专利名称：构建膀胱出口梗阻动物模型的方法
技术领域：
本发明涉及构建膀胱出口梗阻动物模型的方法。
背景技术：
膀胱出口梗阻(BOO)是下尿道综合症(LUTS)的主要病因之一，在成年男性 中发病率很高，且随着年龄增长而增加。我国男性LUTS患病率不断上升，几乎接 近欧美国家，严重影响着男性的生理健康和生活质量。膀胱出口梗阻动物模型的产 生对于病理的分子机制研究以及药物的筛选具有重要的意义。目前主要有如下两种 方法产生的梗阻动物模型①手术结扎法对鼠、兔等小型动物尿道进行结扎形成 机械性梗阻。其梗阻程度难以确定； 一旦结扎梗阻即可形成，是一种急性梗阻，而 非人类的慢性进行性梗阻；②N0合酶(iN0S)缺陷的基因敲除小鼠这是迄今为 止所报道的唯一一个B00基因修饰的动物模型，但是其B00的发病率只有2 0%。
现有的梗阻动物模型存在着发病率低、不能确切地模拟病因等问题，因而不能 成为基础研究和应用上通用的模型。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种构建膀胱出口梗阻动物模型的方法。 本发明所提供的构建膀胱出口梗阻动物模型的方法，是向动物中转入芳香化酶 编码基因，得到含有所述芳香化酶编码基因的动物作为膀胱出口梗阻动物模型。
其中，所述向动物中转入芳香化酶编码基因的方法可包括如下步骤向离体的 所述动物的受精卵中导入所述芳香化酶编码基因，得到含有所述芳香化酶编码基因 的受精卵，再将其通过非外科手术方法移入另一所述动物的子宫中，产出含有所述 芳香化酶编码基因的动物幼仔，即为所述膀胱出口梗阻动物模型。
所述芳香化酶编码基因具体可以是通过表达盒转入的。所述表达盒具体可以是
由启动子序列、芳香化酶编码基因序列和牛生长激素基因的polyA信号序列按上游
至下游的次序依次连接形成的。
所述表达盒具体可是通过重组载体导入的。 所述芳香化酶编码基因为人芳香化酶编码基因。 所述人芳香化酶编码基因可为如下的a) 、 b)或c)所示的分子a) 序列表中序列2自5'末端起第7-2154位核苷酸所示的DNA分子；
b) 在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码人芳香化酶的DNA分子；
c) 与a)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且编码人芳香化酶的DNA分子。
所述启动子可为如下的l) 、 2)或3)所示的分子
1) 序列表中序列l自5'末端起第7-1217位核苷酸所示的DNA分子；
2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
3) 与l)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且具有相同功能的DNA分子。 所述牛生长激素polyA信号的核苷酸序列具体可如序列表中序列3所示。 所述动物具体可为鼠，优选为C57BL/6小鼠。
人芳香化酶编码基因在构建膀胱出口梗阻动物模型中的应用也属于本发明的 保护范围。
老年男性体内的激素水平呈现雌/雄激素比例上升的状态，而膀胱出口梗阻主 要发生于老年男性。该动物模型由于高表达了芳香化酶(体内将雄激素转化为雌激 素的关键酶)，体内的雌激素水平高，近似地模拟了老年男性体内的激素状态。这 种激素状态潜移默化地诱导很多相关疾病，包括膀胱出口梗阻，它区别于其它几种 手术急性梗阻模型，是由于激素水平的变化而导致的慢性疾病，比较符合临床上老 年男性多发膀胱出口梗阻疾病的表现。
本发明的发明人对多种动物进行了大量的实验，最后发现用C57BL/6小鼠作为 受体动物，构建的模型比其它品种的小鼠效果要好，其它品种小鼠构建的模型的膀 胱出口梗阻的表型没有C57BL/6明显。
本发明模拟老年男性体内雌/雄激素比例升高的特点，利用转基因的方法使小 鼠体内高表达雌激素，实现自发的产生膀胱出口梗阻。与现有的结扎法所产生的急 性梗阻相比，本发明的动物模型产生的梗阻类似于人类的慢性进行性梗阻，能够确 切的模拟病因，更加符合人类实际发病情况；与NO合酶(iNOS)缺陷的基因敲除 小鼠模型相比，本发明模型的发病率更高，可达90% (N=20)。与相同条件下用 FVB/N鼠构建的模型相比，本发明构建的模型的性状明显，发病率高，FVB/N鼠构 建的模型的发病率仅为5%。本发明模型可应用于雌激素诱导膀胱逼尿肌功能异常的 分子机理的研究、在体动物水平抑制雌激素信号通路对膀胱逼尿肌的功能的改变的 研究等，因此，本发明的动物模型更加适合于对膀胱出口梗阻的病理分子机制的研究以及药物的筛选，具有重要意义。
图1为芳香酶表达载体的结构示意图。
图2为PCR鉴定结果图。 图3为Southern Blot筛选结果。 图4为小鼠表型鉴定尿潴留，膀胱出口梗阻。 图5为膀胱组织HE染色及Van Gieson染色结果。 图6为芳香化酶基因的半定量RT-RCR。 图7为芳香化酶Western Blot检测结果图。 图8为以FVB/N小鼠为受体构建的模型。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1、用C57BL/6小鼠构建膀胱出口梗阻动物模型 一、重组表达载体(芳香酶表达载体)的构建 pUB6/V5-HisA (Cat.No.V25020， Invitrogen， Carlsbad, CA);
pRC/CMV(Cat. No. 10131027， Invitrogen, Carlsbad, CA)。
C57BL/6小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心。C57BL/6是国外引
进的近交系，是B6F129和B6JEiF 78杂交，而后经过129代的同胞兄妹近交而生产
的近交系，相关基因型是a/a。
(1) UbiquiUn C基因的启动子及其外显子I和内含子I的获得 用限制性内切酶BglII和HindlII酶切pUB6/V5-HisA，回收Ubiquitin C基因的
启动子及其外显子I和内含子I片段，其中片段"Ubiquitin C基因的启动子及其外 显子I和内含子I"及该片段在载体pUB6/V5-HisA上两端的酶切位点的核苷酸序列如 序列表中序列l所示；序列1自5'末端起第l-6位核苷酸为BglII的识别序列 (AlGATCT)，序列1自5'末端起第1218-1223位核苷酸为HindlII的识别序列 (AlAGCTT);序列1自5'末端起第7-1217位核苷酸为片段"Ubiquitin C基因的 启动子及其外显子I和内含子I"的序列。
(2) 人芳香化酶编码基因的cDNA的获得 两端带有酶切位点的人芳香化酶编码基因的cDNA全长序列如序列表中序列2所示，其中序列2自5'末端第1-6位核苷酸为HindlII的识别序列(AlAGCTT)，第 2155-2160位核苷酸为XbalI的识别序列(T|CTAGA)，第7-2154位核苷酸为人芳香 化酶编码基因的cDNA全长序列。人工合成序列表中序列2所示核苷酸序列。
(3) 牛生长激素基因的polyA信号序列
在载体pRC/CMV上具有牛生长激素基因的polyA信号序列，其核苷酸序列如序 列表中序列3所示；polyA序列为序列4中自5'末端起第3430-3638位。
(4) 重组表达载体的构建
用限制性内切酶BglII和HindIII酶切载体pRC/CMV，回收大片段(即去除CMV 启动子的载体片段)，将其与步骤(1)中酶切获得的Ubiquitin C基因的启动子 及其外显子I和内含子I片段连接，得到重组载体pRC/libiquitin C;
用限制性内切酶Hindin/Xbal酶切重组载体pRC/Ubiquitin C，回收大片段； 用限制性内切酶HindlII/Xbal酶切人芳香化酶编码基因的cDNA片段，连接，得到 重组表达载体pRC/Ubiquitin C/cDNA (即芳香酶表达载体)，其结构如图1所示， 得到DNA片段"Ubiquitin C基因的启动子、外显子I和内含子I +人芳香化酶 编码基因的cDNA + bGHpolyA"，其核苷酸序列如序列表中序列4所示(其中，第 l-3376位核苷酸是"启动子+芳香化酶基因"，第3377-4156位核苷酸是牛生长激 素基因的polyA信号序列；其中第3430-3638位为polyA序列，第3377-3429以及 3639-4156之间的序列都是pRC/CMV载体上的自带的，选择酶切回收这一段序列(包 括几百bp多余的序列)是受到酶切位点的限制，对构建的重组载体没有影响)。
二、转基因小鼠的构建 将构建的芳香酶表达载体用Bgl II和Dra I进行双酶切，回收DNA片段 "UbiquitinC基因的启动子、外显子I和内含子I +人芳香化酶编码基因的(:0嫩 + bGH polyA"，将DNA片段制成2ng/uL的悬液，显微原核注射入C57BL/6小鼠 受精卵中；胚胎移植入待孕母体子宫中；生产转基因小鼠，得到的转基因小鼠计作 F0代。具体的实验步骤如下
(一)超数排卵(超排)与取卵
1、超数排卵取4 6周龄的母鼠作超排卵供体，腹腔注射孕马血清(PMSG)和 人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵。二者注射时间间隔为42 48h，排卵发生 在注射hCG后10 13h，注射剂量为每鼠5 10u。注射hCG后每只母鼠置于一个单 独饲养的正常公鼠笼内，次日晨检査阴道栓。2.取卵用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，把完整的输卵管带一小段子宫剪 下，置于PBS平衡盐溶液中，在解剖镜下找出输卵管伞部，用带针头的注射器将受 精卵冲出，用透明质酸酶去除包围着的颗粒细胞后立即将卵子换至新鲜培养液内洗 涤3 4次即可用于显微注射。
(二) 注射外源DNA:显微注射需用显微操作仪，用来控制显微持卵针和显微
注射针。取已制备好的受精卵细胞和外源DNA悬液，在倒置显微镜下做显微注射。 注射时先用持卵针吸住受精卵，再用注射针吸取外源DNA悬液，然后推动注射针， 使其刺入受精卵的雄原核，将DNA注入(DNA浓度2ng/uL)。注射完毕，慢慢 抽出注射针，将受精卵放入新的培养液中，使其恢复。50 80%的受精卵在显微注 射后仍保持健康。
(三) 注射后受精卵(或胚胎)的移植将注射有外源DNA的受精卵在显微操作 当天移植到交配后0.5d假孕雌鼠的输卵管内。外源DNA可直接导入原核内，导入 的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合。待假孕母鼠产出幼仔后，可用幼鼠尾巴提 取基因组DNA迸行检测
本实验采用如下移植方法用戊巴比妥钠麻醉受体鼠，从假孕鼠阴道向子宫颈 管道插入外径10毫米的粗导管，然后将直径5毫米的细导管插入粗导管内侧，伸 入到子宫体或一侧子宫角。将囊胚连同2毫升保存液一起通过细导管移植进去，具 体是用干冰产生出来的二氧化碳经过导管将囊胚吹入到子宫内1-3分钟。
也可以采用如下移植方法用戊巴比妥钠麻醉受体鼠，沿受体鼠背部中线最后 一根肋骨水平切l cm左右切口，轻轻拨开切口，可见位于卵巢上方的白色脂肪垫. 用小镊子夹住白色脂肪垫将其拉到体外，用小血管夹夹住，并靠其重力起固定作用， 以防输卵管縮回体腔.用移卵管吸15 20个受精卵准备移植.将小鼠转到解剖镜 下仔细寻找到输卵管.可见输卵管被一层呈半透明的囊膜所包绕，将囊膜撕破而暴 露输卵管，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部。将输卵管小心放回。缝合。
实验设3次重复。
三、转基因小鼠的筛选
阳性小鼠的鉴定及繁育运用PCR及Southern Blot方法筛选阳性转基因小鼠； (一)PCR筛选方法模板DNA为假孕母鼠所产Founder幼鼠的鼠尾DNA，(假 孕母鼠生产的转基因动物称为Founder)正向引物5， -CCCGTTCTGTTGGCTTAT-3，， 反向引物5， - GACCTGGTATTGAGGATGTG-3，，扩增572bp片段，不能扩增出该片段的为阴性，能扩增出该片段并通过测序正确的为阳性。结果如图2所示，6号为阳
性，+为阳性对照。将PCR阳性的PCR产物进行测序，测得的序列如序列表中序列4 的自5'末端起第853-1424位核苷酸所示，表明PCR产物结果正确。 (二) Southern Blot筛选方法
1、 基因组DNA的制备按常规鼠尾提取DNA的方法制备DNA
2、 基因组DNA的限制酶切
在l. 5ml离心管中依次加入DNA(lu g/u 1)20u g， 10X酶切buffer 4. 0u 1， EcoR I (lOU/ul)5. 0ul，加ddH20至500 u 1， 37。C消化过夜。
3、 基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
制备0.8%凝胶 一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。电泳电泳样品中 加入10XLoading缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。 1-2V/cm， DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。正常电 泳图谱呈现一连续的涂抹带。
4、 DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物(毛细管法)
(1) 试剂准备变性液0. 5MNa0H; 1.5MNaCl。中和液1M Tris-HC1 (pH 7.4); 1.5MNaCl。转移液(20XSSC) : NaC1175.3g;拧檬酸三钠82. 2g， Na0H调 pH至7. 0，加ddH20至1000ml。
(2) 操作步骤 碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30分钟。 中和将凝胶转移到中和液15分钟。
转移按凝胶的大小剪裁带正电尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入 转移液中5分钟。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的 尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。转移过程一般需要8-24小时，每隔数小时 换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20XSSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操 作过程中要防止膜上沾染其它污物。
转移结束后取出膜，浸入6XSSC溶液数分钟，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置 于两张滤纸之间，80° C烘2小时，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。
5、 探针标记进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记
(1)取25-50ng模板DNA(EcoRI酶切构建完成的质粒载体，回收2. 7K片段) 于0.5ml离心管中，10(TC变性5分钟，立即置冰浴。(2) 在另一个O. 5ml离心管中加入Labeling 5Xbuffer 10yl，(含有 随机引物)dNTPmix 2ul，(含dATP、 dGTP、 dTTP各0.5raM) ， BSA (小 牛血清白蛋白)2ul，[a-32P]dCTP3ul， Klenow酶 5U。
(3) 将变性模板DNA加入到上管中，加ddH20至50ul，混匀。室温90分钟。
(4) 加50p1终止缓冲液终止反应。
6、 杂交
预杂交膜浸入2XSSC中5分钟，在杂交瓶中加入杂交液(8cmX8cra的膜加 5ml即可)，将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42"C杂交炉中，使 杂交体系升到42"。
杂交倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42"C的杂交液。将探针 10(TC加热5分钟，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42。C杂交过夜。
7、 洗膜与检测
取出膜，在2XSSC溶液中漂洗5分钟，然后按照下列条件洗膜
2XSSC/0. 1% SDS， 42°C， 10分钟;1XSSC/0. 1% SDS， 42°C， IO分钟; 0. 5XSSC/0. 1% SDS， 42°C, IO分钟;0. 2XSSC/0. 1% SDS， 56°C， 10分钟; 0. 1XSSC/0. 1% SDS， 56°C， IO分钟。
在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践 证明，当放射强度指示数值较环境背景高l-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过 程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2XSSC中2分钟，取 出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与膜之间不能有气 泡。将膜正面向上，放入磷板中，三天后扫描磷板，结果如图3 (l为阳性对照， 是回收的探针，6为southern blot阳性鼠)。
以上结果表明，筛选得到的阳性转基因小鼠正确。
四、 遗传稳定性检测
将步骤三筛选得到的阳性雌鼠与野生型C57BL/6公鼠配对，繁育得到Fl代； 对F1代小鼠进行筛选，方法同步骤三所述。以此类推，繁育F2代，F3代，F4代， 每一代都进行阳性筛选，阳性转基因鼠中均能检测到该插入的基因。
五、 阳性转基因鼠的表型鉴定及组织学分析和基因表达分析 将按照上述方法得到的Fl代和F2代阳性转基因公鼠成年后进行生殖泌尿系统
表型鉴定、组织病理学分析、基因表达分析。(一) 表型鉴定
结果阳性转基因公鼠成年后生殖泌尿系统表型鉴定结果如图4所示(l表示 阳性转基因小鼠，2表示野生型小鼠)。
(二) 组织学分析
解剖获取所述转基因小鼠的膀胱及尿道，入4%多聚甲醛中固定48小时，水洗 4小时后进行组织包埋HE染色及胶原Van Giesan染色，具体步骤如下
将固定好的组织用PBS洗涤2次，每次10分钟。然后进行脱水和浸蜡，方法 如下70%乙醇(l小时)，80%乙醇(l小时)，90%乙醇(l小时)，95%乙醇(1 小时)，无水乙醇(l小时x2) ， 二甲苯(15分钟一次，5分钟一次)，石蜡一 (30 分钟)，石蜡二 (30分钟)，石蜡三(30分钟)；
将处理过的组织放在包埋盒底部中央，倒入融化的蜡，室温中冷却；
切片(1)将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。
(2) 将护刀盖推至打开位置。
(3) 摇动快速进退手轮，使石蜡块与刀口贴近，但不超过刀口。
(4) 调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15-30度。
(5) 调整厚度调节器到所需的切片厚度， 一般5um。
(6) —切调整好后就可以切片。此时右手摇动大手轮，左手持毛笔将蜡带提 起，摇转速度以每分钟40-50转为宜。
(7) 切成的蜡带到20-30厘米时，右手用另一支毛笔将蜡带挑起，平放在蜡 带盘上(注意靠刀面的一面较光滑朝下)。
贴片切好的蜡带置于捞片机温水中(注意蜡片光面向下)，待其完全展开后， 取一清洁的以粘片剂处理的载玻片捞取至片上中间部位。并作好标记。 烤片把玻片标本置于片架上，37°(:温度烤片24小时。 服染色
(1) 组织芯片置于二甲苯中浸泡15分钟
(2) 更换二甲苯后再浸泡7分钟；
(3) 无水乙醇I中浸泡5分钟；
(4) 无水乙醇II中浸泡5分钟
(5) 95%乙醇中浸泡5分钟；
(6) 90%乙醇中浸泡5分钟；(7) 80%乙醇中浸泡5分钟；
(8) 70%乙醇中浸泡5分钟；
(9) 苏木精中浸泡15分钟；
(10) 水洗2分钟
(11) 盐酸酒精分化10秒；
(12) 80%乙醇中2分钟;
(13) 70%乙醇中2分钟；
(14) 伊红中79秒；
(15) 90%乙醇中浸泡3分钟
(16) 95%乙醇中浸泡3分钟
(17) 无水乙醇II中浸泡3分钟
(18) 无水乙醇I中浸泡5分钟
(19) 二甲苯II中3分钟
(20) 二甲苯I中3分钟
(21) 中性树胶封片，镜检 Van Gieson染色
(1) 试剂的配制
weigert氏苏木素A液苏木素 lg (haematoxylin)， 无水酒精 100ml; B液30%三氯化铁4ml (ferric chloride)， 蒸馏水95ml，盐酸lml。
Van Gieson氏液A液酸性品红lg (acid fuchsin)， 蒸馏水 lOOml。 B液苦味酸饱和水溶液，(1.22%) (picric acid)。
Weigert氏苏木素临用前取A液和B液等份混合，几个小时内用完，最长不得 超过一天。苏木素配后经二十多天才能成熟，必须提前配制。该液能抵抗弱酸性染 液，对已着染的细胞核在酸性染液的作用，不易被脱去颜色，如果不特别深染，则 无须分化。Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液lml，即可使用。
(2) 操作方法
切片脱蜡至水；用Weigert氏苏木素染20min;水洗，必要时可分化；流水冲 洗10rain;染Van Gieson氏液lrain;用95%酒精快速分化；无水酒精脱水，二甲苯 透明，封固。
染色结果如图5所示(A表示HE染色结果，B表示Van Gieson染色结果；其中，l表示野生型小鼠，2表示阳性转基因小鼠；a表示胶原纤维，b表示肌纤维)。 表明，阳性转基因小鼠膀胱尿潴留，膀胱中固有层增厚，逼尿肌排列紊乱。
逼尿肌层萎縮。尿道括约肌萎縮。Van Gieson染色显示胶原增多。
图5中，胶原纤维鲜红色，肌纤维黄色，细胞核蓝黑或灰色。 (三)基因表达分析
快速解剖获取转基因小鼠的膀胱于液氮中速冻，-S(TC保存，留待提取RNA和 蛋白质，通过RT-PCR和Western Blot方法做基因表达检测，具体方法如下 1、 RT-PCR:
I 、总RNA的提取及检测
(1)迅速从液氮中取出膀胱，剪取50mg左右，剪碎放入匀浆杯中，加入lml Trizol，用匀浆器匀浆1-2min，将组织匀浆液转入1. 5ml离心管中，室温放置5min。
(2) 加入1: 24异戊醇/氯仿200W，充分混匀，务必成乳白色，冰中放置10min。
(3) 4°C， 12000转/min离心10min。
(4) 取上清，加入等体积异丙醇(预冷)混匀。
(5) - 20°C放置lh后，4°C， 10000转/min离心10min。
(6) 弃上清，沉淀溶于800^175%的乙醇，室温放置10min， 4°C， 10000转/min 离心10min。
(7) 重复步骤(6)—次。
(8) 小心弃上清，在恒温箱中65T烘干；核酸分析仪测定总RNA的0D2M/0D280， 根据A腳值计算RNA样品浓度RNA样品浓度(ng/Ml) =A26。XDNA稀释倍数X50。
痕量DNA的消化
(1) 向RNA水溶液中加入lOW的10xDNase-l缓冲液，
0. 5WRnsin(40-200UA4) ， 2. DNase-l (5UA4) ， 4. OnlO， 1MDTT，用DEPC水i周 至100ml， 37。C保温15min。
(2) 加入等体积的酚:氯仿(l:l)混匀。
(3) 4°C， 12000r/min离心10min。
(4) 取上清，加入l/10体积的3mol/l的NaAc和2.5倍体积的预冷的乙醇混匀。
(5) -20。C沉淀30rain以上，10000r/min， 4。C离心15min。
(6) 沉淀用乙醇淋洗两次，烘干，溶于无核酸酶水中，存于-70。C备用。(7)紫外分光光度计检测所提RNA的含量。 II 、反转录合成cDNA第一条链 反转录体系如表
反转录体系
反应组分
反应体积W
M-MLV 5xbuffer dNTPs(10mM) RNasin(40-200U/H1) Oligo dT (20uM) RNA
DEPC水
4. Owl0.
4. (W
1. OPg
补足至20叱
反转录操作程序
(1) 将以上成分混匀后，短暂离心，在PCR仪上75。C温育5min。
(2) 立即放置冰上5min。
(3) 加入M-MLV(200U/W)1. 混匀，短暂离心。
(4) 在PCR仪上进行如下程序37。Clh， 95。C5min，反转录产物于-20。C备用。 III、半定量PCR检测相关基因的表达情况，以芳香化酶基因(arom)为例，方
法如下
PCR反应体系10xbuffer2叱，dNTPs(2. 5uM each)1. 6叱，primer F (10uM)
0.叫L， primer R(10uM) 0. 4叱，cDNA l叱，Taq酶(10U/(4j 0. 3叱，ddH20
补足至20礼。
反应程序如下 95 。C 5min
94°C 30s '
55°C 30s ^ 30 cycles 72°C 30s 72°C 5min
芳香化酶基因的引物F: 5' GTCTCTCTCACCAATAACAGTC-3，。
-ACCTCTAACACGCTCTTC-3' ,R: 5，-
结果如图6所示(Al、 A2为芳香化酶转基因小鼠，WT1， WT2为野生型小鼠)。 2、 Western Bloting
(1)蛋白质样品的制备
按实验要求将膀胱从动物体内取出(样品不宜反复冻融)，取少量(l-2g左右)放入玻璃匀桨器中用RIPA buffer研磨成匀浆，冰浴半小时让细胞充分裂解，4 °C， 12, OOOrpni离心10分钟，取上清。加入1/4体积左右的上样Buffer,然后放在 沸水浴中加热3-4min使蛋白变性，方可作为样品点样。
(2) SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS — PAGE)
① 根据要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝胶(一般釆用10%的SDS—PAGE)。
② 将已配制好的凝胶装入电泳仪中。
③ 设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。 一般裂解液按10-20u1/ 道点样。
④ 把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V电泳10-20min，待溴酚蓝迁移 出积层胶位置再换用200V， 30-40min后关闭电源。
⑤ 从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用水冲洗干净，准备转膜。
(3) 转膜(湿转)
① 将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡几分钟。
② 带上手套，准备好滤纸和NC膜(83mmX75mra)，尽量避免污染滤纸和膜， 将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
③ 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转 移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸。
按"海绵一滤纸一凝胶一PVDF膜一滤纸一海绵"的顺序装置好(注意不能 有气泡且装置电极槽不能放反)
⑤ 将冰盒装入缓冲液槽，注满4r预冷的转移缓冲液。
⑥ 将整个装置放在冰浴中用磁力搅拌器搅拌，连接好转移电极恒流100mA转移 3小时。电转完毕后，将PVDF膜作好记号置于含2。/。的脱脂奶粉(TBST配制)和适 当浓度(1: 500-1: 1000)的一抗中孵育l小时。弃去一抗，膜条仍置于加样槽， 每个槽中的膜用TBST在摇床洗漆洗涤15分钟一次，5分钟一次。
(4) 加二抗与一抗的结合
① 根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度(TBST稀释，1:2000)， 每个加样槽中加入二抗20mL左右室温下于摇床孵育lh，注意保证膜的所有部分同 溶液接触。
② 弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加TBST在摇床洗涤洗涤5分钟左右， 换液反复4-5次。一抗为芳香化酶(sc-14244, Santa Cruz Biotechnology, INC) ; 二抗为辣根 酶标记兔抗山羊IgG (ZB-2306,中杉金桥)。 (5)显色反应
底物发光法将两种显色底物l: l等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，
用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面(时间根据光的亮 度来衡量)，显影、定影。结果如图7所示(A1，A2为阳性转基因小鼠，WT为野生 型小鼠)。
以上证明，本发明得到的转基因小鼠正确，可以作为膀胱出口梗阻动物模型。 构建转基因小鼠及其筛选和鉴定的实验重复3次，每次以30只小鼠为实验对
象，共得到20只阳性转基因小鼠。所有阳性转基因小鼠在2个月大时出现腹股沟
疝，20只中有18只8个月大时有尿潴留，膀胱出口梗阻，表明本发明动物模型的
发病率高，可达90%。
判断发病的标准小鼠在两个月大时出现腹股沟疝，行动相对迟缓，抓起小鼠
时，野生型鼠会应激排尿，而该转基因鼠不会或很少应激排尿，人为地挤压腹部也
只能少量地排除些尿。由此可以判定其发病了。
更精确地确定其发病解剖小鼠，看解剖开小鼠后膀胱的储尿， 一般野生型小
鼠在解剖之前由于抓取已经排了大部分的尿，因此膀胱几乎是瘪的，而转基因小鼠
的膀胱还有较多的尿，膀胱处于充盈状态。
实施例2、用FVB/N小鼠构建膀胱出口梗阻动物模型 FVB/N小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心。 以FVB/N小鼠为受体，按照实施例1中所述方法构建和筛选鉴定转基因小鼠。 构建FVB/N转基因小鼠及其筛选和鉴定的实验重复3次，每次以30只小鼠为
实验对象，共得到20只转基因小鼠。只有一只转基因阳性小鼠在9个月大时出现
腹股沟疝，有尿潴留，膀胱出口梗阻，表明构建的FVB/N小鼠动物模型的发病率为
5%。发病判断标准同实施例1中所述。
转基因小鼠及野生型小鼠的疝气和膀胱出口梗阻的症状结果如图8所示。A为
转基因FVB/N鼠(4个月大)，B为野生型FVB/N鼠(4个月大)，C为转基因FVB/N
鼠(9个月大)，D为转基因C57BL/6鼠(2个月大)，E为野生型C57BL/6鼠(2
个月大)。
结果表明，A所示的转基因FVB/N小鼠隐睾，疝气和膀胱出口梗阻的症状不明显；C所示的转基因FVB/N鼠9个月时才出现疝气。而D所示的转基因C57Bl//6鼠 在2个月大时出现腹股沟疝，性状明显。
以上表明，构建的转基因FVB/N鼠模型的发病率远不如转基因C57BL/6鼠，而 且转基因FVB/N鼠的膀胱出口梗阻的症状不明显。序列表
〈110〉中国农业大学
<120>构建膀胱出口梗阻动物模型的方法
<130〉CGGNARC92313
〈160>4
<210>1
<211> 1223bp
〈212〉DNA
<213〉人工序列
〈220〉 <223〉
<400>1
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〈212>脆
〈213>人工序列
<220> <223>
<400〉2
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〈210〉3<211〉 209bp
<212〉纖
〈213〉人工序列
〈220〉 <223〉
〈400〉
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<210〉4
<211〉 4156bp
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〈213〉人工序列
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<223〉
〈400〉4
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1、一种构建膀胱出口梗阻动物模型的方法，是向动物中转入芳香化酶编码基因，得到含有所述芳香化酶编码基因的动物作为膀胱出口梗阻动物模型。
2、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述向动物中转入芳香化酶编码 基因的方法包括如下步骤向离体的所述动物的受精卵中导入所述芳香化酶编码基 因，得到含有所述芳香化酶编码基因的受精卵，再将其通过非外科手术方法移入另 一所述动物的子宫中，产出含有所述芳香化酶编码基因的动物幼仔，即为所述膀胱 出口梗阻动物模型。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述芳香化酶编码基因是通 过表达盒转入的，所述表达盒是由启动子序列、芳香化酶编码基因序列和牛生长激 素基因的polyA信号序列按上游至下游的次序依次连接形成的。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述表达盒是通过重组载体导入的。
5、 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述芳香化酶编码基因为人芳香化酶编码基因。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述人芳香化酶编码基因为如 下a) 、 b)或c)所示的分子a) 序列表中序列2自5'末端起第7-2154位核苷酸所示的DNA分子；b) 在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码人芳香化酶的DNA分子；c) 与a)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且编码人芳香化酶的DNA 分子。
7、 根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述启动子为如下1)、 2)或3)所示的分子1) 序列表中序列l自5'末端起第7-1217位核苷酸所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3) 与l)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且具有相同功能的DNA分子。
8、 根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述牛生长激素polyA 信号的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
9、 根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述动物为fe，优选为C57BL/6小鼠。
10、 人芳香化酶编码基因在构建膀胱出口梗阻动物模型中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种构建膀胱出口梗阻动物模型的方法。该方法是向动物中转入芳香化酶编码基因，得到含有所述芳香化酶编码基因的动物作为膀胱出口梗阻动物模型。本发明模拟老年男性体内雌/雄激素比例升高的特点，利用转基因的方法使小鼠体内高表达雌激素，实现自发的产生膀胱出口梗阻。与现有的结扎法所产生的急性梗阻相比，本发明的动物模型产生的梗阻类似于人类的慢性进行性梗阻，能够确切的模拟病因，更加符合人类实际发病情况；与NO合酶(iNOS)缺陷的基因敲除小鼠模型相比，本发明模型的发病率更高，可达90％。因此，本发明的动物模型更加适合于对膀胱出口梗阻的病理分子机制的研究以及药物的筛选，具有重要意义。
文档编号C12N15/85GK101575613SQ200910086948
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者华 张, 李向东, 蔚 林 申请人:中国农业大学