专利名称：一株烟曲霉及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株烟曲霉及其应用。
背景技术：
鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要存在于小檗科鬼臼属及其近缘植物中，是一 类具有广泛生物学活性的天然化合物，有拟雌激素样、抗雌激素样、抗癌、抗病毒、
抗真菌、镇静、抑制植物生长和抗氧化等作用。特别是其具有较强的抗癌活性，其 作用机制是抑制微管蛋白的解聚作用以阻止细胞分裂以及抑制DNA拓扑异构酶的 活性。鬼臼毒素的糖苷衍生物etoposide和teniposide的毒性较低，对小细胞肺癌、 淋巴癌等多种肿瘤疾病均具有很好的疗效而成为临床应用的广谱抗肿瘤药物。
目前，鬼臼毒素主要是从野生鬼臼类植物的根茎中提取得到，而这类植物在全 世界仅有4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭、西藏等高海拔地区，其 生长缓慢，且鬼臼毒素类物质的含量较低。由于鬼臼毒素类物质在医学和农林防治 等方面具有广阔的应用前景，因而其需求量日益增加；对野生鬼臼类植物资源的大
量采集，已使其资源遭到严重破坏，造成生物多样性和生态环境的不可逆的损失， 因此解决鬼臼毒素类物质的来源问题具有重要意义。
由于植物生长环境复杂，难以模拟，且其生长周期长，很难进行大规模的人工 栽培，而组织培养技术对于鬼臼类植物也不适用；加之，鬼臼毒素类物质化学结构 复杂，化学合成虽可进行，但成本太高，而通过基因工程学手段构建工程菌也由于 参与形成该类物质的酶数量过多而无法进行。所以利用内生菌具有产生和宿主相同 或相似的生物活性物质的性质，来解决鬼臼毒素的来源问题，可能是唯一也是最有 效的方法。
近年来，已有学者利用内生菌具有产生和宿主相同或相似的生物活性物质的性 质，对我国特有的一些鬼臼类植物的内生菌进行了研究，已有从川八角莲、中华山 荷叶中分离到青霉属的内生菌，其培养物经层析分析具有与鬼臼毒素相同的Rf值 的报道(中华山荷叶内生真菌的分离及其发酵产生药用成分的初步研究，刘仕平、 曾松茸、郭仕平、杨春艳、张玲琪，中国药物与临床，2003.3 (3) : 227—228;川 八角莲内生真菌产鬼臼毒素类似物的初步研究，郭仕平、蒋斌、苏莹珍、刘仕平、张玲琪，生物技术，2004.14 (2) : 55-56.)。
此外，由于鬼臼类植物中还含有多种黄酮类化合物，因而其内生菌也可能产生 黄酮类化合物。许多研究证实，黄酮类化合物在人体中具有多种生物活性，包括抗 氧化、抗癌、防癌、清除自由基、抗病毒、消炎和促进血管舒张等。此外，异黄酮 (如染料木黄酮和羟基异黄酮)还具有雌激素特性。黄酮类化合物的多种生理作用， 使其在医药、食品等行业具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株烟曲霉。
本发明所提供的烟曲霉是从甘肃省漳县大草滩(海拔2700m)采集的植物桃儿 七(&'w; ocfo/ /zj;〃wm/zexflm/ram (7 o;;/e) J7"g)的根及根状茎中分离、筛选、纯化得 到的，根据其形态特征等证实属于半知菌纲、丛梗孢目、丛梗孢科、曲霉属，将其 命名为烟曲霄(T4s/ erg7'〃w^/^m/g"/2Ay) TEQA。烟曲雾(J5^erg///z^yi//wi^afus) TEQA 已于2009年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简 称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登 记号为CGMCCWe3115。
烟曲霉"^^gZ〃z^/wm/g^^) TEQA CGMCC処3115在PDA琼脂培养上生 长迅速、菌落中心稍凸起、无辐射状皱纹；菌落质地丝绒状到絮状；分生孢子结构 大量，中部多、边缘少，近于带灰的橄榄绿或海狸灰；无渗出液；轻霉味；菌落反 面黄褐色或带绿的淡黄色。
分生孢子头幼时球形或半球形，成熟时呈致密的圆柱状，150-350微米或更长； 分生孢子梗发生于基质，少量发生于气生菌丝，通常前者的孢梗茎较长，后者的较 短，上部带不同程度的绿色并逐渐膨大形成顶囊，壁平滑；顶囊烧瓶状，直径20-30 微米，但少数小顶囊的直径仅有6.5-15微米，约1/2至lj3/4的表面可育，呈不同程 度的绿色或浅灰绿色；产孢结构单层，瓶梗5-8X2-2.5微米，近于平行；分生孢子 球形或近球形，直径2.5-3微米或稍大，壁稍粗糙。
综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》等资料，上述分离得 到的菌株具有烟曲霉的基本特征，将其鉴定为烟曲霉(A^^7/^/謂^to)。
本发明的另一个目的是提供一种制备鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素双葡萄糖苷和 /或黄芪苷的方法。
本发明所提供的制备鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷的方法，是发酵培养上述烟曲霉(A;^g/〃船/wm^ ftw) TEQACGMCCWs3115，得到 鬼臼毒素(podophyllotoxin)禾n/或表鬼臼毒素双葡萄糖苷(L-picropodophillotpxin 7'-0-( 0 -D-glucopyranosyl-(l—6)- P -D-glucopyranoside)禾口/或黄度苷(Astragalin)。
鬼臼毒素的结构式如式i所示，表鬼臼毒素双葡萄糖苷的结构式如式n所示， 黄芪苷的结构式如式m所示
<formula>formula see original document page 5</formula>
上述方法中，所述发酵培养的培养基包括马铃薯葡萄糖培养基。
所述培养条件为26-30°C 、 100-150rpm振荡培养5-9天，具体可为28°C 、 120rpm 振荡培养7天。
烟曲霉(A/^g/〃ws/Mm/gaft^) TEQA CGMCC ]^3115在制备鬼臼毒素和/或 表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的烟曲霉"werg/〃M/wm/ga^s) TEQA CGMCC JYs 3115具有产生与桃 儿七相同的鬼臼毒素、表鬼臼毒素双葡萄糖苷以及黄酮类物质黄芪苷的生理特性， 可用于鬼臼毒素类物质及黄度苷的制备；本发明的制备鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素 双葡萄糖苷和/或黄芪苷的方法，发酵条件简单、菌种易培养、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力；对鬼臼毒素类物质的资源开发提供了新途径，对保护
植物生态多样性具有重要意义。
图1为烟曲霉(^perg/Z/ws/wm^m^) TEQACGMCC W2 3115的菌落形态 图2为烟曲霉(^perg/〃ws/mm'gafws) TEQA CGMCC JVs 3115分生孢子头形态 图3为鬼臼毒素标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=60: 40) 图4为表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=60:
40)
图5为黄芪苷标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=60: 40) 图6为烟曲霉(v4^erg/〃^7W^"^y) TEQA CGMCC W 3115发酵液的氯仿提 取物的HPLC谱图
图7为表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=50:
50)
图8为烟曲霉C^perg/〃w/Mm/gato) TEQA CGMCC Ws 3115发酵液的正丁醇 提取物的HPLC谱图
具体实施例方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、烟曲霉(^^rg/〃M>y>m/gfl<to) TEQA CGMCC3115的分离及鉴
定
将采集自甘肃省漳县大草滩(海拔2700m)的植物桃儿七(&力o;w^^/z;/〃Mm /2ex朋Aww f7 o;;/^ 7z力g)的根及根状茎分别用自来水洗净，在超净工作台中用75% 体积百分含量的乙醇处理5min，然后无菌水冲洗3-5次；而后再用2.5%质量百分含 量的次氯酸钠处理10min，再无菌水冲洗3-5次。用灭菌的镊子和刀片将桃儿七的根 的外皮剥去，再切成0.5cmX0.5cm大小的小片种植于PDA固体培养基上，28"C培养 3-7天。同时将同样灭菌处理过的桃儿七的根不做剥皮及切割，将桃儿七的根在PDA 培养基上滚动一周后，同条件培养作为对照观察。
培养几天后发现在桃儿七的根的切口处有菌丝长出，取切口处新长出的菌丝， 转接到新鲜的PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异 及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，挑取单菌落作进一步研究。
将上述分离得到的单菌落接种至PDA培养基上，当细胞生长至对数生长后期， 菌落大小稳定后，进行单菌落平均状态的描述。结果表明，上述分离得到的菌株 TEQA在PDA培养基上生长迅速，菌落中心稍凸起，无辐射状皱纹；菌落质地丝 绒状到絮状，具体的菌落形态如图1所示。
分生孢子结构大量，中部多、边缘少，近于带灰的橄榄绿或海狸灰；无渗出液; 轻霉味；菌落反面黄褐色或带绿的淡黄色。分生孢子头幼时球形或半球形，成熟时 呈致密的圆柱状，150-350微米或更长；分生孢子梗发生于基质，少量发生于气生
菌丝，通常前者的孢梗茎较长，后者的较短，上部带不同程度的绿色并逐渐膨大形
成顶囊，壁平滑；顶囊烧瓶状，直径20-30微米，但少数小顶囊的直径仅有6.5-15 微米，约l/2到3/4的表面可育，呈不同程度的绿色或浅灰绿色；产孢结构单层， 瓶梗5-8X2-2.5微米，近于平行；分生孢子球形或近球形，直径2.5-3微米，或稍 大，壁稍粗糙。上述筛选得到的菌株的分生孢子头形态如图2所示。其中，A为10x40 倍放大倍数下的分生孢子头形态，B为10x100倍放大倍数下的分生孢子头形态。
综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》等资料，上述分离得 到的菌株具有烟曲霉的基本特征，将其鉴定为烟曲霉(^t7e/^K廳扭to)，其 分类属于半知菌纲、丛梗孢目、丛梗孢科、曲霉属。烟曲霉(A^e^7/w/wmZg"to) TEQA已于2009年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)， 保藏登记号为CGMCCW2 3115。
实施例2、利用烟曲霉(^perg/〃附/wm/ga^;y) TEQA CGMCC W 3115制备鬼 臼毒素、表鬼臼毒素双葡萄糖苷和黄丧苷
马铃薯葡萄糖液体培养基的组成为去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，加水定容 至1000mL。
配制方法如下将马铃薯去皮，切成约2ci^的小块，放入烧杯中煮沸30min， 然后用双层纱布过滤，取滤液加入葡萄糖，再补足水，pH自然。
将100ml制备好的马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中，灭菌备用。 挑取上述实施例1筛选得到的烟曲霉(A^erg/〃^/Mm/g加w)TEQA CGMCC Ws 3115 的单菌落接种于上述灭菌好的马铃薯葡萄糖液体培养基中，28°C、 120r/min摇床培 养7天。用抽滤器将上述发酵液抽滤两次，分别收集菌丝体与发酵液。将发酵液先后用 等体积的氯仿和正丁醇萃取，随时取萃取液于紫外吸收检测器下检测，直至萃取液 在紫外吸收检测器下无荧光，合并萃取液，减压蒸馏回收，分别得到发酵液的氯仿 提取物和正丁醇提取物。
将上述获得的发酵液的氯仿提取物和正丁醇提取物分别采用高效液相色谱法
(HPLC)进行检测。同时以鬼臼毒素标准品(购自中国药品生物制品检定所)、 表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品(Changqi ZHAO, Akito NAGATSU, Keiichiro HATANO， Naohiro SHIRAI, Setsuko KATO, and Yukio OGIHARA ， New Lignan Glycosides from Chinese Medicinal Plant: Sinopodophillum emodi ， CT em. /Vwrm. 51 (3):55-261(2003))和黄芪苷标准品(购自中国药品生物制品检定所)作为对照， 具体的检测方法如下-
高效液相色谱仪AglientllOO型；
色谱柱Aglient 1100 Eclipse XDB-C18 (5|im， 4.6x150mm); 检测器紫外检测器；检测波长254nm;
色谱条件流动相甲醇水=60: 40 (用于发酵液氯仿提取物的HPLC分析)；
甲醇水=50: 50(用于发酵液正丁醇提取物的HPLC分析)；
流速0.5ml/min; 进样量5^1; 柱温室温；
标准品鬼臼毒素、表鬼臼毒素双葡萄糖苷、黄底苷。 检测前，将鬼臼毒素标准品、表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品和黄芪苷标准品以 及上述烟曲霉(Aperg///w/i^/gflft ) TEQACGMCC地3115发酵液的氯仿提取物 和正丁醇提取物分别用甲醇充分溶解，0.45pm微孔滤膜过滤，采用外标法对上述发 酵液进行HPLC分析，每个样品至少重复三次。实验设三次重复，结果如图3-8所 示。其中，图3为鬼臼毒素标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=60: 40)， 图4为表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=60: 40)， 图5为黄芪苷标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=60: 40)，图6为烟曲霉 /w仿/g"加力TEQA CGMCC W 3115发酵液的氯仿提取物的HPLC谱图， 图7为表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的HPLC谱图(流动相，甲醇水=50: 50)， 图8为烟曲霉(v4^e/^〃站/wm/g"加)TEQA CGMCC Ws 3115发酵液的正丁醇提取物的HPLC谱图。
将烟曲霉(A;^g/〃^/Mm/gfl^y) TEQACGMCC W 3115发酵液的氯仿提取物和 正丁醇提取物的HPLC谱图分别与鬼臼毒素标准品、表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品 和黄芪苷标准品的HPLC谱图进行比对。
结果表明，在保留时间为8.276分钟时，发酵液的氯仿提取物具有吸收峰，而鬼 臼毒素标准品在8.336分钟时具有吸收峰，说明发酵液的氯仿提取物中含有鬼臼毒 素；在保留时间为3.402分钟时，发酵液的氯仿提取物具有吸收峰，而表鬼臼毒素 双葡萄糖苷标准品在3.400分钟时具有吸收峰，说明发酵液的氯仿提取物中含有表 鬼臼毒素双葡萄糖苷；在保留时间为4.879分钟时，发酵液的氯仿提取物具有吸收 峰，而黄芪苷标准品在4.965分钟时具有吸收峰，说明发酵液的氯仿提取物中含有 黄芪苷。而且，在保留时间为4.962分钟时，发酵液的正丁醇提取物具有吸收峰， 而表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品在4.854分钟时具有吸收峰，说明发酵液经氯仿萃 取后再经正丁醇萃取，提取物中含有表鬼臼毒素双葡萄糖苷。以上结果表明，发酵 液的氯仿提取物中含有鬼臼毒素、表鬼臼毒素双葡萄糖苷和黄芪苷这三种化合物； 而发酵液经氯仿萃取后再经正丁醇萃取，提取物中只含有表鬼臼毒素双葡萄糖苷。
权利要求
1、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA，其保藏登记号为CGMCC № 3115。
2、 烟曲霉C4^er^7/us/wm/gflft^) TEQA CGMCC Ws 3115在制备鬼臼毒素和/ 或表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷中的应用。
3、 一种制备鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄度苷的方法，是发 酵培养权利要求1所述烟曲霉C4werg/〃us/wm/g^^) TEQA CGMCC 3115 ，得 到鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养基为马铃 薯葡萄糖培养基。
5、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵培养的条件为 26-30。C、 100-150rpm振荡培养5-9天。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养的条件为28°C、 120rpm振荡培养7天。
7、 根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括将发 酵液进行萃取的步骤。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述萃取的萃取剂为氯仿或正 丁醇。
全文摘要
本发明公开了一株可产生鬼臼毒素、表鬼臼毒素双葡萄糖苷和黄芪苷的烟曲霉及其应用。本发明的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC № 3115具有产生与桃儿七相同的鬼臼毒素、表鬼臼毒素双葡萄糖苷以及黄酮类物质黄芪苷的生理特性，可用于鬼臼毒素类物质及黄芪苷的制备；本发明的制备鬼臼毒素、表鬼臼毒素双葡萄糖苷和黄芪苷的方法，发酵条件简单、菌种易培养、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力；对鬼臼毒素类物质的资源开发提供了新途径，对保护植物生态多样性具有重要意义。
文档编号C12P19/00GK101575576SQ200910086919
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月18日 优先权日2009年6月18日
发明者朱妍妍, 嫦 艾, 栗 贾, 赵长琦 申请人:北京师范大学