专利名称：建立针对中国人口腔白色海绵状斑痣动物模型的实验方法
技术领域：
本发明涉及一种实验技术应用于研究人类口腔粘膜病一白色海绵状斑痣，将人 类口腔疾病转移至动物模型上从而为该病的机制研究和治疗提供有效的实验动物的技术。
背景技术：
口腔白色海绵状斑痣(white sponge nevus以下简称WSN)又称白色折皱病，是角 蛋白基因突变引起的一种常染色体显性遗传病，特性为具有不规则的外显性，个体发病率 与家族系列相比较多，棘层细胞表达蛋白K13和K4的点突变或外源碱基的插入，导致此病 的发生。目前关于白色海绵状斑痣的突变基因的研究，国际上共发现了 9个突变位点(其 中2个是我们发现的)，通过比较其他突变位点，我们发现该突变具有明显的特点，即存在 显著的家族遗传性和人种特异性。2008年，通过研究，我们发现中国人的WSN病的致病基因 突变发生在Keratin 4基因上，突变位点为1829G — A，蛋白质E520K，从而首次在国际上揭 示了中国人此病的致病基因突变位点，但到目前为止，此疾病发生的分子机制尚不清晰，也 无有效的治疗方法。为了进一步对此病进行研究，我们建立了针对中国人WSN病此突变的 转基因动物模型，力争为该病的机制研究和治疗提供有效的实验动物。
发明内容
为了探讨WSN病发病的分子机理，我们在国际上首次建立了针对中国人的，可以 模拟人类口腔白色海绵状斑痣临床病理表型的K4突变的转基因动物模型本发明提供的实 验方法，其实验步骤如下一、探测中国人WSN患者的突变基因位点2.用盐析法提取WSN患者的DNA。3.设计引物K4F1 5，-GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG-3，，K4R1 5' -GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC-3‘禾ΠK4F2 5’ -GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG-3，，K4R2 5，-GCCAAAGCCACTACTCAGGCC-3，，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增 Κ4 基因上 的目的基因。4.对扩增的Κ4基因进行测序。5.发现中国人WSN患者的基因突变位点。二、Κ4突变基因重组质粒的构建2.利用STRATAGENE公司的点突变试剂盒在质粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因 1829位上制造突变G变为A，使第520密码子由GAG突变为AAG，氨基酸由E突变为K，PCR 及测序证明突变成功。3.构建用于连接的linker A--Mlul-Aval--Aval--BamHl--EcoRI--HindIII-A 插入到 T-vector 中，然后分别利用限制性内切酶BamH I (241bp), EcoR I (816bp), HindIII (2479bp)进行重组，产生重组 的KRT4基因。将KRT4基因利用BamHI/Hindlll插入表达载体pcDNA3. 1(+/_)，完成K4转基因模 型重组质粒的构建。三、重组质粒转染将重组质粒转染至LA795鼠肺癌细胞中进行培养，发现转染野生型cytokeratiM cDNA重组质粒的细胞表现为长梭形，转染突变型的细胞则表现为不规则形或短梭形，说明 基因突变影响了转染细胞中间张力丝的稳定性，从而引起细胞形态的改变。此表现证实该突变为中国人WSN病的致病突变基因。四、K4转基因动物模型的筛选与鉴定1.用限制性内切酶PvuI将构建好的pcDNA3. 1-KRT4进行线性化，纯化后进行显微 注射，将K4基因的重组质粒导入小鼠受精卵中2.对转基因首建鼠用PCR法进行检测鉴定。3.将鉴定阳性的首建转基因小鼠和非转基因小鼠合笼，繁殖得到Fl代小鼠。4.利用聚合酶链式反应鉴定Fl代转基因小鼠。5.将鉴定阳性的Fl代转基因小鼠，通过光镜、电镜、Wfestern blotting、免疫组 化、免疫荧光、原位杂交等方法，证实其蛋白和临床病理表型表现为白色海绵状斑痣的表 现。6.证实针对中国人白色海绵状斑痣的转基因动物模型构建成功。借助分子生物学和胚胎工程的技术，将人类口腔WSN相关K4突变基因在体外扩增 和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的 输卵管或子宫中后，发育成携带K4突变基因的转基因动物。本发明的优点是，其针对中国家系发现的WSN基因突变位点进行实验研究，具有 一定的针对性，唯一性。该技术周期短，成本低，特异性强，可基本表现出WSN表征，有助于 人们对WSN疾病发生机制进行实验研究。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图1是本发明的实验步骤流程图。
具体实施例方式如图1所示，本发明的实施步骤如下首先用盐析法提取WSN患者的DNA。设计两对引物将DNA中K4基因上的目的基因 进行聚合酶链式反应(PCR)，对扩增出来的K4基因片段进行测序，发现中国人WSN患者基因 突变位点。然后利用STRATAGENE公司的点突变试剂盒在质粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因 18 位上制造突变G变为A，使氨基酸由E突变为K，PCR及测序证明突变成功。构建用于 连接的linker然后分别利用限制性内切酶进行重组，产生重组的KRT4基因。将KRT4基因 插入表达载体pcDNA3. 1 (+/-)，完成K4转基因模型重组质粒的构建。将将重组质粒转染至LA795鼠肺癌细胞中进行培养，证实该突变为中国人WSN病的致病突变基因。再将构建好的pcDNA3. 1-KRT4产物大量提取，线性化及纯化，通过显微注射法建 立K4基因突变转基因小鼠模型。用聚合酶链式反应(PCR)对首建鼠进行目的基因检测鉴 定，将检测结果阳性的首建转基因小鼠和非转基因小鼠合笼，繁殖得到Fl代小鼠。最后对PCR技术鉴定出的阳性Fl代转基因小鼠，通过光镜、电镜、 Wfesternblotting、免疫组化、免疫荧光、原位杂交等方法，证实其蛋白和临床病理表型表现 为白色海绵状斑痣的表现，证实针对中国人白色海绵状斑痣的转基因动物模型构建成功。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡 是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于 本发明技术方案的范围内。综上所述，本发明在结构设计、使用实用性及成本效益上，完全符合产业发展所 需，且所揭示的结构亦是具有前所未有的创新构造，具有新颖性、创造性、实用性，符合有关 发明专利要件的规定，故依法提起申请。
权利要求
1. 一种建立针对中国人口腔白色海绵状斑痣动物模型的实验方法，其特征在于，该实 验方法的步骤为探测中国人WSN患者的突变基因位点(1)用盐析法提取WSN患者的DNA；(2)设计引物K4F1 5’ -GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG-3，， K4R1 5’ -GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC-3，禾口 K4F2 5' -GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG-3，，K4R2 5’-GCCAAAGCCACTACTCAGGCC-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增K4基因上的目 的基因；(3)对扩增的K4基因进行测序；(4)发现中国人WSN患者的基因突变位点； K4突变基因重组质粒的构建(1)利用STRATAGENE公司的点突变试剂盒在质粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因18 位上制造突变G变为A，使第520密码子由GAG突变为AAG，氨基酸由E突变为K，PCR及测 序证明突变成功；(2)构建用于连接的linkerA--Mlul-Aval--Aval--BamHl--EcoRI--HindIII-A 插入到 T-vector 中，然后分别利 用限制性内切酶BamH I (Mlbp)、EcoRI (816bp)、HindIII (2479bp)进行重组，产生重组的 KRT4基因；将KCT4基因利用BamHI/Hindlll插入表达载体pcDNA3. 1 (+/_)，完成K4转基因模型重 组质粒的构建； 重组质粒转染将重组质粒转染至LA795鼠肺癌细胞中进行培养，发现转染野生型cytokeratiMcDNA 重组质粒的细胞表现为长梭形，转染突变型的细胞则表现为不规则形或短梭形，说明基因 突变影响了转染细胞中间张力丝的稳定性，从而引起细胞形态的改变； 此表现证实该突变为中国人WSN病的致病突变基因； K4转基因动物模型的筛选与鉴定(1)用限制性内切酶PvuI将构建好的pcDNA3.1-KRT4进行线性化，纯化后进行显微注 射，将K4基因的重组质粒导入小鼠受精卵中(2)对转基因首建鼠用PCR法进行检测鉴定；(3)将鉴定阳性的首建转基因小鼠和非转基因小鼠合笼，繁殖得到Fl代小鼠；(4)利用聚合酶链式反应鉴定Fl代转基因小鼠；(5)将鉴定阳性的Fl代转基因小鼠，通过光镜、电镜、ffesternblotting、免疫组化、免 疫荧光、原位杂交等方法，证实其蛋白和临床病理表型表现为白色海绵状斑痣的表现。
全文摘要
一种建立针对中国人口腔白色海绵状斑痣动物模型的实验方法，该实验方法的步骤为探测中国人WSN患者的突变基因位点，K4突变基因重组质粒的构建，重组质粒转染，K4转基因动物模型的筛选与鉴定。本发明针对中国家系发现的WSN基因突变位点进行实验研究，具有一定的针对性，唯一性。该技术周期短，成本低，特异性强，可基本表现出WSN表征，有助于人们对WSN疾病发生机制进行实验研究。
文档编号C12N15/85GK102102103SQ20091024481
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者张剑明 申请人:张剑明