专利名称：一种控制植物生长的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种植物发育相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
植物的发育及形态由细胞的伸长，延展及分裂决定。其中植物细胞的伸长受外部环境因素及包括油菜素甾醇类激素在内的多种植物内源激素共同影响。而油菜素甾醇类激素对于植物最为明显的生理效应就是促进植物细胞的伸长，如BRs促进幼苗的茎、豌豆和绿豆的上胚轴、黄瓜下胚轴、单子叶植物的胚芽鞘、中胚轴等的伸长，而且幼嫩的营养器官对BRs的反应尤为明显。近年来随着一系列BR相关突变体的鉴定及分子遗传学及生物化学手段的研究，在拟南芥中BR信号转导途径已经比较清楚了。BRs可结合在BRI1的胞外域，激活BRI1的激酶域，使得BRI1与BAK1结合并相互磷酸化，同时与抑制因子BKI1解聚，活化的BRI1磷酸化BSKs，BSKs将BRs信号由受体复合物BRI1/BAK1传出，激活BSU1，BSU1通过去磷酸化使BIN2失活，去磷酸化的BZR1和BZR2积累，激活BR信号途径下游基因的表达，从而调控植物的生长发育。然而BR如何通过BZR1调控下游基因的表达从而调控细胞伸长，还有待进一步研究。因此克隆BR信号途径下游调控植物细胞伸长的基因，将成为调控植物细胞伸长从而控制植物发育及株型的重要分子工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物发育相关蛋白。
本发明提供的蛋白(AtIBH1)，来自拟南芥col生态型，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列3的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由其衍生的蛋白质；所述植物发育体现在成株株高和/或叶柄长度和/或下胚轴长度和/或特定器官的大小等性状上。
为了使(a)中的AtIBH1便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列 上述(b)中的AtIBH1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的AtIBH1的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白的编码基因(AtIBH1)可为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子 1)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子； 2)序列表中序列5的自’端第54-600位所示的DNA分子； 3)序列表中序列5所示的DNA分子； 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA分子； 5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有AtIBH1基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用AtIBH1构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为将所述AtIBH1基因插入pSN1301的多克隆位点得到的重组表达载体。
所述质粒pSN1301是将质粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位点间插入35S-Noster序列得到的；所述35S-Noster序列是用限制性内切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切质粒pUC19-35S-Noster得到的；所述质粒pUC19-35S-Noster是将质粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位点间插入35S启动子片段得到的；所述35S启动子片段是用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切质粒pBI221得到的；所述质粒pUC19-Noster是将质粒pUC19的SacI和EcoRI酶切位点间插入Noster poly A终止序列得到的；所述Noster poly A终止序列是用限制性内切酶Sac I和EcoR I双酶切质粒pBI221得到的。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法。
该方法是如下1)或2)的方法 1)将上述基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物为与所述目的植物相比株高变矮和/或叶柄缩短和/或下胚轴缩短和/或叶片变小的转基因植物； 2)在目的植物中将上述基因进行抑制表达，得到转基因植物，所述转基因植物的株型大小大于所述目的植物。该目的植物为含有上述AtIEH1基因的植物。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的AtIBH1基因导入植物细胞，可获得株高变矮和/或叶柄缩短和/或下胚轴缩短和/或叶片变小。携带有AtIBH1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可为双子叶植物，如拟南芥(Columbia拟南芥)。
上述方法1)中，上述基因可具体通过上述重组表达载体导入所述目的植物中。
上述方法2)中，抑制表达是将AtIBH1-RNAi导入目的植物中实现的； 所述AtIBH1-RNAi是将序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段正向插入pTCK309的Spe I和Sac I酶切位点间构成pTCK309-1，将序列表中序列5的白5’端第66-359位所示的片段反向插入pTCK309-1的BamH I和Kpn I酶切位点，构成AtIBH1-RNAi； 所述pTCK309的构建方法如下将序列表中序列6所示的片段插入pBluescriptII SK+的KpnI和SacI酶切位点之间，构成pTCK302；用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物从水稻(中花10号)基因组DNA中扩增出478bp的水稻内含子，连入pGEM-T(Promega)载体，构成重组T载体；以所述重组T载体为模板，用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’PCR扩增，扩增产物用Sal I和Cla I酶切并克隆到所述pTCK302载体中，构成的载体命名为pTCK302-1；用KpnI和Sacl酶切pTCK302-1得到小片段插入所述pSN1301的KpnI和Sacl酶切位点间，构成pTCK309。
上述目的植物为双子叶植物，该双子叶植物可为拟南芥，该拟南芥具体可为Columbia拟南芥。
本发明发现了一个新蛋白AtIBH1及其编码基因AtIBH1。AtIBH1可以与PRE1相互作用并功能拮抗，因此两个基因可以同时使用达到控制对生长的促进或抑制。用组织特异性启动子可以特异性的控制特定器官(包括营养和有性生殖器官)的生长和大小。本发明还获得了含有该编码基因AtIBH1的重组表达载体，用重组载体转化目的植物，可以得到成株株高变矮和/或叶柄变短和/或下胚轴变短和/或特定器官变小的转基因植物。将AtIBH1抑制表达后发现拟南芥的整个植株变大。因此AtIBH1可以作为一种潜在的分子育种工具，改变植物细胞伸长，从而改良植物株型，提高植物生物量。
图1为实施例1中i1i1-D突变体植株和日本晴(WT)幼苗期的照片。
图2为实施例1中i1i1-D突变体植株和日本晴(WT)分蘖期的照片。
图3为实施例1中种植于大田的扬花期的i1i1-D和日本晴(WT)的旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角测量数据统计结果。
图4为实施例1中i1i1-D突变体植株和日本晴(WT)幼苗叶枕部位近轴面细胞扫描电镜的照片。
图5为实施例1中i1i1-D突变体、日本晴(WT)、转基因阳性植株R2和R5的表型和OsILI1的表达量；A阳性转基因植株的表型；B实时定量PCR检测OsILI1在转基因植株中的相对表达量。
图6为实施例2中PRE1和AtIBH1在酵母中及植物体内相互作用的实验结果，其中A是酵母双杂交检测PRE1和AtIBH1在体外的相互作用；B烟草体内AtIBH1-myc和PRE1-YFP免疫共沉淀的结果。
图7为为实时定量PCR的方法检测用24-epiBL终浓度为100nM的水溶液处理拟南芥野生型col及det2突变体幼苗2小时后，AtIBH1的相对表达量。
图8为为实时定量PCR检测野生型拟南芥col的根，幼苗，莲座叶，茎生叶，花序及角果部位中AtIBH1的相对表达量，R、S、RL、CL、F、Si分别代表根，幼苗，莲座叶，茎生叶，花序及角果。
图9为染色质免疫共沉淀检测转录因子BZR1与AtIBH1启动子体内的结合，其中A，BZR1 ChIP-chip Genome Browser software在AtIBH1启动子区的分析示意图，空心矩形框代表启动子区，实心矩形框代表编码区，黑线代表非编码区，空心圆圈代表E-box，实心圆圈代表BRRE结合域，a和b代表ChIP-qPCR分析区段；B，BZR1染色质免疫共沉淀分析结果。Y轴指qPCR分析所选区段与BZR1共沉淀后的富积程度，CNX5为对照基因，Bar为三次生物重复后取平均值的标准误差。
图10为实施例3中AtIBH1过表达拟南芥植株的表型。
图11为实施例3中AtIBH1过表达拟南芥植株在光下的下胚轴和根的情况，其中A是下胚轴和根的表型，B是下胚轴和根的相对长度。
图12为实施例3中AtIBH1过表达拟南芥植株在暗中的下胚轴和根的情况，其中A是下胚轴和根的表型，B是下胚轴和根的相对长度。
图13为实施例3中AtIBHI-RNAi的转基因拟南芥Col的情况分析，其中A是表型分析；B是AtIBH1的表达量检测。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本发明依赖的遗传资源如下日本晴水稻和突变体植株i1i1-D于2004年5月从中国农业科学院获得，其原始来源不清楚；拟南芥Columbia的直接来源是2004年6月从华盛顿卡内基研究院获得，原始来源不清楚。
日本晴水稻中国科学院植物研究所；毛建军，杨秀芬，曾洪梅，袁京京，邱德文.水稻品种日本晴粳稻组培培养基的筛选及转稻瘟菌蛋白激发子基因植株的获得.《农业生物技术学报》，2008年16卷5期，824-830。
中花10号中国科学院植物研究所；李国甫，倪丕冲，李梅芳.高频水稻原生质体植株再生.《植物学报》，1993年，35(3)234-237. 拟南芥Columbia中国科学院植物研究所；刘俊，蔡平钟，马林，张志雄，向跃武，王闵霞，张志勇.冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建.《西南农业学报》，2009年22卷2期，428-432。
拟南芥bri1-5中国科学院植物研究所；Xuelu Wang，Xiaoqing LI，JillMwisenhelder，Tony Hunter，Shigeo Yoshida，Tadao Asami，and Joanne Chory.Autoregulation and Homodimerization Are Involved in the Activation of thePlant Steroid Receptor BRI1.《Development Cell》，2005年第8期855-865. 农杆菌GV3101中国科学院植物研究所；郑银英，崔百明，常明进，彭明.转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究.《西北植物学报》.2009年29卷1期.75-79。
以下实施例中的基因表达量检测结果，均是以野生型植株的目的基因表达量为1，其它植株的目的基因表达量与野生型植株的目的基因表达量进行比较。
实施例1、OsILI1的发现 一、突变体植株i1i1-D的获得和形态观察 1、突变体植株i1i1-D的获得 构建日本晴水稻T-DNA插入突变体库，从中发现了一个叶夹角明显增大的突变体植株i1i1-D。
2、突变体植株i1i1-D的形态观察 对突变体植株i1i1-D进行如下形态观察。
(1)叶夹角 i1i1-D最重要的表型是在其各个生长时期，均表现为叶夹角明显增大。在幼苗期，突变体萌发后生长5天左右，在第二叶发育完全后就可观察到第二叶叶夹角弯曲已超过90度(见图1)。在分蘖期，突变体的每个新生分蘖都表现为叶夹角明显增大(见图2)。
对种植于大田的扬花期的日本晴及i1i1-D的旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角进行测量，统计结果表明野生型旗叶、旗下第一叶和旗下第二叶叶夹角大小主要集中在0-30°之间，而突变体的叶夹角则主要分布于90-150°之间(见图3)。
(2)种子长度 分别检测100粒日本晴种子和100粒i1i1-D种子的长度。i1i1-D种子的平均长度为5.3±0.1，日本晴种子的平均长度为4.8±0.2，差异显著，有统计学意义。这表明，与日本晴相比，i1i1-D种子变长。
(3)叶枕部位细胞的伸长 用扫描电镜的方法对幼苗期的日本晴及i1i1-D突变体叶枕部位近轴面的细胞形态进行观察，见图4。结果表明，i1i1-D突变体叶枕部位近轴面的细胞比野生型日本晴相同部位细胞的伸长更为明显。
3、突变体植株i1i1-D的子代的形态观察 将i1i1-D种子繁殖后，后代持续出现叶夹角增大的表型。这些结果表明i1i1-D叶夹角增大的表型在各个生长时期中都是稳定的，并且表型是可稳定遗传的。
二、OsILI1的发现 根据插入的T-DNA载体序列设计引物，进行Tail-PCR扩增，然后将PCR产物回收，送至公司测序，再将测序结果在NCBI数据库中进行BLASTn比对。结果表明T-DNA插入于水稻4号染色体BAC克隆OsJNBa0063C所对应的序列上。
用Real-time PCR的方法对T-DNA插入两侧各10kb的DNA片段在日本晴及iii1-D中的表达进行分析，结果表明其中一段DNA(序列2所示的DNA)在i1i1-D突变体中上调了近20倍，因此推测可能是由于T-DNA上的35S启动子插入在序列2所示的DNA附近，造成了序列2所示的DNA的过量表达，从而造成了OsILI1突变体的表型。
三、OsILI1的功能鉴定 将序列2自5′端第116位至第297位核苷酸构建入RNAi载体中，转化i1i1-D，以期用RNA干涉的方法降低突变体中序列2所示的DNA的表达量。共获得了11个株系，大部分转基因阳性植株都恢复了野生型表型。随机选择转基因阳性植株中的几个株系进行进一步的鉴定，两个株系R2和R5明显恢复到了野生型的表型，经检测，序列2所示的DNA的在植株中表达量相对于i1i1-D突变体明显降低(见图5)。结果表明，序列2所示的DNA与转基因植株恢复野生型的程度密切相关。
以上结果表明i1i1-D突变体的表型是由于T-DNA插入在序列2所示的DNA附近，T-DNA上的35S启动子驱动序列2所示的DNA过量表达造成的。序列表的序列2所示的DNA编码序列表的序列1所示的蛋白质，根据表型将序列1所示的蛋白质命名为OsILI1(Oraza sativa increased leaf inclination-1)，将OsILI1的编码基因命名为OsILI1。
实施例2、AtIBH1的发现 一、AtIBH1的发现 通过对OsILI1蛋白序列进行分析可知，OsILI1属于basic helix-loop-helix(bHLH)类转录因子家族，但它并没有典型的basic结构域。此类bHLH蛋白被归类为D类bHLH蛋白，它们不能直接结合DNA，主要通过与典型的bHLH转录因子形成异源二聚体以调节它们的功能。以OsILI1全长蛋白作为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选与OsILI1相互作用的蛋白。将OsILI1的编码序列从cDNA文库中扩增后，连入pBD-GAL4载体，然后将构建好的载体转入酵母AH109，制作成感受态细胞后，共转化水稻三叶期酵母双杂交文库。筛库的效率为3×105克隆/g DNA，总的筛库量为3×106克隆，能在-His/-Trp/-Leu SD培养基上生长的克隆数为22个，最后能在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培养基上生长的克隆数为10个。对这10个克隆进行测序分析，发现其中有5个属于bHLH转录因子，其中的克隆16在筛选中出现了3次，对这个克隆所对应的蛋白序列进行保守域分析，发现它是一个典型的含有basicdomain的bHLH转录因子，因此我们选取这一蛋白进行下一步的研究，在此将它命名为AtIBH1(OsILI1-binding bHLH protein 1)。
用OsIBH1的蛋白序列在NCBI数据库中进行蛋白序列的blastP比对，发现在拟南芥中与OsIBH1相似度最高的蛋白对应的编码基因为At2g43060。因此将At2g43060命名为AtIBH1。AtIBH1的氨基酸序列如序列表中序列3所示，AtIBH1的编码基因AtIBH1的编码序列如序列表中序列4所示，其全序列如序列表中序列5所示，将AtIBH1的全长编码序列(序列表中序列4)从cDNA文库中扩增出来后构建到pAD-GAL4载体中构建成pAD-AtIBH1，与pBD-PRE1共转化酵母感受态细胞，涂布-Trp/-Leu SD平板，然后将长出的菌落转入-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培养基上培养，结果表明含pBD-PRE1和pAD-AtIBH1的酵母菌落可以在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD平板上很好地生长，而对照则不能生长，这说明PRE1和AtIBH1在酵母中确实存在着相互作用(图6A)。
将AtIBH1的全长编码序列cDNA文库中扩增出来后构建到35S启动子驱动的带有myc标签的载体中，得到AtIBH1-myc载体。然后将AtIBH1-myc和PRE1-YFP以等量的比例在烟草中瞬时表达。在注射菌液后的烟草培养48小时后，选取生长状态良好的烟草叶片在荧光显微镜下观察YFP荧光信号，并取少量组织分别用anti-GFP和anti-myc抗体做western杂交检测组织内融合蛋白的含量，anti-GFP和anti-myc杂交信号均一的用于下一步的免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)，单打了AtIBH1-myc的叶片作为负对照。结果表明在共沉淀之后，只有共转化了AtIBH1-myc和PRE1-YFP的洗脱样品用anti-myc杂交才有信号，而单转了AtIBH1-myc的样品在洗脱后则杂不出信号，这说明AtIBH1-myc和PRE1-YFP在体内也有着相互作用(图6B)。
二、AtIBH1的功能鉴定 1、BR对AtIBH1基因表达的调节 用24-epiBL终浓度为100nM的水溶液处理拟南芥野生型col及det2突变体幼苗2小时，未处理的拟南芥野生型col及det2突变体幼苗作为对照，提取RNA反转录，利用实时定量PCR的方法分析AtIBH1的表达情况，结果表明在BR合成缺陷突变体det2中，AtIBH1的表达量相对于在野生型中是上升的，而外源施加BR后，AtIBH1的表达量相比于对照下调，这说明AtIBH1的表达是受BR抑制的(附图7)。
2、AtIBH1基因表达模式的分析 分别取野生型拟南芥col的根，幼苗，莲座叶，茎生叶，花序及角果部位提取RNA反转录，利用实时定量PCR的方法分析AtIBH1的表达情况，结果表明AtIBH1主要在根，莲座叶，茎生叶等成熟组织表达，而在未开放的花蕾等幼嫩部位表达量较低；PRE1则主要在幼嫩的部位表达，这表明AtIBH1与PRE1在拟南芥的这些器官共表达，既顺序又重叠地调节着植物细胞的伸长(附图8)。
3、转录因子BZR1对AtIBH1的调节 BZR1是BR信号途径中的重要转录因子，它通过DNA结合结构域直接结合到BRs合成基因启动子上的CGTG(T/C)G保守序列，即BR反应元件(BR responseelement，BRRE)，调节这些基因的表达。通过对AtIBH1启动子序列进行分析，找到了若干BZR1可能的作用位点CGTG(T/C)G。为了确认BZR1蛋白和PRE1、AtIBH1的启动子区域有着直接的相互作用，用pBZR1:BZR1-CFP的转基因拟南芥来做染色质免疫共沉淀的实验(chromatin immunoprecipitation)。将pBZR1:BZR1-CFP的转基因拟南芥在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法用anti-GFP抗体沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，ChIP DNA杂交到Affymetrix基因芯片上，结果用BZR1 ChIP-chip Genome Browser software进行分析，结果表明AtIBH1在如图9A所示的a区段有富集。再用根据AtIBH1启动子上BRs响应元件富集区设计的引物进行PCR扩增。结果表明在免疫共沉淀后的pBZR1:BZR1-CFP样品中，AtIBH1的启动子选定区域相对于在对照中有明显的富集。这表明BZR1与AtIBH1启动子在体内有直接相互作用(图9B)。
实施例3、AtIBH1过表达拟南芥转基因植株的获得 一、重组表达载体的构建 1、35S启动子片段的获得 用限制性内切酶HindIII和BamHI对质粒载体pBI221(Clontech)进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测后回收长度约为0.8kb的35S启动子片段。
2、用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI221(Clontech)上切下，连接到载体pUC19(TaKaRa公司)的相应位点中，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与步骤1获得的35S启动子片段相连，得到重组载体pUC19-35S-Noster。
3、用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切从步骤2构建的重组载体切下包含35S和Noster的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)多克隆位点的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pSN1301。
4、提取拟南芥野生型col的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增制备AtIBH1的编码序列，PCR扩增的引物如下 FCCGGGATCC
BamHI RGCGGGTACC
KpnI 将PCR扩增产物测序，结果表明扩增产物具有序列表中序列5的自’端第54-600位所示的核苷酸，该扩增产物包括了序列4所示的AtIBH1的编码序列。将扩增产物连入pSN1301的BamHI和KpnI酶切位点，得到含有AtIBH1的重组表达载体，命名为AtIBH1-OX。重组表达载体经过测序检验正确。
二、AtIBH1过表达转基因植物的获得 1、将步骤一构建的重组表达载体转入农杆菌GV3101，用于转化拟南芥Col和BR信号转导突变体拟南芥bri1-5，获得转基因植物(AtIBH1-OX/Col和AtIBH1-OX/bri1-5)，具体步骤如下 1)在YEB平板上挑取含有表达载体的农杆菌单克隆，接种于10ml含抗生素(50mg/L卡纳霉素)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至对数生长晚期。
2)按1∶50的比例转接到50ml YEB培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至OD600为0.6左右。
3)5,000rpm，离心15分钟，收集菌体，重悬于渗透缓冲液(5％蔗糖，0.02％silwetL-77)，调OD600至0.6左右。
4)取正在开花的拟南芥，剪去转化前形成的果荚，然后将整个花序浸泡在步骤3)的菌悬液中15秒，使得农杆菌很好的粘附在花序中进行转化。
5)农杆菌侵染后的拟南芥放于阴暗处保湿培养24小时，然后将拟南芥移到培养室中继续正常培养，7-10天后再浸泡转化一次。
6)收获成熟的拟南芥种子，充分晾干后用10％次氯酸钠消毒后，铺在含有相应抗生素的1/2MS培养基上，筛选得到的抗性苗(T1代)移入土中继续培养。
用pSN1301代替重组表达载体，制备转空载体T1代植株，方法同上。
2、对转AtIBH1-OX的转基因拟南芥Col的1号，2号，3号株系的T1代植株进行进一步的分析(用转空载体T1代植株和非转基因拟南芥Col作为对照)。
将转空载体T1代植株、非转基因拟南芥Col、以及1号株系、2号株系和3号株系植株在25℃条件下、培养三周时间，拍照的结果如图10A所示，由于转空载体T1代植株与拟南芥Col表型相同，图10A中的对照仅显示拟南芥Col。由图10A可见，转基因植株变小，紧凑，叶柄缩短，叶片变小变圆，叶色深绿，其中以3号的表型为最明显。在成熟期，3号开花明显比其他株系及野生型要晚，它的主苔也非常矮小。对这些转基因植株中AtIBH1的表达量进行检测(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，发现转基因植株的表型是与AtIBH1的表达量相对应的，在表型最强的2号中，AtIBH1的表达量为最多。
3、对转AtIBH1-OX的转基因拟南芥bri1-5的1号株系的T1代植株进行进一步的分析(用转空载体T1代植株和非转基因拟南芥bri1-5作为对照)。
将将转空载体T1代植株、非转基因拟南芥bri1-5以及1号株系在25℃条件下、培养三周时间，拍照的结果如图10B所示，因转空载体T1代植株与拟南芥bri1-5表型相同，图10B中的对照仅显示拟南芥bri1-5。由图10B可见，转基因植株相对于对照更小，紧凑，叶柄明显缩短，叶片变小变圆，叶色深绿。对这些转基因植株中AtIBH1的表达量进行检测(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，发现转基因植株的表型是与AtIBH1的表达量相对应的。
4、ATIBH1过表达植株幼苗在光下下胚轴和根缩短 将AtIBH1-OX的转基因拟南芥Col的3号株系、转空载体T1代植株和非转基因拟南芥Col在1/2MS上4℃冰箱春化两天，在相同的光照强度下(45umol m-2s-1)20小时光照，4小时黑暗22℃同时生长六天后观察表型和统计下胚轴和根的相对长度。相对长度测定方法是Col和AtIBH1-OX/Col分别测量45棵幼苗，取平均长度后，以Col的平均长度为1，ATIBH1-OX/Col与Col的长度的比值为纵坐标，结果如图11所示，非转基因拟南芥Col与转空载体T1代植株的表型一致，图11中的对照只显示非转基因拟南芥Col。由图11可见，ATIBH1过表达植株幼苗与非转基因拟南芥Col相比，在光下培养后的下胚轴和根缩短。
5、ATIBH1过表达植株幼苗在暗中比野生型下胚轴和根缩短 将AtIBH1-OX的转基因拟南芥Col的3号株系、转空载体T1代植株和非转基因拟南芥Col在1/2MS培养基上、4℃冰箱春化处理两天，光下22℃放置2小时，在完全黑暗中生长6天后观察表型、并且按照上述方法统计下胚轴和根的相对长度。
结果如图12所示，ATIBH1过表达植株幼苗与非转基因拟南芥Col相比，在暗中培养后下胚轴和根缩短。由于非转基因拟南芥Col与转空载体T1代植株的表型一致，图12中的对照仅显示非转基因拟南芥Col。
实施例4、AtIBH1-RNAi拟南芥转基因植株的获得 一、重组表达载体的构建 1、目标片段的获得 提取拟南芥野生型col的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增的引物如下 FCGCGGTACC
KpnI Spe I RGCGGGATCC
BamH I Sac I 2、构建重组表达载体 将PCR扩增产物(序列5的自5’端第66-359位所示的片段)酶切两步法连入TCK309(先用Spe I和Sac I酶切PCR扩增产物与pTCK309连接，在此基础上再用BamHI和KpnI酶切PCR扩增产物连入反向片段)，得到含有AtIBH1的重组表达载体，命名为AtIBH1-RNAi。重组表达载体经过测序检验正确。
其中，pTCK309的构建方法如下 含有KpnI，XhoI，SalI，ClaI，SpeI，XbaI，SacI酶切位点的片段(序列表中序列6)插入pBluescript II SK+(Stratagene)载体的KpnI和SacI酶切位点之间，构成pTCK302； 然后用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物从水稻(中花10号)基因组DNA中扩增出478bp的水稻内含子，连入pGEM-T(Promega)载体，构成重组T载体； 用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’从作为模板的重组T载体中PCR扩增，PCR产物用Sal I和Cla I酶切并克隆到上述pTCK302载体中，构成的载体命名为pTCK302-1。然后用KpnI和Sacl分别酶切pTCK302-1和实施例3中的pSN1301，回收pSN1301的大片段和pTCK302-1的小片段，将大片段和小片段连接，构成pTCK309。
二、AtIBH1-RNAi拟南芥转基因植株 1、将步骤一构建的重组表达载体按照实施例3步骤二提供的方法导入拟南芥col，得到转基因拟南芥(AtIBH1-RNAi/Col)。
用pTCK309代替重组表达载体，制备转空载体T1代植株，方法同上。
2、对转AtIBH1-RNAi的转基因拟南芥Col的8，1，5，9，4号株系的T1代植株进行进一步的分析 将转空载体T1代植株、非转基因拟南芥Col、以及8，1，5，9，4号株系植株在22℃条件下、培养30天时间，拍照的结果如图13所示，因转空载体T0代植株与拟南芥Col表型相同，图中的对照仅为拟南芥Col。由图13A可见，转基因植株整个植株变大，其中以1号的表型为最明显。对这些转基因植株中AtIBH1的表达量进行检测(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，发现转基因植株的表型是与AtIBH1的表达量相对应的(图13B)，在表型最强的1号中，AtIBH1的表达量为最少。
序列表
<110>中国科学院植物研究所
中国农业科学院生物技术研究所
华盛顿卡内基研究院
<120>一种控制植物生长的蛋白及其编码基因与应用
<160>6
<210>1
<211>104
<212>PRT
<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)
<400>1
Met Ser Ser Ser Arg Arg Ser Arg Ser Arg Arg Ala Gly Ser Ser Val
1 5 10 15
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Glu Asp Gln Ile
20 25 30
Ala Glu Leu Leu Ser Lys Leu Gln Ala Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ala
35 40 45
Arg Asn Gly Ala His Arg Gly Ser Ala Ala Arg Val Leu Gln Glu Thr
50 55 60
Cys Ser Tyr Ile Arg Ser Leu His Gln Glu Val Asp Ash Leu Ser Glu
65 70 75 80
Thr Leu Ala Gln Leu Leu Ala Ser Pro Asp Val Thr Ser Asp Gln Ala
85 90 95
Ala Val Ile Arg Ser Leu Leu Met
100
<210>2
<211>315
<212>DNA
<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)
<400>2
atgtcgagca gccggaggtc gcgctcacgg cgagccggga gctcggtgcc gtcgtcgtcg 60
tcgtcgtcga ggacgtcgat ctcggaggac cagatcgccg agcttctctc caagcttcag120
gccctgctcc cggagtctca ggctcgcaat ggcgcccata ggggctcggc ggcgagggtt180
ttgcaggaga cgtgcagcta catcaggagc ctgcaccagg aggtggacaa cctcagcgag240
acgctcgctc agctgctcgc ctcccccgac gtcaccagcg accaggcggc cgtcatcagg300
agcctcctca tgtga 315
<210>3
<211>156
<212PRT
<213>拟南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>3
Met Ala Ser Ala Asp Lys Leu Ile Asn Thr Asp Val Pro Glu Lys Asp
1 5 10 15
Val Phe Ala Phe His Phe Leu Gln Ser Leu Ser Asn Leu Arg Lys Gln
20 25 30
Asn Pro Phe Asp Thr Pro Asp Gln Lys Asn Tyr Arg Val Arg Lys Ile
35 40 45
Lys Lys Ala Ala Tyr Val Ser Met Ala Arg Ala Ala Gly Gly Ser Ser
50 55 60
Arg Leu Trp Ser Arg Ala Leu Leu Arg Arg Ala Asp Lys Asp Asp Asn
65 70 75 80
Lys Ile Val Arg Phe Ser Arg Arg Lys Trp Lys Ile Ser Ser Lys Arg
85 90 95
Arg Arg Ser Asn Gln Arg Ala Pro Val Val Glu Glu Ala Ala Glu Arg
100 105 110
Leu Arg Asn Leu Val Pro Gly Gly Gly Gly Met Glu Thr Ser Lys Leu
115 120 125
Met Glu Glu Thr Ala His Tyr Ile Lys Cys Leu Ser Met Gln Val Lys
130 135 140
Val Met Gln Cys Leu Val Asp Gly Leu Ser Pro Lys
145 150 155
<210>4
<211>471
<212>DNA
<213>拟南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>4
atggcctctg cagacaaact cataaacaca gatgtccctg aaaaggacgt ttttgccttc 60
cacttcctcc aatccctctc aaatctcaga aaacaaaacc cttttgatac tccggaccaa120
aaaaactacc gcgtgaggaa gatcaagaag gctgcgtacg tttccatggc cagagcagcc180
ggagggagta gccggctatg gagcagagcc ctcttgcgta gagcagacaa agatgacaac240
aagatcgtaa gattttcaag gaggaagtgg aagatatcat caaaacggag gaggagtaac300
cagagagctc cggtggtgga ggaggcggcg gagaggctga ggaatcttgt tccgggaggc360
ggaggaatgg agacgtcaaa gctgatggaa gagacggctc attacatcaa gtgccttagt420
atgcaggtca aggtcatgca gtgtctcgtt gatggcttat ctcccaaatg a 471
<210>5
<211>898
<212>DNA
<213>拟南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>5
aaaaaaaaaa aagttttata aaggttctca actcaagttc tcttctctaa aaaacccaaa 60
caatggcctc tgcagacaaa ctcataaaca cagatgtccc tgaaaaggac gtttttgcct120
tccacttcct ccaatccctc tcaaatctca gaaaacaaaa cccttttgat actccggacc180
aaaaaaacta ccgcgtgagg aagatcaaga aggctgcgta cgtttccatg gccagagcag240
ccggagggag tagccggcta tggagcagag ccctcttgcg tagagcagac aaagatgaca300
acaagatcgt aagattttca aggaggaagt ggaagatatc atcaaaacgg aggaggagta360
accagagagc tccggtggtg gaggaggcgg cggagaggct gaggaatctt gttccgggag420
gcggaggaat ggagacgtca aagctgatgg aagagacggc tcattacatc aagtgcctta480
gtatgcaggt caaggtcatg cagtgtctcg ttgatggctt atctcccaaa tgatcatcaa540
ttaatcatca acatcatcat caatgatcga tgtatataga gatacgacac atacatagtc600
tattggattg gggtaatcat aacgaatata tatgtgtata tatatatata tatatatata660
tatattctta tatatataca tacgtgtaag ataggataca tatatgaaat gtgtggatat720
gtattagtct cgaagtaacg aaagattttt ttctttttct tttcttgaat tttgataaaa780
ggggatttat tatttatcat atgctatggc cggtttaaac attagggctt ggtaacttgc840
ccttgtcata tgataaaagg ggatttatta cttatcatat gctaagagaa ttttcttt 898
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ggtaccctcg aggtcgacat cgatactagt tctagagagc tc4权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质
(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列3的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由其衍生的蛋白质；所述植物发育体现在成株株高和/或叶柄长度和/或下胚轴长度和/或特定器官的大小等性状上。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子
1)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
2)序列表中序列5的自’端第54-600位所示的DNA分子；
3)序列表中序列5所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA分子；
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入质粒pSN1301的多克隆位点得到的重组表达载体；
所述质粒pSN1301是将质粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位点间插入35S-Noster序列得到的；
所述35S-Noster序列是用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切质粒pUC19-35S-Noster得到的；
所述质粒pUC19-35S-Noster是将质粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位点间插入35S启动子片段得到的；
所述35S启动子片段是用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切质粒pBI221得到的；
所述质粒pUC19-Noster是将质粒pUC19的Sac I和EcoR I酶切位点间插入Nosterpoly A终止序列得到的；所述Noster poly A终止序列是用限制性内切酶Sac I和EcoRI双酶切质粒pBI221得到的。
6.一种培育转基因植物的方法，是如下1)或2)的方法
1)将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物为与所述目的植物相比株高变矮和/或叶柄缩短和/或下胚轴缩短和/或叶片变小的转基因植物；
2)在目的植物中将权利要求2或3所述基因进行抑制表达，得到转基因植物，所述转基因植物的株型大小大于所述目的植物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法1)中，权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法2)中，抑制表达是将AtIBH1-RNAi导入目的植物中实现的；
所述AtIBH1-RNAi是将序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段正向插入pTCK309的Spe I和Sac I酶切位点间构成pTCK309-1，将序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段反向插入pTCK309-1的BamH I和Kpn I酶切位点，构成AtIBH1-RNAi；
所述pTCK309的构建方法如下将序列表中序列6所示的片段插入pBluescriptII SK+的KpnI和SacI酶切位点之间，构成pTCK302；用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物从水稻(中花10号)基因组DNA中扩增出478bp的水稻内含子，连入pGEM-T载体，构成重组T载体；以所述重组T载体为模板，用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’PCR扩增，扩增产物用Sal I和Cla I酶切并克隆到所述pTCK302载体中，构成的载体命名为pTCK302-1；用KpnI和Sacl酶切pTCK302-1得到小片段插入所述pSN1301的KpnI和Sacl酶切位点间，构成pTCK309。
9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥；所述拟南芥为Columbia拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种调控植物生长发育与植物株型相关的蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物发育相关的由其衍生的蛋白质；所述植物发育体现在成株株高和/或叶柄长度和/或下胚轴长度和/或特定器官的大小性状上。将上述蛋白的编码基因过表达，可以得到株高变矮和/或叶柄缩短和/或下胚轴缩短和/或叶片变小的转基因植物；将上述蛋白的编码基因进行抑制表达，可是植株变大。因此AtIBH1可以作为一种潜在的分子育种工具，改良植物株型，提高植物产量。
文档编号C12N1/21GK101824078SQ20091024186
公开日2010年9月8日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者王志勇, 种康, 路铁刚, 白明义, 张丽颖, 朱佳瑛, 王昊 申请人:中国科学院植物研究所, 中国农业科学院生物技术研究所, 华盛顿卡内基研究院