抗生素、信息激素、香料和杀虫剂合成的中间体原料。(R)_1，3-BD0可以通 过化学合成法和微生物法生产法两种，化学合成法最主要是日本Daicel化工公司的研究 者开发出一种制取外消旋1，3-BD0并副产丁醇及醋酸丁酯的方法。他们是将乙醛缩合制得 3-羟基丁醛，然后用具有高加氢活性的Raney Ni催化剂进行加氢处理，或者将碱性条件下 缩合的反应液转入酸性的加氢系统进行处理，最后，将加氢得到的反应混合液进行蒸馏，蒸 出丁醇后，再蒸馏余液，得粗制外消旋1，3-BD0，再用臭氧处理外消旋1，3-BD0，得到外消旋 1，3-BD0精品，随后用手性拆分剂，分别得到(R)-1，3-BD0和⑶_1，3_BD0。但化学法合成 (R)-1，3-丁二醇设备投资大，技术难度高，产品分离纯化困难，且对环境不友好。目前，微生 物法生产1，3-BD0在国外已有相关报道，自然界中的微生物能将4-羟基-2-丁酮(4H2B) 转化为(R)-1，3-丁二醇，或通过手性拆分将外消旋1，3-BD0转化为光学纯的(R)-1，3-BD0 或(S)-1，3-BD0。微生物法生产(R)-1，3-BD0较之化学生产法具有反应条件温和、原料利 用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，从长远发展和环境保护角度来看，微生 物法显得更有生命力，因此越来越得到广大研究者的青睐。国内相关研究起步较晚，微生物 法生产(R)-1，3-BD0的方法还未见报道，同时，国内市场上的供应的1，3-BD0基本上是从国 外进口的。因此，获得能以4H2B为底物高产(R)-1，3-BD0的菌株，成为微生物法转化生产 (R)-1，3-BD0 的关键。本研究以4H2B为底物，筛选得到可以将4H2B为转化为(R) _1，3-BD0(e. e. 100% ) 的菌株1株，命名为Pichia jadinii HB61，该工作为进一步建立一种以4H2B为底物绿色、 高效合成(R) -1，3-BD0奠定基础。
发明内容
(1)本发明的目的筛选到能以4H2B为底物通过生物催化生产光学纯(R)_l， 3_ 丁二醇(e.e. 100%)的酵母，并对其形态与生理生化特征进行鉴定，将该菌命名为 Pichiajadinii HB01，该菌可以将 4H2B 为转化为光学纯(R)-1，3-BD0 (e. e. 100% )，并对 产物进行定性定量鉴定，该工作为进一步建立一种以4H2B为底物绿色、高效合成光学纯 (R)-1，3-BD0奠定基础。CN 101899495 A
(2)本发明的技术方案一种通过微生物不对称还原4H2B为光学纯(R)_1，3_BD0 的方法，是在不对称性还原合成光学纯(R)-1，3-BD0的反应体系中，体系pH为7. 0，以本实 验室筛选并保藏的菌株为转化菌株，加入4H2B和葡萄糖，控制温度30°C，摇床转化28h，通 过气相色谱定性定量检测转化液中物质成分，筛选出能不对称还原4H2B为光学纯(R)-l， 3-BD0的菌株。本发明成功筛选到一株能不对称还原4H2B为光学纯(R)-1，3-BD0 (e. e. 100% )的菌株，通过18S rDNA鉴定，将其命名为Pichia jadinii HB61，已于2009年5 月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M209103。主要试剂(R)-1，3-BD0，(S)_1，3_BD0，(R，S)_1，3-BD0 购自美国 Sigma-Aldrich 公司(R)-1，3-BD0，(S)_1，3_BD0 和(R，S) _1，3-BD0 分析方法的确定(R)-1，3-BD0，(S)-1，3-BD0 和(R，S)-1，3-BD0 标样在 supelco β-120 手性柱上 通过气相色谱进行分析，(R)_1，3-BD0的保留时间为16. 73min, (S)_1，3_BD0的保留时间为 16. 98min。所有气相色谱仪为 varian 3900，手性柱 supelco β-120 (250 X 2. 5mm)。确定具体色谱条件为手性柱supelco β-120 (250 X 2. 5mm)；柱温140°C ；进样 口温度250°C，进样量为0. 5 μ L ；检测器温度300°C。产物光学纯度通过对映体过量值(％ e. e.)来评价。(R)-1，3_BD0 % e. e. = [ (Sr-Ss) / (SE+Ss)]产率yield = (Cp/Cs0) X 100%Se 反应后(S)-对映体的峰面积；Ss 反应后(R)-对映体的峰面积；Cp 反应后 (R)-对映体的摩尔浓度；Cstl 反应前底物4H2B的初始浓度。目的菌株的筛选以本实验室筛选并保藏的菌株作为供试菌株，将出发菌株在斜 面培养基上活化后，接种于装有IOOmL种子培养基的500mL的三角瓶中，振荡培养28h，离心 收集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0. lmol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌 体，加入0.05g 4H2B，然后置于30°C、200r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取 上清液以备检测；取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，用气相色谱法(GC)检测乙酸乙 酯萃取液中产物(R)-1，3-BD0含量。目的菌株的鉴定采用18S rDNA测序，将该序列与美国国家生物信息中心 (NCBI)收录的DNA序列进行比对，结果表明其与Pichia jadinii strain DC 3343的18S rDNA序列相似性最高，为99.8%，为Pichia jadinii的一个亚种，将其命名为=Pichia jadiniiHB61ο产物的定性检测采用气质联用(GC-MS)来鉴定产物中是否含有1，3_BD0。分别 测定1，3-BD0标样GC-MS图谱，转化液用乙酸乙酯萃取后的GC-MS图谱，并进行图谱分析， 确定转化液中是否含有1，3-BD0，随后用手性柱检测转化液中产物1，3-BD0的光学纯度。产物的定量检测用气相色谱法(GC)检测转化液中产物1，3-BD0的生成量与底物 4H2B的残留量。(3)本发明的有益效果以本实验室筛选并保藏的菌株作为供试菌株，将出发菌株在斜面培养基上活化 后，接种于装有IOOmL种子培养基的500mL的三角瓶中，振荡培养28h，离心收集菌体，用生 理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0. lmol/L的磷酸钾(pH 7. 0)缓冲液悬浮菌体，加入0. 05g4H2B，然后置于30°C、200r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取上清液以备检 测；取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产 物(R)-1，3-BD0合成情况。国内市场上的供应的(R)_1，3-BD0基本上是从国外进口的，本 发明为以4H2B为底物微生物法工业化生产(R)-1，3-BD0奠定基础。
将较廉价底物4H2B转化成具有附加价值较高的用于合成光学性化合物氮杂环丁 酮，其是青霉烯抗生素、信息激素、香料和杀虫剂合成的中间体原料(R)_1，3-BD0 ；同时用 微生物法生产(R)_1，3-BD0，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯 度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
图 1 1，3-BD0 标准品 GC-MS 图谱图2 图1中6. 23min处解图结果图3 (R)-1，3-BD0标准品手性柱GC图谱图4 (S)-1，3-BD0标准品手性柱GC图谱图5 4-羟基-2- 丁酮标样填充柱GC图谱图6 (R)-1，3-BD0标准品填充柱GC图谱图7 P. jadinii以4H2B为底物28h转化液的GC-MS图谱图8 图7中6. 22min处解图结果图9 P. jadinii以4H2B为底物28h转化液的手性柱GC图谱图10 P. jadinii以4H2B为底物28h转化液加入少量标准品(R) _1，3-BD0的手性 柱GC图谱图11 P. jadinii以4H2B为底物28h转化液加入少量标准品(S) _1，3-BD0的手性 柱GC图谱图12 P. jadinii以4H2B为底物28h转化液填充柱GC图谱具体实施方法实施例1 菌株的筛选将出发菌株划线于YEPD培养基上(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L， 琼脂20g/L，pH 6.0，0.810^灭菌151^11。)培养28h后，挑取单菌落接种于装有IOOmL种子 培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，0.8MPa灭菌15min)的500mL摇瓶中， 30°C培养 28h ；用50ml的离心管收集培养28h后的菌液，离心后收集菌体，用生理盐水洗涤菌体 一次后，用5ml 0. lmol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌体，加入0. 05g 4H2B，然后置于 30°C,200r/min条件下振荡培养28h ；收集转化液，离心，取上清液以备检测。实施例2:1，3-BD0定性检测取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)来鉴定萃取 液中是否含有1，3_BD0。气质联用检测条件采用的色谱柱温控程序为首先在50°C下保温 lmin，然后以6°C /min的升温速率升至90°C并保持lOmin，最后以20°C /min的升温速率升 至230°C。进样口温度为240°C，进样量为lyL，载气为高纯氮气，载气流量l.OmL/min;TraceMS质谱条件EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30 500amu，发射
6电流为200 μ Α,电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIST98谱库；标准品1，3- 丁二醇标准品GC-MS图谱及解图结果如图1和图2所示，菌株转化液 GC-MS图谱如图7和图8所示。实施例3 (R)-1，3- 丁二醇光学纯度检测用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物1，3_BD0的光学纯度。气相色 谱法检测条件如下Parian 3900型气相色谱仪，色谱柱温控程序为首先在80°C下保温 2min，然后以2. 5°C /min的升温速率升至140°C并保持lOmin。进样口温度250°C，进样量 为0. 5 μ L，载气为高纯氢气，载气流量1. 5mL/min ；检测器温度300°C。(R)-1，3-BD0标准品和(S) _1，3-BD0标准品手性柱GC图谱如图3和图4所示， P. jadinii以4H2B为底物28h转化液的手性柱GC图谱如图9、图10和图11所示；实施例4 菌株的合成(R)-l，3_ 丁二醇能力检测将实施例1获得的转化液液中1，3_ 丁二醇及4-羟基-2-丁酮的含量采用气相色 谱测定。安捷伦1490型气相色谱仪，2m不锈钢柱(φ 3mm)，国产高分子微球⑶X-401 (110 目)为固定相。柱温225°C，进样温度230°C，检测温度240°C，氮气作为载气，使用氢火焰 检测器，进样5yL，4-羟基-2-丁酮保留时间为1.8min，l，3-丁二醇的保留时间为5. 6min, 用外标法计算转化液中4-羟基-2-丁酮和1，3-丁二醇的含量。(R) -1，3-BD0标准品填充柱GC图谱如图6所示，P. jadinii以4H2B为底物28h转 化液填充柱GC图谱如图12所示；筛选到的一株酵母转化28h后，转化液中4-羟基-2-丁酮残留量为2. 4g/L左右， 1，3-丁二醇含量为7. 6g/L左右，经过手性色谱柱检测，该产物为(R)-1，3-BD0。以上实验 结果表明本发明在国内首次成功筛选到以4H2B为底物产光学纯(R)-l，3-丁二醇酵母菌。 产物(R)-1，3-BD0的生成率达到70%以上，e. e.值100%。
权利要求
一株不对称性还原4 羟基 2 丁酮(4H2B)为光学纯(R) 1，3 丁二醇酵母菌株的选育，其特征是以本实验室筛选和保藏的菌株作为供试菌株，以4H2B为底物微生物法生产(R) 1，3 丁二醇，将筛选得到的1株酵母菌株Pichia jadinii HB61，该菌能以4H2B为底物进行生物转化，得到光学纯(R) 1，3 丁二醇(e.e.100％)；(1)菌株的筛选菌种筛选培养以本实验室筛选和保藏的菌株作为供试菌株，将出发菌株划线于YPD培养基上(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 6.0，0.8MPa灭菌15min。)培养28h后，挑取单菌落接种于装有100mL种子培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，0.8M/Pa灭菌15min)的500mL摇瓶中，30℃培养28h；生物转化用50ml的离心管收集培养28h后的菌液，离心后收集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0.1mol/L的磷酸钾(pH 7.0)缓冲液悬浮菌体，加入0.6g葡萄糖，预培养10min后，再加入0.05g 4H2B，然后置于30℃、220r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取上清液以备检测；(2)1，3 BDO定性检测取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC MS)鉴定萃取液中是否含有1，3 BDO。气质联用检测条件采用的色谱柱温控程序为首先在50℃下保温1min，然后以6℃/min的升温速率升至90℃并保持10min，最后以20℃/min的升温速率升至230℃。进样口温度为240℃，进样量为1μL，载气为高纯氮气，载气流量1.0mL/min，检测器温度为240℃；TraeeMS质谱条件EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30～500amu，发射电流为200μA，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；(3)(R) 1，3 丁二醇光学纯度检测用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物1，3 BDO的光学纯度。气相色谱法检测条件如下varian 3900型气相色谱仪，色谱柱温控程序为首先在80℃下保温2min，然后以2.5℃/min的升温速率升至140℃并保持10min。进样口温度250℃，进样量为0.5μL，载气为高纯氢气，载气流量1.5mL/min；检测器温度300℃；(4)菌株鉴定提取出发菌株的基因组DNA以出发菌株的基因组DNA为模板，使用酵母菌18S rDNA的通用引物进行扩增P15’ ACCGGAATTC GCCTGAGAAACGGCTACC 3’P25’ ACCGGAATTC GGCAGGGACGTAATCAAC 3’PCR方法如下50μL反应体系中加入10mol/L的引物P1和P2各0.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5V，5U/μL 的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为95℃变性5min，56℃退火90S，72℃延伸2min，94℃变性1min，循环30次；用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证；连接到pMD18 T载体，转化E.coli JM109。 经Amp抗性筛选，获得阳性克隆。18S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。
2.根据权利要求1所述的酵母菌株的18SrDNA分析，该酵母菌株分类名称为Pichiajadinii，将其命名为 Pichia jadinii HB61。
3.根据权利要求2所述的酵母菌株，其特征是将酵母接种于IOOmL种子培养基(蛋白 胨g/L，酵母膏g/L，葡萄糖g/L)的500mL的三角瓶中，30°C，150r/min,培养28h后，离心收 集菌体，用生理盐水洗涤菌体一次后，用5ml 0. lmol/L的磷酸钾(pH 7. 0)缓冲液悬浮菌 体，加入0.05g 4H2B，然后置于30°C、220r/min条件下振荡培养28h。收集转化液，离心，取 上清液以备检测；上清液用于对产物进行定性定量检测，测得1，3_ 丁二醇的含量为7. 6g/ L0
4.根据权利要求3所述的酵母菌株转化过程，其特征是取2ml上清液，用2ml乙酸乙 酯进行萃取，用气相色谱法(GC)检测乙酸乙酯萃取液中产物1，3-BD0的光学纯度。气相 色谱法检测条件如下Parian 3900型气相色谱仪，色谱柱温控程序为首先在80°C下保温 2min，然后以2. 5°C /min的升温速率升至140°C并保持lOmin。进样口温度250°C，进样量 为0. 5 μ L，载气为高纯氢气，载气流量1. 5mL/min ；检测器温度300°C ；乙酸乙酯萃取液中测 得(R)-l，3-丁二醇的 e. e.值为 100%。
全文摘要
(R)-1，3-BDO是一种重要的化工原料，例如它可以用于合成旋光性化合物氮杂环丁酮，其是青霉烯抗生素、信息激素、香料和杀虫剂合成的中间体原料。以本实验室筛选并保藏的菌株作为出发菌株，本发明在国内首次筛选到一株能以4-羟基-2-丁酮为底物合成光学纯(R)-1，3-丁二醇酵母菌，命名为Pichia jadinii HB61，产物(R)-1，3-BDO的生成率达到70％以上，e.e.值达100％，本发明为以4H2B为底物微生物法工业化生产光学纯(R)-1，3-BDO奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK101899495SQ200910032850
公开日2010年12月1日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者夏海锋, 杨套伟, 饶志明, 马正 申请人:江南大学