专利名称：一种黄粉虫纤溶酶及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，本发明从黄粉虫中提取一种纤溶酶，并且涉及这种纤溶酶
的制备方法，含有这种纤溶酶的组合物，以及这种纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的用途。
背景技术：
目前，由于各种原因引起的血液栓塞疾病，如脑血栓、心肌梗塞、冠心病、肢体血管栓塞等的发病率呈上升趋势；仅我国每年用于防治和康复等方面的费用高达数千亿元人民币，此类疾病严重危害了患者的生存质量，增加了患者家庭及社会的负担。因而，针对此类疾病的临床用药的研究开发也进展迅速；临床上较为常用的治疗方法是突击性溶栓疗法，常见的药物有尿激酶，降纤酶等。此类药物必须在患者发病后六小时内用药，药物通过激活纤溶酶原使之成为纤溶酶，后者裂解血栓中的纤维蛋白，使血栓溶解，血管再通，从而特效抢救急性心肌梗塞、脑梗塞等血栓性疾病的患者，显著降低病死率，提高患者病后的生活质量，避免因缺血造成的不可逆性的半暗带死亡，从而不给患者留下后遗症。这就要求溶栓物具有高效的溶解血栓的作用，同时无毒副作用。 目前，国内上市或在研的溶栓药物很多，从原料来源上有，基因重组产品如重组链激酶、重组水蛭素、t-PA等。生物工程产品如葡激酶、纳豆激酶等。生化药品如尿激酶、降纤酶、蛇毒纤溶酶、蚓激酶等。 从药理学特点上，可分为三代第一代制剂如链激酶(SK)、尿激酶(UK)等，主要特点是引起全身纤溶活性提高而增加出血的危险，但费用较低，应用广泛。第二代制剂如重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)和重组链激酶(r-SK)等，其主要特点是选择性溶栓，对全身纤溶活性影响较少，但其半衰期短，价格昂贵。如rt-PA能特异地溶解血栓而出现系统性纤溶状态，但它进入血浆后易与纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)形成复合物而迅速失活，半衰期仅8min，故治疗剂量大，费用昂贵，且其颅内出血发生率比其他溶栓药高，限制了它的应用。第三代溶栓药是指正在开发或研制的溶栓药。随着分子生物学技术和结构生物学的发展，t-PA的各个特定结构域与其各种生物学活性之间的关系得以阐明，结构域中的指形区(F)和Kringle2(K2)结构域与t-PA与纤溶蛋白的亲合力有关。EGF是含肝细胞膜识别t-PA的受体结构，与t-PA代谢有关；Lys296-His-Arg-Arg299带正电荷序列是t-PA与PAI相结合的位点。 因此，正在研发的第三代溶栓药绝大多数为t-PA变异体，如TNK-t-PA、Ret印lase、 Mont印lase、 Canot印lase等。它们都是根据t-PA构效关系，利用分子生物学技术对t-PA进行一系列结构改造，而得到的突变体。这些突变体许多性能都优于野生的t-PA，如半衰期延长了，有一定的抗PAI抑制作用，如改造而得的Ret印lase其半衰期从8min延长到18min，已取得相当不错的进步，但与离理想的溶栓药还有较大的距离。因此，人们又把研究的热点转向其他来源的纤溶酶原激活剂上来，如纳豆激酶(NK)、吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(bat-PA)和蛇毒纤溶酶原激活剂等。至今仍未见到有关于黄粉虫纤溶酶的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种来自黄粉虫的分子量为56. lkD的单一组分的纤溶酶。 本发明的另一个目的是提供一种纤溶酶的制备方法。 本发明的另一个目的是提供含有所述纤溶酶的溶栓药物组合物。 本发明的再一个目的是提供所述纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的用途。 本发明的一种纤溶酶的制备方法是这样实现的1)将黄粉虫洗净，称取黄粉虫加入磷酸钠缓冲液，研磨至糜状，4t:浸提过夜； 2)离心去沉淀，上清液加固体硫酸铵分段盐析，取30% 70%饱和度盐析组分透析浓縮，得到粗提液； 3)将粗提液过二乙氨基乙基-纤维素32(DEAE-纤维素32)离子交换层析柱纯化，用Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集高丰度蛋白峰。 收集高丰度蛋白峰使用分部收集器收集，每管收集5. OmL，UV mini-1240型紫外可见分光光度计测0D280nm值。对各个蛋白质峰做纤溶检测实验，将纤溶活性峰组分收集并浓縮，得到较纯品。 较纯品经S印hadex-G75柱纯化，洗脱液洗脱。收集活性峰，冻干备用。层析过程分别用UV mini-1240型紫外可见分光光度计和纤溶平板法测定0D280值和纤溶活性。
所述黄粉虫的重量与缓冲液的体积之比是l : 5。所述缓冲液是0. 02mol/L pH7. 4 8. 5的磷酸钠(Na2HP04_NaH2P04)溶液。
所述步骤2)中在上清液中加固体硫酸铵达30X饱和度，8500转/分，4t:离心泵中离心，收集上清液；再加入固体硫酸铵达70%饱和度，8500转/分，4。C离心泵中离心，收集沉淀。所述步骤3)中洗脱缓冲液是含有0 lmol/L氯化钠(NaCl)的0. 02mol/LpH8. 0
的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)。 含有所述纤溶酶的溶栓药物组合物。 所述纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的应用。 本发明的有益效果是 本发明涉及的黄粉虫纤溶酶是黄粉虫体内一种单组分蛋白水解酶，分子量在56. lkD的纤溶酶，易于纯化和批量制备，并且纤溶活性强，比活高，无毒性；分子量小、抗原反应低，是较为理想的纤溶酶制剂原料，是理想的溶栓药物。
图1， SDS-PAGE测定黄粉虫纤溶酶的分子量。 图2，尿激酶标准图，该图方程式为y = 2. 173x+0. 0527，方差R2 = 0. 9848。
具体实施例方式
下面实施例详细说明本发明，但是这些实施例不在任何方面限制本发明的范围。
实施例1 :黄粉虫纤溶酶的制备。
材料黄粉虫(产地中国)
制备1、粗提液的制备 称取10g黄粉虫，剪碎，按1 : 5 (重量体积)的比例加入50mL预冷的0. 02mol/ L磷酸钠缓冲液(pH7.4 8. 5)，研磨至糜状，4t:浸提过夜。将浸提液在8500转/分，4°C的 离心泵中离心15min，收集上清液；在上清液中加固体硫酸铵达30%饱和度，8500转/分， 4t:离心泵中离心，收集上清液；再加入固体硫酸铵达70%饱和度，8500转/分，4t:离心泵 中离心，收集沉淀进行透析浓縮，得到粗提液。
2、离子交换层析 预先用0. 02mol/L pH8. 0 Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-纤维素32离子交换层析柱， 将粗提液吸入到层析柱中，用含0 lmol/L NaCl的0. 02mol/L pH 8. 0 Tris-HCl缓冲液 梯度洗脱，流速O. 7mL/min，分部收集器收集，每管收集5. 0mL，UV mini-1240型紫外可见分 光光度计测0D280nm值，收集合并活性峰，透析浓縮，得到较纯品。
3、分子筛层析 选用S印hadex-G75柱将较纯品再进行层析，用0. 02mol/L pH8. 0 Tris-HCl缓冲 液洗脱，流速为0. 5mL/min，每管收集3mL， UV mini_1240型紫外可见分光光度计测0D280nm 值，收集合并活性峰，冻干得到纯品，备用。
4、电泳 将纯品做电泳，使用十二烷基磺酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，胶浓度 是12%。结果为一条蛋白带，分子量为56. lkD，(如图l所示)具有纤溶活性。此为本发 明的纤溶酶。 实施例2 :本发明纤溶酶生物活性的测定。 纤溶酶活性的测定方法是本领域技术人员公知的。因纤溶平板法灵敏度高且既可 定性又可定量，故本研究采用纤溶平板法，具体做法如下 试剂牛血纤维蛋白原溶液浓度10mg/mL。牛血纤维蛋白原为Sigma公司产品。 牛凝血酶浓度100U/mL。牛凝血酶为Sigma公司产品。 操作 1、纤溶平板的制备 先配制O. 8%的琼脂糖10ml，煮沸，冷却至45 55。C，加入10mg/ml的牛血纤维蛋 白原0. 25ml及100U/ml的凝血酶0. 025ml，迅速摇匀，倒入直径9cm的培养皿中，盖上玻璃 盖，冷却凝固(大概5分钟)后转移到4t:冰箱保存半小时。
2、纤溶活性的测定 用0. 2ml枪头在制备好的纤维蛋白凝胶板上打孔，注意孔间距离，每孔加样品20 微升。以尿激酶为标准品，置37t:培养箱保温18-24h后观察结果。有纤溶活性会在样品孔 周围出现清晰透明的纤维蛋白溶解圈。用考马斯亮蓝R-250染色，测量溶圈两垂直直径，以 尿激酶为标准品，PBS液做空白对照在纤维蛋白平板上，以尿激酶标准系列做纤溶活性标准 曲线，以两垂直直径之积制作标准曲线。计算样品的纤溶活性时将样品的纤溶圈大小对照 标准曲线换算成尿激酶单位即可。经检测，每毫克黄粉虫纤溶酶相当于98. 03尿激酶国际 标准活力单位。
实施例3 :含有本发明纤溶酶的药物组合物的制备。 取本发明纤溶酶50微克，溶解于5毫升蒸馏水中。密封，常温下放置。
权利要求
一种来自黄粉虫的分子量为56.1千道尔顿(kD)的纤溶酶。
2. 权利要求1的纤溶酶的制备方法，其特征在于有如下步骤1) 将黄粉虫洗净，称取黄粉虫加入磷酸钠缓冲液，研磨至糜状，4t:浸提过夜；2) 离心去沉淀，上清液加固体硫酸铵分段盐析，取30% 70%饱和度盐析组分透析浓 縮，得到粗提液；3) 将粗提液过二乙氨基乙基-纤维素32(DEAE-纤维素32)离子交换层析柱纯化，用 Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集高丰度蛋白峰。
3. 根据权利要求2的纤溶酶的制备方法，其特征在于所述黄粉虫的重量与缓冲液的 体积之比是l : 5。
4. 根据权利要求2的纤溶酶的制备方法，其特征在于所述缓冲液是0.02mol/L pH7. 4 8. 5的磷酸钠(Na2HP04-NaH2P04)溶液。
5. 根据权利要求2的纤溶酶的制备方法，其特征在于所述步骤2)中在上清液中加固 体硫酸铵达30 %饱和度，8500转/分，4°C离心泵中离心，收集上清液；再加入固体硫酸铵达 70%饱和度，8500转/分，4t:离心泵中离心，收集沉淀。
6. 根据权利要求2的纤溶酶的制备方法，其特征在于所述步骤3)中洗脱缓冲液是含 有0 lmol/L氯化钠(NaCl)的0. 02mol/LpH8. 0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)。
7. 含有权利要求l所述纤溶酶的溶栓药物组合物。
8. 权利要求l的纤溶酶在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黄粉虫纤溶酶及其制备方法与应用，该纤溶酶是从黄粉虫中提取，其分子量为56.1千道尔顿，还涉及到黄粉虫纤溶酶的制备方法，以及这种纤溶酶在制备治疗血液栓塞的药物中的用途；该制备方法是首先将黄粉虫洗净，称取黄粉虫加入磷酸钠缓冲液，研磨至糜状，4℃浸提过夜；离心去沉淀，上清液加固体硫酸铵分段盐析，取30％～70％饱和度盐析组分透析浓缩，得到粗提液；将粗提液过二乙氨基乙基-纤维素32离子交换层析柱纯化，用Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集高丰度蛋白峰；本发明涉及的纤溶酶易于纯化和批量制备，并且纤溶活性强，比活高，无毒性；分子量小、抗原反应低，是较为理想的纤溶酶制剂原料，是理想的溶栓药物。
文档编号C12N9/68GK101693888SQ20091019313
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者谭竹均, 陈雅雄, 韩雅莉, 黄锦兵 申请人:广东工业大学;