一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，它是导入了乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因的梭菌。本发明还公开了上述基因工程菌的构建方法及应用。通过本发明的方法，丙酮丁醇梭菌平均乙偶姻产量达到5g/L左右。
【专利说明】一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体地说，涉及一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]3-羟基丁酮，又名乙偶姻(acetoin)、乙酰甲基甲醇，通常为淡黄色液体或晶体，天然存在于玉米、葡萄、草莓、干酪、肉类等食品中，是一种应用广泛的香料，我国国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食用香料，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。此夕卜，3-羟基丁酮还可以作为化学合成中的重要原料，比如可用于合成手性近晶材料和向列材料。
[0003]3-羟基丁酮的传统化工制备主要是采用化学法或者酶法转化，其原料主要是双乙酰(丁二酮)和2，3-丁二醇。但是这些方法的原料昂贵，而且往往条件苛刻，设备要求高。另夕卜，还可以采用微生物发酵法生产3-羟基丁酮。在微生物中，两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)作用下合成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸经乙酰乳酸脱竣酶(acetolactate decarboxylase, ALDC)作用即可生成3_轻基丁丽。在一些微生物中，3-羟基丁酮还可以被进一步还原生成2，3- 丁二醇。目前人们已经发现很多可以产生3-羟基丁酮的菌种，例如:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等奶制品或者酿酒发酵菌株,可以产生少量的3-轻基丁酮(通常低于lg/L)。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产气节杆菌(Enterobacter aerogenes)和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)等主要用来生产2，3- 丁二醇的菌种也能够产生3-羟基丁酮。
[0004]丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum),是目前生产丁醇的主要菌种。其发酵产物除丁醇外，还有丙酮和乙醇，因此在生产中又被称为ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)发酵。通常,60g/L的葡萄糖经丙酮丁醇梭菌发酵可产生12g/L的丁醇，6g/L的丙酮以及2g/L的乙醇，丁醇:丙酮:乙醇的比值为6:3:1 (w/w)。除ABE外，丙酮丁醇梭菌还会产生少量的3-羟基丁酮。在丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC824 中，3-羟基丁酮的产量通常情况下不足 lg/L (Collas, F., Kuit, ff., Clement, B.，MarchaljR.，Lopez-Contrerasj A.Μ.，MonotjF.，2012.Simultaneous production ofisopropanol，butanol, ethanol and 2，3-butanediol by Clostridium acetobutylicumATCC824engineered strains.AMB Express2,45 ;Roos，J.W.，McLaughlin，J.K., Papoutsakisj E.T., 1985.The effect of pH on nitrogen supply, cell lysis, andsolvent production in fermentations of Clostridium acetobutylicum.Biotechnol.Bioeng.27，681-694)。在控制搅拌速度和压力的条件下，3-羟基丁酮最高产量达到2.2g/L (Doremus, M.G., Linden, J.C., Moreiraj A.R., 1984.Agitation and pressure effectson acetone-butanol fermentation.Biotechnol.Bioeng.27，852-860)。Kanouni 等人将丙酮丁醇梭菌ATCC824经3-氟 丙酮酸诱变后，筛选得到最高3-羟基丁酮产量达3.5g/L的突变株(A.EI Kanouni, A.M.Junelles, R.Janat1-1drissi, H.Petitdemange, R.Gay, 1989.Clostridium acetobutylicum Mutants Isolated for Resistance to the PyruvateHalogen Analogs.CURRENT MICROBIOLOGY18, 139-144)，据我们所知，这是丙酮丁醇梭菌中目前文献报道的最高乙偶姻产量。
[0005]提高丙酮丁醇梭菌的3-羟基丁酮产量有以下几方面的意义:
[0006](I)提高传统ABE发酵的经济效益。目前丁醇价格约1.1万元/吨，丙酮0.8万元/吨，乙醇0.55万元/吨。按照3吨糖产I吨溶剂来算，ABE发酵的产品价值只是略高于原料(约3200元/吨糖)，使得生物法生产ABE经济效益很差。然而3-羟基丁酮价格较高，化学法制备的3-羟基丁酮价格约10万元/吨，生物法生产的3-羟基丁酮约25万元/吨。因此提高ABE发酵中的3-羟基丁酮产量将显著提高ABE发酵的经济效益。
[0007](2)有利于开发以3-羟基丁酮为代谢前体的其他重要化学品。ABE发酵中，丁醇是一个疏水性很强的化合物，对细胞有很大的毒性，限制了丁醇的发酵效率。相比丁醇，2，3-丁二醇或者2-丁醇对细胞的毒性较小。尤其是2-丁醇具有与1-丁醇相似的性质，因此可以替代1-丁醇用于第二代生物燃料。通过在丙酮丁醇梭菌中导入乙偶姻还原酶即可将3-羟基丁酮还原生成2，3- 丁二醇，2，3- 丁二醇同时也是2- 丁醇的前体。然而研究表明丙酮丁醇梭菌中3-羟基丁酮的合成是这些途径中的限制步骤(WardWell，S.A., Yang, Y.T., Chang, H.Y., San, K.Y., Rudolph, F.B., Bennett, G.N., 2001.Expressionof the Klebsiella pneumoniae CG21acetoin reductase gene in Clostridiumacetobutylicum ATCC824.J Ind Microbiol Biotechnol.27,220-227;Siemerink, M.A, , Kuit, ff., Lopez Contreras, A.M., Eggink, G., van der Oost, J., Kengen, S.ff., 2011.d-2,3-Butane diol Production Due to Heterologous Expression of an AcetoinReductase in Clostridium acetobutylicum.Appl.Environ.Microbiol.77，2582-2588)。因此，强化丙酮丁醇梭菌3-羟基丁酮的合成，提高其产量对2，3- 丁二醇以及2- 丁醇等的开发都有重要意义。
[0008](3)在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)等中，转录调控因子alsR通过感应乙酸的积累和pH的降低并以乙酸为共调节物促进ALS和ALDC基因的表达，进而促进3-羟基丁酮的生成。因此3-羟基丁酮的生成避免了微生物生存环境的酸化，具有“解毒”的作用。然而，在野生丙酮丁醇梭菌中，这种解毒作用主要是通过丙酮等溶剂的生成来完成，这或许是3-羟基丁酮产量低的原因。事实上，在丙酮丁醇梭菌中3-羟基丁酮和丙酮的生成也确实具有此消彼长的相反关系。因此，通过强化3-羟基丁酮的合成，丙酮产量就会降低。碳源由生成三碳化合物丙酮转向生成四碳化合物3-羟基丁酮，产品得率会进一步提升，并且3-羟基丁酮较丙酮不易挥发，对产品回收也有帮助。
[0009]为了提高丙酮丁醇梭菌3-羟基丁酮的产量，研究通常强化乙酰乳酸合成反应，而非强化乙酰乳酸脱羧反应。因为通常认为，乙酰乳酸合成反应对3-羟基丁酮的生成贡献更大，而即使在缺乏ALDC的情况下乙酰乳酸仍可以自发脱羧生成3-羟基丁酮。然而，无论是在丙酮丁醇梭菌中表达其自身的ALS还是枯草芽孢杆菌的ALS，3-羟基丁酮产量均没有提高(Wardwel 1，S.A.Metabolism of acetoin in C.acetobutylicum ATCC824.RiceUniversity.1999)。这表明丙酮丁醇梭菌中通过表达ALS来强化乙酰乳酸的合成反应对3-羟基丁酮产量的影响甚小。
【发明内容】
[0010]本发明所要解决的技术问题是提供一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，通过强化乙酰乳酸脱羧反应提高梭菌的3-羟基丁酮产量。
[0011]本发明还要解决的技术问题是提供上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法。
[0012]本发明最后要解决的技术问题是提供上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的应用。
[0013]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0014]一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，它是导入了乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因的梭菌。
[0015]其中，所述乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因来自于梭菌属、芽孢杆菌属或克雷伯氏菌属。具体为如下I)至4)中任一所述的基因:
[0016]I)其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
[0017]2)其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；
[0018]3)严格条件下可与序列表中SEQ ID No:1或SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交且编码乙酰乳酸脱羧反应酶的DNA分子；
[0019]4)与SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的序列具有90%以上的同源性且编码乙酰乳酸脱羧反应酶的DNA分子。
`[0020]其中，所述的梭菌为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbuty lacetoni cum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、产芽抱梭(C.sporogenes)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)或肉毒梭菌(C.botulinum)。优选为 C.acetobutylicum ATCC824 和
C.acetobutylicum CGMCC5234。
[0021]其中，丙酮丁醇梭菌Clostridium,acetobutylicum CGMCC5234,菌株号为 B3,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC N0.5234，保藏日期2011年9月9日，该菌株的信息记载在中国专利201210075094.X，申请日2012年3月20日。
[0022]上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法，从梭菌属、芽孢杆菌属或克雷伯氏菌属菌株中克隆乙酰乳酸脱羧反应酶的基因，并通过电转化的方法将其导入梭菌中进行表达。
[0023]上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法，优选的是，从丙酮丁醇梭菌
C.acetobutylicum ATCC824中克隆乙酰乳酸脱羧反应酶的基因，并通过电转化的方法将其导入丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum CGMCC5234中进行表达。
[0024]上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌在生产3-羟基丁酮中的应用。
[0025]本发明的通过强化乙酰乳酸脱羧反应来提高3-羟基丁酮产量的方法，可以显著提高梭菌的乙偶姻产量，使原料由生成丙酮转向生成更多的乙偶姻，而丁醇产量不受影响，即提高了梭菌发酵的产品得率也提高了梭菌发酵的产品价值。[0026]有益效果:本发明的高产3-羟基丁酮的基因工程菌的基因转录分析表明，乙酰乳酸脱羧反应对3-羟基丁酮产量有更大的影响。通过在丙酮丁醇梭菌中强化乙酰乳酸脱羧反应，将3_轻基丁丽广量由初始1.8g/L左右大幅提闻到5g/L左右；而丙丽由4.5g/L左右降低至2g/L，总溶剂(ABE和3-羟基丁酮)得率也由0.35g/g提高到0.39g/g。显著提高了丙酮丁醇梭菌发酵的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是丙酮丁醇梭菌代谢网络示意图。
[0028]图2重组丙酮丁醇梭菌B3 (pIMPl-ALDC)发酵液气相色谱图谱，按出峰先后顺序依次为:3.711min,丙酮；4.126min,乙醇；5.409min, 丁醇；6.734min, 3-轻基丁酮；
7.767min,乙酸；9.299min，丁酸。
【具体实施方式】
[0029]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0030]下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规方法，如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Habor Laboratary Press, 1989)中所述的方法。所用试剂均可从商业途径获得。
[0031]下述实施例以丙酮丁醇梭菌为例阐明本发明的提高梭菌3-羟基丁酮产量的方法。
[0032]酵母粉购自英国OXIOD公司，目录号1023098 ;蛋白胨购自英国OXIOD公司，目录号 594566。
[0033]LB培养基配方为:10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl,固体培养基另加15g/L琼脂粉。用于大肠杆菌的常规培养。
[0034]2xYTG培养基配方为:16g/l蛋白胨，10g/l酵母粉，4g/l NaCl, 5g/l葡萄糖。用于培养制备电转化感受态的丙酮丁醇梭杆菌。
[0035]P2平板培养基:葡萄糖10g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨3g/L,七水合硫酸镁3g/L,乙酸铵2g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，琼脂粉15g/L。
[0036]实施例1:构建含有乙酰乳酸脱羧酶基因CAC2967表达质粒的丙酮丁醇梭菌。
[0037]采用细菌基因组试剂盒提取对数生长中后期的丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC824基因组DNA，用以下引物进行PCR扩增其乙酰乳酸脱羧酶基因CAC2967:
[0038]ALDC-s CATATGATTGAAGAAGTGATCCCTAATCAT (划线部分为 NdeI 识别位点)；
[0039]ALDC-as GAAATAAGTAAAGTTGAGAAATAACATATG (划线部分为 NdeI 识别位点)。
[0040]采用TAKARA公司的高效保真酶Primerstart进行PCR扩增，扩增程序为:950C 3min ；98°C 10s、55°C 15s、72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 PCR 产物经测序后确定其序列如SEQ ID No:1所示。
[0041]将所得PCR产物纯化回收后，与经Nde I酶切后的pMPI_ptb载体(Mermelstein, L.D., Welker, N.E., Bennett, G.N., Papoutsakis, E.T., 1992.Expressionof cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC824.BiotechnologylO, 190 - 195)在T4DNA连接酶作用下连接，构建得到载体pMPl-ALDC。
[0042]将质粒P 頂 Pl-ALDC 转化到 E.coli T0P10 (pAN2)中，E.col i ToplO 购自北京天根生化科技有限公司(目录号CB104)。pAN2为甲基化质粒(Heap, J.T., Pennington, 0.J., Cartman, S.T., Carter, G.P., Minton, N.P., 2007.The ClosTron: a universal geneknock-out system for the genus Clostridium.J Microbiol Methods70, 452-464)。并将转化后细胞涂布于含有氨苄青霉素和四环素素的LB平板上，挑取单菌落富集培养后提取质粒，P IMP 1-ALDC质粒即是甲基化后的P IMP 1-ALDC质粒。
[0043]厌氧条件下，取2xYTG培养基培养的生长至对数中期的C.acetobutylicum B3(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC N0.5234;地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)培养液60ml,4°C、4000rpm离心IOmin弃去上清,加入足量预冷的电转缓冲液EPB (270mM蔗糖，5mM NaH2PO4, pH7.4)，洗涤两次，并用2.3ml EPB重悬。然后取570ul加入0.4cm电转杯放置在冰浴中冷却，并加入20ul甲基化的pMP1-ALDC质粒，冰浴放置2min。2.0kV电压，25uF电容进行电转化。随后将电转液加入到lml37°C的2xYTG培养基中复苏培养4h，离心收集细胞IOOul并将细胞涂布于含有2.5ug/ml红霉素的P2平板中。厌氧培养24-36h后，获得含有pMPl-ALDC质粒的重组丙酮丁醇梭菌，命名为C.acetobutylicum B3(pIMPl-ALDC)。
[0044]实施例2:构建含有乙酰乳酸脱羧酶基因BSU36000表达质粒的丙酮丁醇梭菌。
[0045]采用细菌基因组试剂盒提取对数生长中后期的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)CGMCC N0.3720 (记载于中国专利201010171377.5中)。用以下引物进行PCR扩增其乙酰乳酸脱羧酶基因BSU36000:
[0046]BSU36000-S CATATGATGAAACGAGAAAGCAACATTC (划线部分为 NdeI 识别位点)；
[0047]BSU36000-as TGAAGGAAGCCCTGAATAACATATG (划线部分为 NdeI 识别位点)。扩增产物经测序后确定其序列如SEQ ID No:2所示。将扩增产物按照实施例1的方法导入丙酮丁醇梭菌获得含有PMP1-BSU36000质粒的重组丙酮丁醇梭菌，命名为C.acetobutylicumB3(pIMPl-BSU36000)。
[0048]实施例3:利用基因工程菌发酵生产ABE和3_羟基丁酮。
[0049]丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum) B3 (pIMPl-ALDC)和 B3 (pMPl_BSU36000)在P2种子培养基(不加琼脂，其他组分同P2平板培养基)中37°C静止培养12h。分别以10% (v/v)的接种量接种至发酵培养基中。发酵培养基的配方如下=K2HPO40.5g/LjKH2PO40.5g/L;CH#00NH42.2g/L ；MgS04.7Η200.2g/L;MnSO4.H2O0.01g/L;NaC10.0lg/LjFeSO4.7H200.0lg/L ;对氨基苯酸 lmg/L;硫胺 lmg/L;生物素 0.01mg/L。37°C厌氧发酵60h。发酵液组分用气相色谱检测，气相色谱检测条件如下:火焰离子检测器(FID)，AgilentHP-1NN0WAX19091N-236 毛细管色谱柱(60mX0.25mmX0.25um)，N2 为载气，流速 2mL/min，分流比90:1，H2流速30ml/min，空气流速300ml/min，进样口温度180°C，检测器220°C，柱温(程序升温):70°C保留0.5min，然后以20°C /min的速率升温到190°C，保留4min。气相色谱出峰先后顺序见图2。发酵结果见表1，其中丙酮丁醇梭杆菌B3 (pIMPl-ALDC)和B3(pIMPl-BSU36000)所对应的数据为任意挑选的10株重组菌的平均数据。
[0050]表I重组丙酮丁醇梭菌pMPl-ALDC及对照菌株发酵结果
【权利要求】
1.一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，它是导入了乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因的梭菌。
2.根据权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因来自于梭菌属、芽孢杆菌属或克雷伯氏菌属。
3.根据权利要求1或2所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因具体为如下I)至4)中任一所述的基因: 1)其核苷酸序列如SEQID No:1所示； 2)其核苷酸序列如SEQID No:2所示； 3)严格条件下可与序列表中SEQID No:1或SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交且编码乙酰乳酸脱羧反应酶的DNA分子； 4)与SEQID No:1或SEQ ID No:2的序列具有90%以上的同源性且编码乙酰乳酸脱羧反应酶的DNA分子。
4.根据权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述的梭菌为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、产芽抱梭(C.sporogenes)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)或肉毒梭菌(C.botulinum)。
5.根据权利要求4所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述梭菌为C.acetobutylicum ATCC824 和 C.acetobutylicum CGMCC5234。
6.权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法，其特征在于，从梭菌属、芽孢杆菌属或克雷 伯氏菌属菌株中克隆乙酰乳酸脱羧反应酶的基因，并通过电转化的方法将其导入梭菌中进行表达。
7.权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌在生产3-羟基丁酮中的应用。
【文档编号】C12N15/60GK103436479SQ201310408255
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】应汉杰, 丁凤英, 陈勇, 柳东, 郭亭, 谢婧婧 申请人:南京工业大学