专利名称：一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及作物抗病品种的鉴定方法，尤其涉及十字花科作物抗病品种的鉴定方法。
背景技术：
十字花科蔬菜黑腐病的病原菌为十字花科黑腐病菌0(CC， Xanthomonascampestris pv. campestris)，也称野油菜黄单胞菌野油菜致病变种。十字花 科蔬菜黑腐病主要发生在大白菜、萝卜、菜心、芥菜、绿菜花、白菜花、苤蓝及油菜等十字花 科蔬菜作物上，近几年来发病有逐渐加重的趋势，降低了该类蔬菜的产量和品质，造成很大 的经济损失。种植作物的抗病品种是对付作物病害的有效措施之一，而鉴定作物抗病品种 资源则是抗病育种的基础。生物性病原最主要的是真菌，其次是病毒、细菌、线虫、类菌原体、放线菌以及寄生 性种子植物等。这些病原生物多数为寄生性微生物，常统称为病原物；其中真菌和细菌性病 原又称为病菌，被病原物寄生的植物称为寄主植物，简称寄主。病原菌群对寄主植物有致病性分化现象是指，同种病原物内的不同群体对不同分 类单元的寄主植物的致病性不同。病原物的无毒基因是指病原物遗传因子，其编码的产物激发病原物与植物特异性 相互作用。无毒基因是决定对寄主植物特异性不亲和的基因，农杆菌在植物体内瞬间表达 无毒基因，可引起依赖于寄主抗病基因的过敏反应。寄主抗病基因是经典遗传学基因对基 因(gene-for-gene)假说中所指的与病原物无毒基因相对应的存在于植物特定品种中且 在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。十字花科黑腐病菌群对寄主植物有明显的致病性分化现象，其主要原因之一就是 病菌不同菌株无毒基因的种类或组成的差异，以及对应的寄主抗病基因的变化。以往，鉴定作物抗病品种的方法是这样的从寄主植物的破口处接种上病原物，对 该该寄主植物经过一段时间进行观察，如果未产生相应的病害，则说明该寄主植物为抗病 品种，反之，则说明该寄主植物为非抗病品种。这种方法的缺点是其需要花费的时间较长， 已经不适应日益发展的农业现代化生产和建设的需要。参考文献[ 1 ] Keen NT. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions. Annu RevGenet, 1990, 24 :447-463.[2]Bai J, Choi S-H, Ponciano G, Leung H, and Leach JE. Xanthomonas oryzae pv.oryzaeavirulence genes contribute differently and specifically to pathogen aggressiveness. MolPlant-Microbe Interact. ,2000,13 :1322-1329.[3]ffhite FF. Prospects for understanding avirulence gene function. Curr· Opin. Plant Biol，2000，3 :291-298.[4]Heesemann, J. Algermissen, B. and Laufs, R. Genetically manipulatedvirulence of Yersiniaenterocolitica. Infect. Immun,1984,46 :105-110.[5]Dangle JL.The enigmatic avirulence genes of phytopathogenic bacteria. Curr TopMicrobiol Immunol,1994,192 :99-118.[6]Vivian A and Gibbon MJ. Avirulence genes in plant-pathogenic bacteria signals orweapons. Microbiology, 1997,143 :693-704.[7] Cornells GR, Van Gijsegem F. Assembly and function of type III secretory systems. Annu. Rev. Microbiol, 2000, 54 :735-774.[8]Fenselau S, Balbo I, and Bonas U. Determinants of pathogenicity in Xanthomonascampestris pv. vesicatoria are related to proteins involved in secretion in bacterialpathogens of animals. Mol Plant-Microbe Interact,1992,5 390-396.[9]Kim MG, Geng X, Lee SY, Mackev D. The Pseudomonas syringae type III effectorAvrRpml induces significant defenses by activating the Arabidopsis nucleotide-bindingleucine-rich repeat protein RPS2. Plant J,2009,57(4) :645-653.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法，能够 快速地鉴定出十字花科作物抗病品种。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法， 包括找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中的无毒基因；用所述8004菌株基因组中的无毒基因构建系列的鉴别菌株；将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到十字花科应试寄主叶片脉间，并检 测应试寄主的过敏反应。优选地，若在应试寄主上检测到过敏反应，则表明该应试寄主对无毒基因发生了识别作 用，提示该寄主具有针对该无毒基因的抗病基因。优选地，找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中的无毒基因，具体包括在十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中搜索已注释的无毒基因，并验证的新的 无毒基因的编码区。优选地，用8004菌株基因组中的无毒基因构建鉴别菌株，具体包括分别扩增所有找出的无毒基因全长序列作为候选基因，并将候选基因克隆于表达 双元载体PBI121中，构建含有所述无毒基因的表达载体；通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因的表达载体导入根癌农杆菌EHA105 菌株中，构建系列的鉴别菌株。优选地，将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到十字花科应试寄主叶片脉 间，具体包括分别将鉴别菌株在根癌农杆菌培养基YEB中，于培养对小时，离心收集菌体， 再用无菌水稀释成0D_ = 1. O的菌体悬液；
用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液约10微升，从十字花科寄主的叶背注渗 入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的十字花科寄主置于28。C及80%湿度的环境 中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察48小时。优选地，检测应试寄主的过敏反应，具体包括在十字花科寄主上以十字花科黑腐病菌野生型kc 8004作阳性对照，以含有 PBI121的EHA105菌株作阴性对照，观察若十字花科寄主上产生含无毒基因表达载体的鉴 别菌株的过敏反应，则确认十字花科寄主相对所述无毒基因的抗病品种。采用本发明的对十字花科作物抗病品种进行鉴定的方法，不仅能够快速地鉴定出 十字花科作物抗病品种，而且能提供十字花科作物抗病基因的相关信息，为快速分离、克隆 抗病基因奠定了基础，这无疑对十字花科作物抗病育种以及提高十字花科类蔬菜的产量和 品质具有显著的不可估量的意义。
图1为PCR克隆XC_0542基因的电泳图谱；图2为pBI0542表达载体的酶切电泳图谱；图3为EHA105中pBI0542的PCR验证电泳图谱；图4为EHA105/pBI0542菌株在椰菜花上的HR反应。
具体实施例方式本发明提供的十字花科作物抗病品种的鉴定方法基于农杆菌注渗法，其发明构思 是，利用无毒基因可引起依赖于寄主抗病基因的过敏反应这一特性，通过找出十字花科黑 腐病菌群无毒基因，检验出寄主植物抗病基因的存在，由此能够快速地鉴定出十字花科作 物抗病品种。本发明完成kc 8004菌株全基因组测序后，在全基因组水平注释了 8个无毒基 因，并用实验证明了 2个新的无毒基因，用这10个无毒基因构建了一系列鉴别菌株，通过农 杆菌介导瞬时表达的方法快速鉴定抗性寄主。分别将候选基因全长片段克隆到双元载体 PBI121上，然后通过三亲接合法导入根癌农杆菌EHA105菌株中构建鉴别菌株。用无针头注 射器分别将这些带有不同效应物基因或无毒基因的农杆菌悬液注渗到寄主叶片脉间，检测 过敏反应。若能引起过敏反应，就表明应试寄主植物对这个无毒基因发生了识别作用，提示 该寄主植物具有针对该无毒基因的抗病基因。其具体操作方法如下(1)在十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中搜索已注释的无毒基因和验证的新 的无毒基因的编码区；该)(cc8004 菌株全基因组信息(NC_007086. 1)已公布在 NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information)白勺 GenBank 数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genbank/index. html)，这些无毒基因的基因序号和GenBank的GeneID号分别为XC_0052(GeneID :3382689)，XC_0542(GeneID :3381550)，XC_1553 (GeneID 3380160)， XC_1716(GeneID :3380265), XC_2004(GeneID :3380545), XC_2602(GeneID 3381136)，XC_2081 (GeneID :3380621)，XC_2082(GeneID :3380622)，XC_3802(GeneID 3379421)，XC_4318(GeneID :3379936)。(2)采用PCR方法，分别扩增上述无毒基因，并克隆于表达载体pBI121中，构建含 有无毒基因的表达载体；(3)分别将含有无毒基因的表达载体导入根癌农杆菌中，构建鉴别菌株；(4)分别将鉴别菌株在根癌农杆菌培养基YEB中，于培养M小时，离心收集 菌体，再用无菌水稀释成0D_ = 1. 0的菌体悬液；(5)用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液约10微升，从十字花科植物的叶背 注渗入叶脉间；接种后的植物在^°C，80%湿度的环境中，交替进行连续光照1 及连续黑 暗他，共观察48小时；若引起了过敏反应(如图4A-2所示)，就表明应试寄主植物对这个无毒基因发生 了识别作用，提示该寄主植物具有针对该无毒基因的抗病基因。下面以无毒基因中之一 XC_0542基因(GeneID :3381550)为例，进行更详细地说明。实施例1XC_0542基因的克隆并构建表达载体pBI0M2根据XC_0542的基因序列，设计引物正向引物F，5‘ -GGGTCTAGAATGGAGATCAAGAAAGCGCAGTCC-3 ‘，反向引物R，5‘ -GGGGGATCCTCAGCCGGAGCGCGGCGGGTC-3 ‘。以十字花科黑腐病菌总DNA为模板，PCR扩增该基因全长序列，并将其克隆至 PBI121中，构建表达载体pBI0542并酶切验证，请参见图1。序列被亚克隆于pK18mob中， 并进行了测序验证，该序列与XC_0542基因(GeneID :3381550)序列一致。图1为PCR克隆XC_0542基因的电泳图谱，M :0321标准DNA (片段大小从大到小 依次为3kb，2kb, 1. 5kb, 1. 2kb, 1. Okb，0. 9kb,0. 8kb,0. 7kb,0. 6kb,0. 5kb,0. 4kb,0. 3kb, 0. 2kb，0. lkb，)；泳道1 :PCR克隆XC_0542基因的片段。实施例2、将表达载体pBI0542导入农杆菌将pBI0542三亲导入根癌农杆菌EHA105中，将得到的三亲接合子命名为EHA105/ PBI0M2，三亲接合子PCR验证，请参见图2和图3。图2为pBI0542表达载体的酶切电泳图谱，M :0321标准DNA(片段大小从大到小 依次为3kb，2kb, 1. 5kb, 1. 2kb, 1. Okb，0. 9kb,0. 8kb,0. 7kb,0. 6kb,0. 5kb,0. 4kb,0. 3kb, 0. 2kb，0. lkb,)；泳道1 基因克隆pBI0542用Xbal/BamHI的酶切片段。图3为EHA105中pBI0 2的PCR验证电泳图谱，M:0321标准DNA(片段大小从大到 小依次为:3kb, 2kb, 1. 5kb, 1. 2kb, 1. Okb，0. 9kb，0. 8kb，0. 7kb，0. 6kb，0. 5kb，0. 4kb，0. 3kb, 0. 2kb，0. lkb,)；泳道 1 :EHA105 中 pBI0542 的 PCR 验证片段。实施例3农杆菌过敏反应(HR)试验所用的植物材料为椰菜花，A为抗病品种，B为感病品种。选取健康的椰菜花全展 叶片供试。(1)接种农杆菌至加有相应抗生素的LB培养基过夜培养。(2) OD600 为 0. 4 0. 5 时收集 ImL 的菌液于 1. 5mL 的 EP 管，5000rpm 离心 5min,倒
6掉上清液，用2mL诱导培养基(IOmM MgCl2, 5mM MESpH5. 6，150 μ M AS)重悬，28°C诱导培养 5h。(3)用诱导培养基调OD6tltl至0. 4 0. 5，以十字花科黑腐病菌野生型)Ccc 8004作 阳性对照(如图4中Al和Bi)，EHA105/pBI121作阴性对照(如图4中A3和B3)。用无针 头的针筒吸取菌液注渗到辣椒苗叶片背面的叶肉中，形成一个可见的浸润斑。(4)将椰菜花放在，80%湿度的环境中，连续光照16h黑暗8h，交替进行，连续 观察48小时。EHA105/pBI0542农杆菌过敏反应试验请参见图4A-2，是快速坏死斑，但病斑不 扩展，表明XC_0542基因在椰菜花A上能引起过敏反应，初步确认椰菜花A相对无毒基因 XC_0542的抗病品种。图4A-1是he 8004引起的HR反应，菌体同样不能在椰菜花A叶内扩 展；图4B-1结果表明)(cc 8004能在椰菜花B叶内扩展；图4B-2结果表明EHA105/pBI0M2 农杆菌不能引起椰菜花B产生HR反应。图4为EHA105/pBI0542菌株在椰菜花上的过敏HR反应，图中A抗病品种；B感病 品种。1为Xcc 8004阳性对照，2为EHA105/pBI0M2(意为含有pBI0542的EHA105菌株) HR反应，3为EHA105/pBI121(意为含有pBI121的EHA105菌株)阴性对照，4为无菌水。
权利要求
1.一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法，包括找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中的无毒基因；用所述8004菌株基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株；将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到十字花科应试寄主叶片脉间，并检测所 述应试寄主的过敏反应。
2.按照权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，若在所述应试寄主上检测到所述过敏反应，则表明所述应试寄主对所述无毒基因发生 了识别作用，提示所述寄主具有针对该无毒基因的抗病基因。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述找出十字花科黑腐病菌8004菌 株基因组中的无毒基因，具体包括在所述十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中搜索已注释的无毒基因，并验证的新的 无毒基因的编码区。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用所述8004菌株基因组中的所述无 毒基因构建鉴别菌株，具体包括分别扩增所有找出的所述无毒基因全长序列作为候选基因，并将所述候选基因克隆于 表达双元载体PBI121中，构建含有所述无毒基因的表达载体；通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因的表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株 中，构建所述系列的鉴别菌株。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液 注渗到十字花科应试寄主叶片脉间，具体包括分别将所述鉴别菌株在根癌农杆菌培养基YEB中，于培养M小时，离心收集菌体， 再用无菌水稀释成0D_ = 1. 0的菌体悬液；用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液约10微升，从所述十字花科寄主的叶背注渗 入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的所述十字花科寄主置于28。C及80%湿度的 环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察48小时。
6.按照权利要求4或5所述的方法，其特征在于，检测所述应试寄主的过敏反应，具体 包括在所述十字花科寄主上以十字花科黑腐病菌野生型)(cc 8004作阳性对照，以含有所 述PBI121的所述EHA105菌株作阴性对照，观察若所述十字花科奇主上产生含无毒基因表 达载体的鉴别菌株的过敏反应，则确认所述十字花科寄主相对所述无毒基因的抗病品种。
全文摘要
本发明披露了一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法，包括找出十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中的无毒基因；用所述8004菌株基因组中的无毒基因构建系列的鉴别菌株；将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到十字花科应试寄主叶片脉间，并检测应试寄主的过敏反应。本发明不仅能够快速地鉴定出十字花科作物抗病品种，而且能提供十字花科作物抗病基因的相关信息，为快速分离、克隆抗病基因奠定了基础，这无疑对十字花科作物抗病育种以及提高十字花科类蔬菜的产量和品质具有显著的不可估量的意义。
文档编号C12Q1/68GK102071248SQ200910223808
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者何勇强, 刘娇, 唐纪良, 姜伟, 姜伯乐, 岑卫健, 黄俊锭 申请人:广西大学