专利名称：一株产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
3-羟基丁酮又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，天然存在于乳品和某些水果中，是一种应用广泛的食用香料，它具有令人愉快的奶油香味，我国GB2760-86规定其允许食用，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。3-羟基丁酮作为香料应用范围极其广泛，用量也很大。此外，3-羟基丁酮还可以作为一种平台化合物，广泛应用于日化食品、制药、涂料、液晶材料等众多领域。2004年，美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一，近年来，随着人们对3-羟基丁酮需求的不断增长，有关3-羟基丁酮的生产方法及应用研究已引起人们的广泛关注。目前3-羟基丁酮的合成方法主要两种一是化学合成法，二是生物合成法。化学合成法存在着产品收率低，环境污染较严重等缺点，而且其产品质量很难达到目前3-羟基丁酮的最大消费领域——食用香料的要求，更为严重的是化学合成法的原料大都是利用不可再生的化石资源一石油，原料来源也受到限制。生物合成法又包括酶法和微生物发酵法，酶法是以丁二酮或丁二醇为原料在特异性酶的作用下生成3-羟基丁酮，该方法转化率能达到100%，且产物具有旋光度，但是和化学法一样原料来源受到限制，并且获得大量特异酶很困难。目前用于3-羟基丁酮生产及研究的菌株主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属 (Lactococcus)等，也有研究者发现在某些酵母中也能少量积累3_羟基丁酮。但是在大多数菌株代谢过程中，3-羟基丁酮的积累量均很低，大都作为2，3- 丁二醇的代谢副产物而产生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌。本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一株产3-羟基丁酮的基因工程菌，它是将Nox基因通过表达载体pDK7转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011得到的基因工程菌。上述基因工程菌的构建方法，利用PCR技术从质粒载体pTEF_Sup35C中扩增出Nox 基因，将Nox基因连在表达载体pDK7多克隆位点处，得到重组质粒pDK7-Nox，再将重组质粒 pDK7_Nox转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011,得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产 3_ 轻基丁丽的基因工程菌 Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox。本发明所述的表达载体pDK7来源于Mike J. Merrick教授(AFRC-IPSR NitrogenFixation Laboratory, University of Sussex, Brighton BNI 9RQ, UK),其构建方法参考文献 Construction of Multicopy Expression Vectors for Regulated Overproduction of Proteins in Klebsiella pneumoniae and Other Enteric Bacteria[J]· DIETMELM KLEINER, WYATT PAUL AND MIKE J. MERRICK. Journal of General Microbiology, 1988, 134，1779-1784.上述构建方法，具体包括以下步骤(I)基因Nox的克隆根据Genebank 公布的肺炎链球菌(S. pneumoniae)中 Nox 基因(Gen Bank AF014458. 2)，序列设计合引物Pl :5’ -CGGGGTACC(Kpn I)TAAGGAGGATATACATATGA AAGTCACAGTT-3’ ；P2 :5， -CGGCTGCAG(Pst I)TTAAGCGTTAACTGATT-3，；引物两端分别引入限制性酶切位点Kpn I和Pst I，以pTEF_Sup35C为模板完成 PCR反应；PCR 的 8 管反应体系是=Buffer 22. 5uL, ddH20 141. 3uL, MgCl213. 5uL, dNTP-mix 18uL，引物P14. 5uL，引物P24. 5uL，Taq酶2. 7uL ;混合均匀后，分成8管，再向每管加入2uL 模板DNA ；PCR反应条件94°C预变性3. 5min ;进行30个循环反应94°C变性45s，52. 6°C 退火45s，72°C延伸90s ;最后72°C保温lOmin，反应结束后4°C保存，反应终止后，O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，与pUC18载体连接，进行序列测定，Kpn I和 Pst I酶切重组pUC18载体，回收I. 35Kb片段，KpnI和Pst I酶切pDK7载体，回收大片段产物，将双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接获得重组质粒pDK7-Nox ；(2)重组基因工程菌的获得将重组质粒pDK7-Nox转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011，涂布含40 μ g/mL的氯霉素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为 Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox。上述基因工程菌在生产3-羟基丁酮中的应用。利用基因工程菌，以葡萄糖为底物发酵生产3-羟基丁酮的具体工艺如下(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox ；(2)种子培养种子培养基葡萄糖50 80g/L,蛋白胨5 10g/L,酵母膏3 7g/L, NaCl 5 10g/L，氯霉素20 40 μ g/mL,溶剂为水；培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度31 37°C，摇床转速120 180r/ min，培养 12 24h ；(3)发酵培养培养基组成葡萄糖80 200g/L，蛋白胨5 10g/L，酵母膏3 7g/L，NaCl 5 10g/L，氯霉素20 40 μ g/mL,溶剂为水；培养条件接种量10% (v/v)，发酵温度31 37°C，当OD达到0. 6 0. 8时加异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，IPTG的终浓度I. 0mmol/L，摇床转速180 250r/min，发酵 72 96h。通过对肺炎克雷伯氏菌代谢网络分析发现在发酵过程中，肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae CICC10011往往主要积累大量的2, 3_ 丁二醇,这样可以防止积累过量的酸对细胞造成毒害，还可以作为储备碳源当需要时可以重新降解利用等作用，还可以调节胞内NADH/NAD+，从而调控细胞代谢流方向。当细胞处于一个偏向于较氧化态环境， 胞内NADH/NAD+较低时3-羟基丁酮才开会积累。所以当细胞内过量表达NADH oxidase时， NADH被氧化成NAD+，胞内NADH/NAD+显著降低，由于胞内可利用的NADH的量降低，细胞为了维持胞内氧化还原恒定的需要只能更多的选择积累氧化型代谢产物3-羟基丁酮。本发明的菌株能够显著降低胞内NADH/NAD+比率，提高3-羟基丁酮的积累量，增加葡萄糖的转化率，同时有效降低副产物2，3- 丁二醇含量，缩短发酵时间。有益效果本发明的基因工程菌在好氧条件下利用葡萄糖发酵产3-羟基丁酮，突破了原始菌株发酵低效率积累3-羟基丁酮的局限。分批补料发酵完毕可利用200g/L葡萄糖， 得到3-羟基丁酮74g/L，转化率37%，理论最高转化率为50% ;在相同条件下，原始菌株只能利用160g/L葡萄糖，得到25g/L的3-羟基丁酮，与原始克雷伯氏菌相比，重组菌株生产3-羟基丁酮的能力显著提高，提高了对底物葡萄糖的利用能力和转化率。与目前文献报道肺炎克雷伯氏菌产3-羟基丁酮产量相比，产物终浓度也较高(Production of (2S,3S)-2,3-butanediol and(3S)-acetoin from glucose using resting cells of Klebsiella pneumonia and Bacillus subtilis[J]. Zhen Liu,Jiayang Qin,Chao Gao,et al. BI0RES0URCE TECHNOLOGY, 2011,102(22) :10741-10744.)目前文献所报道的利用肺炎克雷伯氏菌生产3-羟基丁酮产量在56. 7g/L左右，，另外在发酵过程中添加微量氯霉素，达到抑制部分杂菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的染菌现象，提高产品质量， 发酵时间也有所缩短，为微生物发酵法工业化生产3-羟基丁酮奠定了良好的基础。
图 I 为扩增出的 NOX gene 片段。其中，M :DNA Marker DL5000 ；1,2 Nox ；图 2 为 NOX 和 pDK7 连接结果。其中，M:DNA Marker DL5000 ;I, 2 :pDK7_Nox ;3,4 : pDK7。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :基因Nox的克隆。根据Genebank 公布的肺炎链球菌(S. pneumoniae)中 Nox 基因(GenBank AF014458. 2)，序列设计合引物Pl :5，-CGGGGTACC(Kpn I)TAAGGAGGATATACATATGAAAGTCACAGTT-3，；P2 :5， -CGGCTGCAG(Pst I)TTAAGCGTTAACTGATT-3，；弓丨物两端分别引入限制性酶切位点KPnI和Pst I (下划线部分)，以pTEF_Sup35C 为模板完成 PCR 反应；PCR 的 8 管反应体系是 Buffer 22. 5uL，ddH20 141. 3uL，MgCl213. 5uL， dNTP-mix 18uL，引物P14. 5uL，引物P24. 5uL，Taq酶2. 7uL。混合均匀后，分成8管，再向每管加入2uL模板DNA。PCR反应条件94°C预变性3. 5min ;进行30个循环反应94°C变性 45s, 52. 6°C退火45s，72°C延伸90s ;最后72°C保温lOmin，反应结束后4°C保存，反应终止后，O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，与pUC18载体连接，进行序列测定，Kpn I和Pst I酶切重组pUC18载体，回收L 35Kb片段，Kpn I和Pst I酶切pDK7载体，回收大片段产物，将双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接获得重组质粒pDK7-Nox ；实施例2 :重组质粒pDK7_Nox转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae CICC10011。利用电穿孔仪将重组质粒pDK7_Nox转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae CICC10011，电转化参数为:电压2. 5kv，200Q，脉冲时间4. 5msec。电击转化完毕，将经电击处理过的Klebsiella pneumoniae CICC10011涂布于含有40 μ g/L氯霉素的LB培养基上， 得到阳性克隆 Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox。实施例3 :工程菌 Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox 的质粒稳定性考察。考察方法从新鲜转化平板上挑取单菌落接种至3mL不含氯霉素的LB培养基中， 37°C下培养12h作种子，转种培养24h，即为传种20代，转种培养5次，即为100代，将上述菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，从中挑取100个单菌落分别点在添加和不添加氯霉素的平板上，37°C下培养12 16h，比较在添加和不添加氯霉素的平板上的菌落数即其稳定性。考察结果传种100代之后其质粒稳定性为99%。实施例4 :工程菌 Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7_Nox 中 NADH oxidase酶活测定。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7_Nox(2)所用培养基酵母膏 5g/L，蛋白胨 10g/L, NaCl 10g/L, IPTG lmmol/L，氯霉素 40 μ g/L(3)酶活测定方法反应总体积ImL包括50mM 0. lmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7. 0)， 0. 3 mM EDTA, 10 μ M FAD, 0. 29mM β -NADH,然后加入 10 μ L粗酶液反应 10 分钟后，340nm测溶液吸光值的变化。I个酶活单位定义为25°C下每分中催化I μ moINADH氧化形成NAD+所需的酶量。酶粗提液的制备如下重组菌Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox在加入IPTG的条件下32°C下诱导8h,离心弃上清,用0. lmol/L磷酸钾(pH 7. 0)重悬菌体, 再离心去上清，菌体用10%体积的0. lmol/L磷酸钾(pH 7.0)重悬；超声破碎细胞，离心， 上清作为酶粗提液。蛋白测定用Bradford方法测定。考察结果在存在IPTG诱导情况下，重组菌Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7-Nox 中 NADH oxidase 酶活为 2. 72U/mg。对比例I :原始菌株 Klebsiella pneumoniae CICC10011 中 NADH oxidase 酶活测定。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011(2)所用培养基酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L(3)酶活测定方法反应总体积ImL包括50mM 0. lmol/L磷酸钾缓冲液(pH7. 0)， 0. 3mM EDTA, 10 μ M FAD, 0. 29mM β -NADH,然后加入 10 μ L 粗酶液反应 10 分钟后，340nm 测溶液吸光值的变化。I个酶活单位定义为25°C下每分中催化IymolNADH氧化形成NAD+ 所需的酶量。酶粗提液的制备如下=Klebsiella pneumoniae CICC10011在32°C下培养 8h，离心弃上清，用O. lmol/L磷酸钾(pH 7.0)重悬菌体，再离心去上清，菌体用10%体积的O. lmol/L磷酸钾(pH 7.0)重悬；超声破碎细胞，离心，上清作为酶粗提液。蛋白测定用 Bradford方法测定。考察结果原始菌Klebsiella pneumoniae CICC10011 中 NADH oxidase 酶活为 0.01U/mgo实施例5 :工程菌 Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox 中 NADH/NAD+测定。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7_Nox ；(2)所用培养基酵母膏 5g/L，蛋白胨 10g/L, NaCl 10g/L, IPTG lmmol/L，氯霉素 40 μ g/L ；(3) NADH萃取方法取ImL菌液，12000r/min,离心5min,去掉上清液，添加 300 μ LNaOH(0. 2mol/L)萃取NADH，破坏掉NAD+，50°C水浴lOmin，然后迅速放在冰中冷却至 O °C，接着一滴一滴的添加 300 μ LHCl (0. lmol/L)进行中和，12000r/min，离心 I OminJfJl
清液移至另一管中待用，_20°C保存。NAD+萃取方法取ImL菌液，12000r/min,离心5min,去掉上清液，添加 300 μ LHCl (0. 2mol/L)萃取NAD+，破坏掉NADH，50°C水浴lOmin，然后迅速放在冰中冷却至 0°C，接着一滴一滴的添加 300 μ LNaOH (0. lmol/L)进行中和，12000r/min，离心 IOminJfi
清液移至另一管中待用，_20°C保存。混合反应液组成将等体积的I. 0mol/L Bicine buffer (pH8. 0)、纯乙醇、40mmol/ LEDTA (pH8. 0)、4· 2mmol/L MTT 和双倍体积的 16. 6mmol/L PES 混合，30°C水浴 IOmin0NADH、NAD+测定方法反应时，依次添加50 μ L中和的细胞提取液、0. 3 mL的纯水、 0. 6mL的混合反应液和50 μ L的乙醇脱氢酶(500U/mL),迅速混勻后,置于波长为570nm的紫外可见分光光度计下测量。考察结果重组菌Klebsiellapneumoniae CICC10011-pDK7_Nox 中 NADH/NAD+ 为 O. 45±0· 02。对比例2 :原始菌株 Klebsiella pneumoniae CICC 10011 中 NADH/NAD+测定。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011 ；(2)所用培养基酵母膏 5g/L，蛋白胨 10g/L, NaCl 10g/L, IPTG lmmol/L，氯霉素 40 μ g/L ；(3) NADH萃取方法取ImL菌液，12000r/min,离心5min,去掉上清液，添加 300 μ LNaOH(0. 2mol/L)萃取NADH，破坏掉NAD+，50°C水浴lOmin，然后迅速放在冰中冷却至 O °C，接着一滴一滴的添加 300 μ LHCl (0. lmol/L)进行中和，12000r/min，离心 I OminJfJl
清液移至另一管中待用，_20°C保存。NAD+萃取方法取ImL菌液，12000r/min,离心5min,去掉上清液，添加 300 μ LHCl (0. 2mol/L)萃取NAD+，破坏掉NADH，50°C水浴lOmin，然后迅速放在冰中冷却至 0°C，接着一滴一滴的添加 300 μ LNaOH (0. lmol/L)进行中和，12000r/min，离心 IOminJfi
清液移至另一管中待用，_20°C保存。
混合反应液组成将等体积的I. Omol/L Bicine buffer (pH8. O)、纯乙醇、40mmol/ LEDTA (pH8. O)、4· 2mmol/L MTT 和双倍体积的 16. 6mmol/L PES 混合，30°C水浴 lOmin。NADH,NAD+测定方法反应时，依次添加50 μ L中和的细胞提取液、O. 3 mL的纯水、
O.6mL的混合反应液和50 μ L的乙醇脱氢酶(500U/mL),迅速混勻后,置于波长为570nm的紫外可见分光光度计下测量。考察结果重组菌Klebsiella pneumoniae CICC10011 中 NADH/NAD+ 为 0. 67±0· 02。实施例6 :工程菌 Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox 利用葡萄糖摇瓶
发酵产3-羟基丁酮。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7_Nox(2)种子培养种子培养基葡萄糖50g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L;氯霉素 40ug/mL ；培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度37°C，摇床转速180r/min，培养 12h。(3)发酵培养发酵培养基葡萄糖200g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L ;氯霉素 40ug/mL ；培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，接种量10% (v/v)，发酵温度37°C，当OD在
0.6 0. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. 0mmol/L，摇床转速180r/min，发酵72h左右。发酵结果200g/L葡萄糖经转化得到56g/L 3_羟基丁酮。对比例3 :原始菌Klebsiella pneumoniae CICC10011利用葡萄糖在摇瓶中发酵
产3-羟基丁酮。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011(2)种子培养种子培养基葡萄糖50g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L ；培养条件250mL三角瓶，装液量为50mL，培养温度37°C，摇床转速180r/min，培养 12h。(3)发酵培养发酵培养基葡萄糖200g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L ；培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，接种量10% (v/v)，发酵温度37°C，摇床转速180r/min，发酵72h左右。发酵结果200g/L葡萄糖经转化得到15g/L 3_羟基丁酮。实施例7 :工程菌Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox利用葡萄糖在 3L 发酵罐中分批补料发酵产3-羟基丁酮。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7_Nox(2)种子培养种子培养基葡萄糖50g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L;氯霉素 40ug/mL ；
培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度为37°C，摇床转速180r/min，培养 12h。(3)发酵培养发酵培养基葡萄糖200g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L ;氯霉素 40ug/mL ；培养条件3L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10% (v/v),发酵温度37°C，当OD在O. 6 O. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. Ommol/L,搅拌转速220rpm, 发酵72h左右，分批补料流加葡萄糖维持葡萄糖浓度在30g/L左右。发酵结果底物葡萄糖消耗200g/L，产物3-羟基丁酮浓度74g/L。对比例4 :原始菌Klebsiella pneumoniae CICC10011利用葡萄糖在3L发酵罐中分批补料发酵产3-羟基丁酮。(I)出发菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011(2)种子培养种子培养基葡萄糖50g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L ；培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度为37°C，摇床转速180r/min，培养 12h。(3)发酵培养发酵培养基葡萄糖200g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L ；培养条件3L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10% (v/v),发酵温度37°C，搅拌转速220rpm，发酵72h左右，分批补料流加葡萄糖维持葡萄糖浓度在30g/L左右。发酵结果底物葡萄糖消耗160g/L，产物3-羟基丁酮浓度25g/L。实施例8:同实施例7的方法，所不同的是(2)种子培养种子培养基葡萄糖80g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏7g/L, NaCl 5g/L,氯霉素20 μ g/ mL，溶剂为水；培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度31°C，摇床转速120r/min，培养 24h ；(3)发酵培养培养基组成葡萄糖100g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏3g/L,NaCl 5g/L,氯霉素20 μ g/ mL，溶剂为水；培养条件接种量10% (v/v)，发酵温度31。。，当OD达到O. 6 O. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. 0mmol/L，摇床转速180r/min，发酵96h。
权利要求
1.一株产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，它是将Nox基因通过表达载体pDK7 转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011得到的基因工程菌。
2.权利要求I所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，利用PCR技术从质粒载体 pTEF-Sup35C中扩增出Nox基因，将Nox基因连在表达载体pDK7多克隆位点处，得到重组质粒pDK7_Nox,再将重组质粒pDK7_Nox转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011，得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产3-羟基丁酮的基因工程菌Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7_Noxo
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤(I)基因Nox的克隆根据Genebank公布的肺炎链球菌(S. pneumoniae)中Nox基因序列设计合引物Pl :5’ -CGGGGTACCTAAGGAGGATATACATATGAAAGTCACAGTT-3> ；P2 :5’ -CGGCTGCAGTTAAGCGTTAACTGATT-3，；引物两端分别引入限制性酶切位点Kpn I和Pst I，以pTEF-Sup35C为模板完成PCR反PCR 的 8 管反应体系是=Buffer 22. 5uL, ddH20 141. 3uL, MgCl213. 5uL, dNTP_mixl8uL， 引物P14. 5uL，引物P24. 5uL，Taq酶2. 7uL ;混合均匀后，分成8管，再向每管加入2uL模板 DNA ；PCR反应条件94°C预变性3. 5min ;进行30个循环反应94°C变性45s，52. 6°C退火 45s, 72°C延伸90s ;最后72°C保温lOmin，反应结束后4°C保存，反应终止后，O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，与pUC18载体连接，进行序列测定，Kpn I和Pst I 酶切重组PUC18载体，回收I. 35Kb片段，KpnI和Pst I酶切pDK7载体，回收大片段产物， 将双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接获得重组质粒pDK7-Nox ；(2)重组基因工程菌的获得将重组质粒pDK7_Nox转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011,涂布含40 μ g/mL的氯霉素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为 Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7_Nox。
4.权利要求I所述的基因工程菌在生产3-羟基丁酮中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用基因工程菌，以葡萄糖为底物发酵生产3-羟基丁酮的工艺如下(1)出发菌株Klebsiellapneumoniae CICC10011-pDK7_Nox ；(2)种子培养种子培养基葡萄糖50 80g/L,蛋白胨5 10g/L,酵母膏3 7g/L,NaCl 5 IOg/ L,氯霉素20 40 μ g/mL,溶剂为水；培养条件250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度31 37°C，摇床转速120 180r/min， 培养12 24h ；(3)发酵培养培养基组成葡萄糖80 200g/L，蛋白胨5 10g/L，酵母膏3 7g/L，NaCl 5 IOg/ L,氯霉素20 40 μ g/mL,溶剂为水；培养条件接种量10% (v/v)，发酵温度31 37°C，当OD达到O. 6 O. 8时加异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷诱导,异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷的终浓度I. Ommol/L,摇床转速180 250r/min，发酵72 96h。
全文摘要
本发明公开了一株产3-羟基丁酮的基因工程菌，它是将Nox基因通过表达载体pDK7转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011得到的基因工程菌。本发明还公开了上述基因工程菌的构建方法和应用。本发明的菌株能够显著降低胞内NADH/NAD+比率，提高3-羟基丁酮的积累量，增加葡萄糖的转化率，同时有效降低副产物2，3-丁二醇含量，缩短发酵时间。该菌株的获得对生物法制备3-羟基丁酮具有重要的工业应用价值。
文档编号C12R1/22GK102604878SQ201210083800
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者夏志芳, 杨晗, 沈梦秋, 纪晓俊, 聂志奎, 黄和 申请人:南京工业大学