专利名称：一种红细菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌及其应用，尤其涉及一种细菌菌株及其在降解农药残留中的应用。
背景技术：
化学杀虫剂的使用为农业生产挽回了大量因虫害原因造成的损失，大大促进了现代农业生产的发展。但是，化学杀虫剂在杀死害虫的同时，也杀死了有益生物，并残留在生态系统中，对生态系统造成了严重的危害。化学杀虫剂的大量使用，还容易导致农产品中农药残留的超标，严重影响农产品的品质，并对人们的身体健康带来严重威胁，对农产品的出口产生消极影响。
菊酯类杀虫剂是一类人工合成的、类似天然除虫菊酯的化合物。从20世纪80年代以后，在我国被广泛用于粮食、蔬菜和果树等多种作物。农业部的调查统计表明，该类农药是目前我国出口蔬菜、水果中主要的三类农药残留之一。欧盟2007/12/EC农药残留标准达到227项，其中规定菊酯类农药的检出限量为0.05mg/Kg，标准提高了上百倍，致使我国茶叶对欧盟出口量下降一半。日本2006年出台“肯定列表制度”，其中规定菊酯类农药的检出限量为2mg/Kg，使我国茶叶对日出口下降50％左右。严重的影响了我国农产品的出口创汇以及国际竞争力。而且，随着人们生活水平的提高以及环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的环境问题愈来愈关注，人们迫切需要无农药残留污染的绿色食品。但是，从目前我国的农业生产现状以及人口状况来看，以停止农药的使用为代价生产无农药残留的绿色农产品是行不通的，农药作为控制病虫草的有效手段还将继续在农业生产中发挥不可替代的作用。如何解决农业生产中的这个两难问题成为各个学科的研究热点。
实验室和田间实际应用都表明，微生物修复为理论基础的农药残留降解菌技术为降低农产品和农业生产环境中的农药残留物提供了可行的途径，该技术具有高效、无毒、无二次污染的特点，而且经济实用，操作简便，目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。然而，要在大量微生物中筛选、分离出高效降解农药的菌株，制备出使用方便的菌剂，并进行合理化地应用，这都是本领域技术人员需要面临的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低、农药去除效果、高效、无毒、环保的微生物菌株，相应地，还提供一种微生物菌株的应用，使其能以低成本、方便快捷的操作实现对拟除虫菊酯类农药的有效降解。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种红细菌(Rhodobacter sp.)菌株，其特征在于所述菌株为保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)、且保藏号为CCTCCM 209239的菌株。该菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2009年10月23日，该菌株被命名为红细菌S2-1(Rhodobacter sp.S2-1)。
上述本发明的红细菌菌株是通过以下方法筛选得到将采自某农药厂的污泥2.0g加入120mL PSB液体培养基中，光照培养7d后，取1％接种到含甲氰菊酯100mg/L PSB液体培养基中，30±2℃，约3000lx，光照培养7d后，取300μL菌液稀释涂布到含甲氰菊酯100mg/LPSB固体培养基中，光照培养至菌落出现，挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含甲氰菊酯100mg/L选择性液体培养基中，30±2℃、约3000lx，光照培养7d后，取1％分别接种到200mg/LPSB液体培养基中，重复以上步骤，直到1000mg/L PSB液体培养基中。15d后检测农药浓度，以含相同浓度的甲氰菊酯，相同培养条件不接种细菌的培养基为对照。选择降解率最大的红细菌菌株(命名为Rhodobacter sp.S2-1)进行后续研究。将该菌株接种于120mL PSB培养基中培养，30±2℃、约3000lx，光照培养，梯度稀释平板培养法测定菌株生物量，后续实验中菌液浓度调整至约109cfu/mL。
上述技术方案中，所述红细菌CCTCC M 209239，优选为具有以下主要特征的菌株 G-，个体形态为杆状，V-P反应阴性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，H2S反应阴性，3％NaCl中不能生长，最适生长温度为30℃～35℃，最适生长pH值为6.5～7.5，菌体的特征吸收峰为525nm、805nm和865nm，16S rDNA序列长度为1416bp，在Genbank中的登录号为GQ429219。
满足上述特征描述的红细菌CCTCC M 209239在下述应用中的效果更好。
本发明还提供一种上述红细菌CCTCC M 209239在降解拟除虫菊酯类农药中的应用。
上述的应用优选是指用所述红细菌CCTCC M 209239制备拟除虫菊酯类农药降解菌剂，其具体的制备方法优选包括以下步骤 a.将所述红细菌CCTCC M 209239的超低温保存种按平板培养法进行培养，培养至红色菌落出现； b.将所述红色菌落中的单菌落接入血清瓶，用红细菌菌株种子培养基培养至对数生长期； c.将步骤b培养后得到的菌液按不少于红细菌菌株生产培养基总体积1％的接种量(优选1％～5％)接种到生产瓶(例如5L的生产瓶，该瓶可以为透明玻璃瓶)中，用红细菌菌株生产培养基培养至对数生长期； d.出瓶分装制得拟除虫菊酯类农药降解菌剂。
上述红细菌菌株CCTCC M 209239的应用中，所述平板培养法优选是采用双层PSB固体培养基进行培养，所述双层PSB固体培养基的主要成分包括(NH4)2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl 0.02％、酵母膏0.15％和琼脂1.5％。
上述红细菌菌株CCTCC M 209239的应用中，所述红细菌菌株种子培养基、红细菌菌株生产培养基均优选为PSB液体培养基，所述PSB液体培养基的主要成分包括(NH4)2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl 0.02％和酵母膏0.15％。
上述应用中的制备方法是通过不断优化培养条件而得出的最优培养方案，利用该方法培养本发明红细菌菌株，具有以下两个优势一是菌株生长速度快，二是价格低廉，三是培养方法简单、易于操作。
上述应用中的制备方法的全流程时间一般为25天左右，培养结束后，菌体数量可达到10亿个/ml以上，培养完成后出瓶可直接用塑料包分装成液体菌剂。
上述红细菌CCTCC M 209239的应用中，所述步骤a、步骤b、步骤c的每一次培养过程中，优选的pH值均为7.0～7.2，优选的培养温度均为30℃～35℃，优选的光照条件均为2000Lx～3000Lx。前述优化后的工艺参数能使本发明的红细菌菌株生长更迅速，从而缩短生产时间。
与现有技术相比，本发明的优点在于本发明提供了一种生产成本低、农药去除效果好、高效、无毒、环保的红细菌CCTCC M 209239，该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到拟除虫菊酯类农药降解菌剂，使用本发明菌株制备得到的降解菌剂具有生产成本低、使用方便，去除效果好等优点，能够有效用于农业生产中无农药残留粮食、水果、蔬菜等的生产。实验表明，本发明的菌株不仅可用于实验室条件下培养基中高浓度拟除虫菊酯类农药(例如甲氰菊酯)的降解，还可用于田间农作物上拟除虫菊酯类残留农药的降解和去除(例如去除白菜上的氯氰菊酯残留)。本发明的应用可以在对农作物正常施用化学农药、消灭虫害进而保证作物产量的前提下，又能使粮食、水果、蔬菜等农作物中的农药残留降至很低或没有。而且，本发明的菌株本身具有多种营养成分及活性物质，能够有效促进作物生长，兼具防治作物病害的作用，具有安全、无毒、环保的特点。此外，由于本发明的菌株可以应用于降解高浓度拟除虫菊酯类农药，因此亦可用于农药生产废水的处理。
一种红细菌菌株(Rhodobacter sp.S2-1)，其保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC M 209239，保藏日期为2009年10月23日。
具体实施例方式 实施例1 一种本发明的红细菌菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC M 209239。该菌株具有以下主要特征 G-，个体形态为杆状，V-P反应阴性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，H2S反应阴性，3％NaCl中不能生长，最适生长温度为30℃～35℃，最适生长pH值为6.5～7.5，菌体的特征吸收峰为525nm、805nm和865nm，16S rDNA序列长度为1416bp，在Genbank中的登录号为GQ429219。
本实施例用上述红细菌CCTCC M 209239制备拟除虫菊酯类农药降解菌剂，其方法具体包括以下步骤 (1)活化将上述红细菌CCTCC M 209239的超低温保存种按双层平板培养法进行培养，该双层平板培养法具体是用双层PSB固体培养基进行培养，其主要成分包括(NH4)2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl 0.02％、酵母膏0.15％和琼脂1.5％，培养时的pH值为7.0～7.2，温度为30℃～35℃，光照条件为2000Lx～3000Lx，培养至红色菌落出现； (2)种子培养将步骤(1)培养出的红色菌落中的单菌落接入血清瓶，用PSB液体培养基培养，该PSB液体培养基的主要成分包括(NH4)2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl 0.02％和酵母膏0.15％，培养时的pH值为7.0～7.2，温度为30℃～35℃，光照条件为2000Lx～3000Lx，培养至对数生长期； (3)生产培养将步骤(2)培养后得到的菌液按红细菌菌株生产培养基总体积的1％～5％的接种量接种到生产瓶中，用红细菌菌株生产培养基培养，该生产培养基的主要成分包括(NH4)2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl 0.02％和酵母膏0.15％，培养时的pH值为7.0～7.2，温度为30℃～35℃，光照条件为2000Lx～3000Lx，培养至对数生长期； (4)出瓶分装制得拟除虫菊酯类农药降解菌剂。
本实施例方法的全流程培养时间为25天，培养结束后，菌体数量达到10亿个/ml以上。
实施例2 本发明菌株在降解培养基中高浓度甲氰菊酯的应用 甲氰菊酯用丙酮溶解，添加到实验培养基中至甲氰菊酯的终浓度为600mg/L，所用的实验培养基为(NH4)2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl 0.02％和酵母膏0.15％，该实验培养基的pH值为7.0～7.2，温度为30℃～35℃，光照强度为2000Lx～3000Lx，将实施例1中制备的菌剂接种到该实验培养基中培养15天。用石油醚萃取培养后实验培养基中的甲氰菊酯，气相色谱仪(Agilent 6890N)测定甲氰菊酯残留，检测器为电子俘获器(ECD)。以不加菌剂的实验培养基为对照。所有处理重复三次，测定结果见下表1所示。
表1本实施例2的实验培养基中甲氰菊酯降解率对照
由上表1可见，应用本发明的菌株，15天可以使600mg/L甲氰菊酯的降解率达到37.34％。
实施例3 本发明菌株在降解田间白菜和土壤中氯氰菊酯的应用 选用4.5％高效氯氰菊酯乳油(南京红太阳集团股份有限公司生产)作为药剂，推荐使用剂量上限的1.5倍，按每亩喷施60kg水量计算喷雾，药剂处理小区面积为32.25m2，对照处理小区面积为80.75m2，根据登记时推荐的采收间隔期(14天)和两次施药的间隔期(10天)，确定施药三次。第一次施药时间为8月31日，第二次为9月10日，第三次为9月20日。
取实施例1制备的菌剂200ml，兑水60kg后均匀喷施在大白菜(夏阳白)上。第一次喷施菌剂时间为8月31日，第二次为9月10日，第三次为9月20日(均在药剂喷施以后喷施菌剂)。以喷施菌剂的田间白菜作为对照。所有处理重复三次。
10月6日采样。
植株样品小区对角线法四点取样，每处理小区每点采样1株，有病、过大、过小的植株均不采，每处理小区共4株，去掉烂叶和黄叶。先将每株白菜纵切为四份，取相对的两份再切成长约2cm的碎片，4株全部切完后充分拌匀，若超过1kg则再用四分法取相对的两份合成一个约1kg重的植株样品。取样、切样和装样的整个过程操作人员均戴一次性塑料手套，装样品的其他器具均垫上塑料薄膜，每个处理取样完成后更换手套和塑料薄膜。
土壤样品小区对角线法四点取样，每处理小区采集0～10cm耕层土样1Kg左右；对照样品在每个处理小区的无菜空白区上，对角线法四点取样，采集0～10cm耕层土样1kg左右混合为一个样品。取样操作人员戴一次性塑料手套，每个处理取样完成后更换一次性塑料手套以及取样器。
所有样品于同年11月4日全部送湖南省农产品质量检测检验中心检测。检测结果见下表2。
表2本实施例3的田间白菜和土壤中的氯氰菊酯降解率对照
由上表2可知，在田间实际应用中，可以使白菜中氯氰菊酯的降解率达到62.07％，土壤中氯氰菊酯的降解率达到51.86％。
权利要求
1.一种红细菌菌株，其特征在于所述红细菌(Rhodobacter sp.)菌株为保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC M 209239的菌株。
2.根据权利要求1所述的红细菌菌株，其特征在于，所述菌株为具有以下主要特征的菌株
G-，个体形态为杆状，V-P反应阴性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，H2S反应阴性，3％NaCl中不能生长，最适生长温度为30℃～35℃，最适生长pH值为6.5～7.5，菌体的特征吸收峰为525nm、805nm和865nm，16S rDNA序列长度为1416bp，在Genbank中的登录号为GQ429219。
3.一种如权利要求1或2所述红细菌菌株在降解拟除虫菊酯类农药中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用所述红细菌菌株制备拟除虫菊酯类农药降解菌剂，其具体的制备方法包括以下步骤
a.将所述红细菌菌株的保存种按平板培养法进行培养，培养至红色菌落出现；
b.将所述红色菌落中的单菌落接入血清瓶，用红细菌菌株种子培养基培养至对数生长期；
c.将步骤b培养后得到的菌液按不少于红细菌菌株生产培养基总体积1％的接种量接种到生产瓶中，用红细菌菌株生产培养基培养至对数生长期；
d.出瓶分装制得拟除虫菊酯类农药降解菌剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述平板培养法是采用双层PSB固体培养基进行培养，所述双层PSB固体培养基的主要成分包括(NH4)2SO4O.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％、酵母膏0.15％和琼脂1.5％。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述红细菌菌株种子培养基、红细菌菌株生产培养基均为PSB液体培养基，所述PSB液体培养基的主要成分包括(NH4)2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％和酵母膏0.15％。
7.根据权利要求4、5或6所述的应用，其特征在于所述步骤a、步骤b、步骤c的每一次培养过程中，pH值均控制为7.0～7.2，培养温度均控制为30℃～35℃，光照条件均控制为2000Lx～3000Lx。
8.根据权利要求4、5或6所述的应用，其特征在于所述步骤c中菌液的接种量为红细菌菌株生产培养基的1％～5％。
全文摘要
本发明提供一种红细菌菌株及其应用，该红细菌菌株为保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC No:M 209239的菌株。用本发明的红细菌菌株可以制备拟除虫菊酯类农药降解菌剂，本发明的红细菌菌株具有生产成本低，农药去除效果好，高效、无毒、环保等优点，该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到拟除虫菊酯类农药降解菌剂。
文档编号C12N1/20GK101724585SQ20091004477
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者刘勇, 张松柏, 张德咏, 罗香文, 成飞雪, 罗源华, 程菊娥, 何明远, 谭新球, 戴建平, 朱春晖, 杨春晓, 刘绍文 申请人:湖南省植物保护研究所