专利名称：使用新的杂交缓冲液用于检测染色体畸变的组合物和方法
使用新的杂交缓冲液用于检测染色体畸变的组合物和方法发明领域本发明一般而言涉及用于在体内、体外和原位检测染色体畸变的组合物和方法。 本发明还涉及用于杂交、尤其是用于原位杂交(ISH)的组合物，所述组合物包含用于检测 特定核苷酸序列(包括正常序列和与染色体畸变和/或感染性疾病相关的序列)的分子探 针和包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的含水组合物。在一个实施方案中，本发明涉及用于例如细胞学、组织学和分子生物学领域的分 子探针，并涉及包含这种分子探针的试剂盒。在其它实施方案中，本发明涉及使用这种分子 探针来检测染色体畸变或感染性疾病的方法，使用这种分子探针来诊断遗传缺陷或疾病状 态的方法，以及使用这种分子探针来提供预后的方法。背景和描述许多病理性状态，先天性缺陷和后天性疾病，都与染色体畸变有关，例如扩增、非 整倍性、潜在断点、插入、倒位、缺失、重复、重排和易位。此外，致病性感染通常会导致受感 染生物体内存在感染性细菌、病毒或真菌的核酸序列。通过基因组DNA、染色体、染色体片段或基因的体内、体外或原位分析，确定与先天 性缺陷、后天性疾病或感染性病原体相关的核苷酸序列的存在与否，可有助于临床医生作 出合适诊断。例如，脆性X精神发育迟缓-Kfragile X mental retardation-1，FMR1)基 因的mRNA5' UTR(非翻译区)中的CGG三核苷酸重复序列的扩增允许临床医生诊断脆性 X综合征。这种扩增导致基因转录沉默。然而，其它机制，例如FMRl的缺失和突变，也可能 会导致脆性X综合征。其结果，基因产物FMRP不存在或数量减少而导致疾病，与扩增所导 致的沉默和基因缺失是一样。由数目异常所导致的疾病的一个实例是唐氏综合征(Down Syndrome)，也称为三性体21 (唐氏综合征个体具有3拷贝的染色体21，而不是2拷贝)。 特纳氏综合征(Turner Syndrome)是单性体的一个实例，其中个体出生时就只有一条性染 色体X。其它实例包括由染色体4部分缺失所致的WoIf-Hirschhorn综合征和也称为末端 Ilq缺失症的Jacobsen综合征。某些综合征，例如Charcot-Marie-Tooth病IA型可因例如 染色体17上编码周围髓鞘质蛋白22 (PMP22)的基因重复而导致。在其它综合征例如罗伯 逊易位(Robertsonian translocation)中，一条完整染色体与另一条在着丝粒处连接。罗 伯逊易位仅发生在染色体13、14、15、21和22，罗伯逊易位的杂合载体的后代可能例如遗传 不平衡的三性体21，而引起唐氏综合征。通过基因组DNA、染色体、染色体片段或基因的体内、体外或原位分析，确定与先天 性缺陷、后天性疾病或感染性病原体相关的核苷酸序列的存在与否，对于临床医生在已经 诊断出疾病状态之后选择合适治疗进程而言，也是很有价值的。例如，HER2基因已扩增的 乳癌患者可从Here印tin (曲妥单抗，能识别HER2蛋白的单克隆抗体)治疗中受益。在另 一个实例中，临床医生可选择给予EGFR基因已扩增的结直肠癌患者Erbitux (西妥昔单 抗)或VectibiXTM(panitUmUmab)(特异性识别表皮生长因子受体(EGFR)的治疗性单克隆 抗体)。通过基因组DNA、染色体、染色体片段或基因的体内、体外或原位分析，确定与先天性缺陷、后天性疾病或感染性病原体相关的核苷酸序列的存在与否，也有助于临床医生提 供预后。因此，T0P2A基因已扩增或缺失的乳癌患者比那些未扩增或缺失的患者而言，预后更差。对核苷酸序列存在与否的检测通常需要通过杂交、或需要通过相对链上碱基间的 氢键结合(A+T或G+C)的核苷酸双螺旋结构的稳定化，来识别序列。在杂交的基础实例中， 核酸片段或序列与互补核酸片段或序列结合。通过杂交的检测通常涉及使用经设计可与核 酸靶标例如DNA或RNA序列结合或“杂交”的核酸探针。分子生物学领域已经有众所周知的技术，用于检测染色体畸变。然而，迄今为止， 还没有允许广泛而常规检测染色体畸变的快速、方便、便宜和用户友好的可用的测试。核酸杂交测定的效率和准确度主要取决于以下3个因素中的至少一个a)变性 (即例如两条核酸链的分离)条件，b)复性(即例如两条核酸链重新退火)条件，和c)杂 交后的洗涤条件。传统的杂交实验，例如ISH测定，使用含甲酰胺的缓冲液，以使双链核酸链变性。 甲酰胺是一种溶剂，它通过置换松散而均勻结合的水合分子而对例如DNA、RNA及其类似物 的螺旋状态具有去稳定效应。此外，甲酰胺通过碱基Watson-Crick结合位点的‘甲酰胺化’ 而使DNA、RNA及其类似物的卷曲状态稳定。变性步骤之后是两条核酸链互补链的重新退火，这是使用杂交的测定中最耗时间 的。例如，在传统的荧光原位杂交(FISH)方案中，重新退火需要14-M小时，并且甚至至多 需要72小时。传统杂交时间的实例见
图1和图2。迄今为止，认为使用干扰核酸碱基Watson-Crick结合位点并因而破坏互补核酸 碱基间氢键的离液剂，例如甲酰胺(其它离液剂包括胍离子(guanidinium hydrogen)和尿 素)，是降低互补链的解链温度(Tm)的唯一方式，如同变性步骤中所必需的一样。然而，尽 管使用离液剂降低了 Tm，这些试剂看来与在不含离液剂的含水溶液中进行的杂交相比，明 显延长了杂交时间。甲酰胺在长时间处理中具有缺点。甲酰胺是有毒有害物质，其使用和废料都受到 严格的法规管制。此外，使用高浓度甲酰胺看来会导致细胞结构、核结构和/或染色体结构 的形态学上的破坏。本文所述的含水组合物允许在比现有技术具有若干潜在优势的条件下进行核酸 序列检测，所述优势例如更快的杂交时间，更低的杂交温度和更少毒性的杂交组合物。发明概述本发明提供用于检测染色体畸变相关的核酸序列的组合物和方法。本发明的组 合物和方法可用于使用碱基配对而杂交或结合的任何杂交技术和任何分子系统，例如DNA、 RNA、PNA、LNA及其合成和天然类似物。本发明的组合物和方法允许用于染色体畸变相关核 酸序列的高灵敏度的、技术简单的、灵活可靠和/或快速的检测。在一个实施方案中，本发 明通过比用现有技术方法程度大得多地改变杂交反应的温度，提供定制杂交时间的能力。 本发明的杂交组合物和方法保持了生物样品的形态学，提供了无毒杂交组合物和程序，提 供了低蒸发杂交技术，降低和/或取消了对封闭非特异性结合的需求，和/或允许使用多相 探针，而无需封闭、去除或用其它方法破坏例如生物样品中的重复序列的结合。在一个实施方案中，本发明提供的组合物包含检测染色体畸变相关核苷酸序列的10第一分子探针，以及包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的 含水组合物。在另一个实施方案中，本发明提供包含这种组合物的试剂盒。在又一个实施 方案中，本发明提供包含第一组合物和第二组合物的试剂盒，其中所述第一组合物包含检 测染色体畸变相关核苷酸序列的第一分子探针，第二组合物是包含足以变性双链核苷酸序 列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的含水组合物。本文所提供的组合物和试剂盒可用于例如基因组DNA、染色体、染色体片段和基 因等的核酸的体内、体外和/或原位分析，其使用例如以下技术PCR、原位PCR、RNA印 迹、DNA印迹、流式细胞术、放射自显影、荧光显微镜术、化学发光、免疫组织化学、虚拟核型 (virtual karyotype)、基因测定、DNA微阵列(例如阵列比较基因组杂交(阵列CGH))、 基因表达谱、基因ID、叠瓦阵列(Tiling array)、凝胶电泳、毛细管电泳和原位杂交例如 FISH、SISH、CISH0在一个实施方案中，所述组合物和试剂盒可用于核酸的体内、体外或原 位分析，用于分析正常状态或疾病(例如先天性疾病、癌症或感染)相关的染色体畸变，例 如非整倍性、潜在断点、插入、倒位、缺失、重复、基因扩增、重排和易位。本文所提供的组合 物和试剂盒也可用于检测RNA表达水平例如mRNA及其互补DNA(cDNA)的变化。本发明的 组合物和试剂盒可用于体外、体内或原位样品(包括例如哺乳动物样品例如人类样品)，例 如骨髓涂片、血涂片、石蜡包埋的组织制备物、酶解的组织样品、骨髓、羊水细胞、细胞离心 (cytospin)制备物、印迹(imprint)等。其它用途包括使用FRET和其它猝灭技术的基于溶液的杂交测定；用链霉抗生物 素缀合物检测生物素标记，例如使用原位DakoGenPoint 扩增的检测系统或Tyramide信号 放大(TSA)系统(K0620, Dako)；或者用金属(例如金和银)直接标记。在一个实施方案中，本发明提供检测染色体DNA中的靶标的方法，所述方法包括-提供与染色体DNA中的靶标杂交的至少一种分子探针，-提供染色体DNA，-提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交 组合物，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)，-将所述分子探针、所述染色体DNA和所述杂交组合物混合在一起，其时间至少足 以使所述分子探针与所述靶标杂交，和-检测所述靶标。在另一个实施方案中，本发明提供确定核酸序列中染色体畸变存在的方法，所述 方法包括-提供至少一种分子探针，-提供所述核酸序列，-提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交 组合物，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)，-将所述分子探针、所述核酸序列和所述杂交组合物混合在一起，其时间至少足以 使所述分子探针与所述核酸序列杂交，和-检测所述至少一种分子探针，-并确定染色体畸变的存在。在又一个实施方案中，本发明提供确定核酸序列中染色体畸变存在的方法，所述方法包括-提供所述核酸序列，-提供包含至少一种分子探针和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极 性非质子溶剂的杂交组合物，-将所述杂交组合物用于所述核酸，其时间至少足以使所述分子探针与核酸序列 杂交，和-检测所述至少一种分子探针，-并确定染色体畸变的存在，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。在另一个实施方案中，本发明提供确定核酸序列中染色体畸变存在的方法，所述 方法包括-提供所述核酸序列，-将权利要求1-50中任一项的组合物用于所述核酸序列，其时间至少足以使所述 分子探针与核酸序列杂交，和-确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中。在又一个实施方案中，本发明提供诊断染色体畸变相关的先天性遗传疾病、癌症 或感染的方法，所述方法包括提供来自受试者的组织样品，其中所述组织样品包含核酸序 列，确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中，和如果染色体畸变存在于所述组织样品 中则诊断所述先天性遗传疾病、癌症或感染。所述样品可以是哺乳动物样品。在一个实施 方案中，所述样品是人类样品。本发明的杂交组合物和方法可例如不用甲酰胺或减少对甲酰胺的依赖性。例如， 本发明的方法和组合物可降低杂交的能障，而不用甲酰胺。降低能障可减少杂交所需时间 和/或降低杂交所需温度。例如，本发明可允许在较低温度(包括室温)杂交，或可允许在 较高温度快速杂交。因此，在某些方面，本发明克服了杂交测定中的主要耗时步骤。本发明一方面是用于杂交的组合物或溶液。用于本发明的组合物包括含有至少一 种核酸序列和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的含水组合 物。变性双链核苷酸序列的有效量是能够杂交的量。例如，用于测定极性非质子溶剂的量 是否对杂交有效的一个方式就是，确定所述极性非质子溶剂，当用于本文所述的杂交方法 和组合物例如实施例1时，是否能产生可检测信号和/或扩增的核酸产物。极性非质子溶剂有效量的非限制性实例包括例如约至约95% (ν/ν)。在某些 实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为5%至60% (ν/ν) 0在其它实施方案中，极性非质子 溶剂的浓度为10%至60% (ν/ν) 0在再一些实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为30%至 50% (ν/ν)。至 5%、5% 至 10%、10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、或50%至60% (ν/ν)的浓度也是合适的。在某些实施方案中，极性非质子溶剂的浓 度可以是0.1%、0.25%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5% (ν/ν)。在其它实施方案中，极性 非质子溶剂的浓度可以是 7%、7. 5%,8%,8. 5%,9%,9. 5%U0%U0. 5%U1%>11. 5%, 12%U2. 5% ,13% ,13. 5% ,14% ,14. 5% ,15% ,15. 5% ,16% ,16. 5% ,17% ,17. 5% ,18%, 18. 5%、19%、19. 5% 或 20% (ν/ν)。依据本发明的另一方面，包含极性非质子溶剂的含水组合物具有降低的毒性。例12如，比传统杂交溶液毒性更低的组合物可包含组合物，前提条件是所述组合物不含甲酰胺， 或条件是所述组合物含有小于10 %、或小于5 %、或小于2 %、或小于1 %、或小于0. 5 %、或 小于0. 1%、或小于0.05%、或小于0.01%甲酰胺。一种低毒的组合物也可包含组合物，条 件是所述组合物不含二甲亚砜(DMSO)，或条件是所述组合物含有小于lO^j^id^、或小 于1%、或小于0. 5%、或小于0. 1%、或小于0. 05%、或小于0. 01%的DMSO。在本发明的一方面，可根据极性非质子溶剂的Hansen溶度参数，来选择用于本 发明的合适极性非质子溶剂。例如，合适的极性非质子溶剂可具有的分散溶度参数介于 17. 7-22. OMPa172之间，极性溶度参数介于13_23MPa"2之间，氢键溶度参数介于3-13MPa"2 之间。依据本发明的一方面，用于本发明的合适极性非质子溶剂是环状化合物。环状化 合物具有环状基本结构。实例包括本文所公开的环状化合物。在其它实施方案中，所述极 性非质子溶剂可选自下式1-4:
权利要求
1.一种杂交组合物，所述组合物包含(a)检测染色体畸变相关核苷酸序列的第一分子探针，(b)足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂，和(c)杂交溶液，其中所述核苷酸序列是染色体畸变的标记，而且其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚 砜(DMSO)。
2.权利要求1的杂交组合物，其中所述染色体畸变是非整倍性、潜在断点、插入、倒位、 缺失、重复、基因扩增、重排或易位。
3.权利要求1-2的杂交组合物，其中所述染色体畸变与先天性遗传疾病、癌症或感染 相关。
4.权利要求3的杂交组合物，其中所述染色体畸变与癌症相关。
5.权利要求4的杂交组合物，其中所述第一分子探针检测ALK、BCL2、BCL3、BCL6、 BCL10、BCL12、BCR、CCNDl、E2A、EGFR、ETV6、FIPlLl、HER2、IGH、IGK、IGL,MALTUMLL(ALL-1、 HTRXUHRX)、MYC(c-Myc)、PAX5、PDGFRA、PDGFRB、SIL、TCF3(E2A、ITF1)、TCL1A、TCRAD、TCRB、 TCRG、端粒、TLX1、TLX3 (H0X11L2、RNX)或 T0P2A。
6.权利要求1-4中任一项的杂交组合物，其中所述第一分子探针检测选自以下的非血 液病的靴标BASE、BRCAU CCNDU CCNEU DCD、E2F3、n-MYC/MYCN、C0X-2/PTGS2、LRIGU ER a、hTERT、MLN64/STARD3、PGR、SNAI1、SRC、TOPl、TUBBl、AIBl、DLC-I、EDD、Pip4k2b/5k、Sil、 TBX2, c-Kit, VEGF, VCAM-U Tie-U Ts/TYMS、PSMA, PSA、PAP、P15、P16、BCLU BCL2, MTOR、 TIMP1、ESR1、PTEN、MDM2/CDK4、MET、C-MET、ERB1、FGFR1、IGF1R、NET、FGFR3、ABCB1、TMPRSS2、 BRCA2、T0P2B、ERCCl、AKTl、AKT2、AKT3、HRAS, NRAS, RAF1、HER3、HER4、ENTl、RRMl、RRM2、 RRM2B、PIK3CA、AURK4、AURKB, AURKC, MAPT/tau、TTBKl、TUBB, VEGFR、CCND3、CDK6、CDK2、 CDC2、HDAC, ESR2、SCUBE2、BIRC5、FASN、DHFR、TP/ECGF1、TYMP, DPYD, TKl、HMGIC、ABCA2、 ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、MVP、ATP7A、ATP7B、SLC29A1、SLC28A1、 SLC19A1、TUBB4、TUBA、MAP4、MAP7、STMNl、KIF5B、HSPA5、PSMD14, FPGS, GSTPU GPX, GCLC, GGT2、MT、AKR1B1、HMGB1、HMGB2、XPA、XPD、MSH2、MLH1、PMS2、APEX 1、MGMT、GLO1、RB1、GML、 CDKN1A、CDKN2A、CDKNlB, ERBB2、KRAS2、ITGBl、JUN、FOS, NFKBl、TP53、TP73、BCL2L1、MCL1、 BAX、BIRC4、TNFRSF6、CASP3、CASP8、HSPBl、MALATl(a )t(ll；19) (qll；ql3. 4)、MHLBlt(11； 19) (qll ；ql3. 4)、COLlAlt (17 ；22) (q22 ；ql3)、PDGFB t(17 ；22) (q22 ；ql3)、FKHR t (2 ； 13)&t(l ；13)、ETV6t(12 ；15) (pl3 ；q25)、NTRK3t(12 ；15) (pl3 ；q25)、TLS/FUSt(12 ；16) (ql3 ；pll),CHOP t(12 ； 16)(ql3 ；pll),EffS t(12 ；22)(ql3 ；ql2)、EWS/FLIlt(11 ；22) (q24 ； ql2)和 FLIltdl ；22) (q24 ；ql2)。
7.权利要求1-4中任一项的杂交组合物，其中所述第一分子探针检测选自以下的血 液病的靴标:ABL t(9 ；22) (q34 ；qll)、PRDM16del (1ρ36. 32) del (21q22. 12)、RUNX1/AML1 del(lp36. 32) del (21q22. 12)、CEP8、PDGFRB、NUP98、FGFRl、ASS、ETO t (8 ；21) (q22 ；q22)、 AMLlt (8 ；21) (q22 ；q22)、CBFbeta inv(16) (pl3q22)t(16 ；16) (pl3 ；q22)、MYHllinv (16) (pl3q22)t(16 ；16) (pl3 ；q22)、AF9t (9 ；11)、PML t(15 ；17) (q22 ；q21)、PLZF t(ll ；17) (q23 ；q21)、NuMA t(ll ；17) (ql3 ；q21)、NPMt (5 ；17) (q23 ；ql2)、RAR α t(15 ；17) (q22 ； q21)t(ll ；17) (q23 ；q21)t(ll ；17) (ql3 ；q21)t(5 ；17) (q23 ；q21)、EVIlt(3 ；v) (q26 ；v)、GR6t (3 ；3) (q21 ；q26) ,RPNlt (3 ；3) (q21 ；q26)、DEK t (6 ；9)、CAN t (6 ；9) ,MLFlt (3 ；5)(...； q23)、FUS t(16 ；21)、ERG t(16 ；21)、NUP98t (7 ；11), H0X9At (7 ；11), M0Z/MYST3t (8 ；16) (pll ；pl3)、CBP t(8 ；16) (pll ；pl3)、p300t(8 ；22) (pll ；ql3)、TIF2/GRIP-l/NCoA_2inv(8) (pllql3)、MKLl、PBXlt(l ； 19) (q23 ；ρ13· 3) +var.、ABL t (9 ；22) (q34 ；qll)、AF4/AFFlt (4 ； 11) (q21 ；q23)、AMLl/RUNXlt (12 ；21) (pl3 ；q22)、IL3 t (5 ； 14) (q31 ；q32)、HLF t(17 ； 19)、IKZFldel (7) (ρ12· 2)、CDKN2A/CDKN2B del (9) (ρ21· 3)、TAL 11ρ32 畸变、LM02t(ll ； 14) (pl3 ；qll)+var.、LMOlt (11 ；14) (pl5 ；qll)、HOXllt (10 ；14) (q24 ；qll)+var.、 TAL2t (7 ；9) (q34 ；q32)、TANlt (7 ；9) (q34 ；q34)、CEP12、ATM、D13S25、D13S319、TP53、P53、 TNFAIP3del (6) (q23. 3_q24. 1)、CDK6BCLlt(ll ； 14) (ql3 ；q32)+var.、IRF4t (6 ； 14) (p25 ； q32)、C-MAF t(14 ； 16) (q32 ；q23)、FGFR3t (4 ； 14) (pl6 ；q32)、MUM2/3t(l ； 14) (q21 ；q32)、 NPM t(2 ；5) (p23 ；q35)、ASS、RBl 和 ATM。
8.权利要求1-4中任一项的杂交组合物，其中所述第一分子探针检测选自以下的着 丝粒CEP1、CEP2、CEP3、CEP4、CEP5、CEP6、CEP7、CEP8、CEP9、CEPlO、CEPll、CEP12、CEP13、 CEP14、CEP15、CEP16、CEP17、CEP18、CEP19、CEP20、CEP21、CEP22、CEP23、CEP X 和 CEP Y。
9.权利要求4的杂交组合物，其中所述癌症是肾上腺皮质癌、膀胱癌、脑癌、烧伤癌、 乳癌、宫颈癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、胃 癌、胶质瘤、血癌、头颈部癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前 列腺癌、成视网膜细胞瘤、肉瘤、皮肤癌(非黑素瘤)、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。
10.权利要求9的杂交组合物，其中所述癌症是乳癌，所述第一分子探针检测HER2。
11.权利要求9的杂交组合物，其中所述癌症是结直肠癌，所述第一分子探针检测 EGF2。
12.权利要求4的杂交组合物，其中所述癌症是造血系统恶性肿瘤。
13.权利要求12的杂交组合物，其中所述第一分子探针检测选自以下的染色体畸变 t(l ； 14) (q34 ；qll)、t(l ；19) (q23 ；pl3)、t(2 ；5)、t(2 ； 18) (ql2 ；q21)、t(2 ；8)、t (4 ；11)、 t(4 ；11) (q21 ；q23)、t(6 ；11) (q27 ；q23)、t(7 ；22) (p22 ；ql2)、t(8 ；14)、t(8 ；22), t (9 ；11) (p22 ；q23)、t (9 ；22) (q34 ；qll)、t(10 ； 14) (q24 ；qll)、t(ll ； 14)、t(ll ； 14) (pl3 ；qll)、 t(ll ； 19) (q23 ；pl3)、t(14 ；18) (q23 ；q21)、t(14 ；18)、t(18 ；22) (q21 ；qll)和 t(21 ；22) (q22 ；ql2)。
14.权利要求1-13中任一项的杂交组合物，所述组合物还包含第二分子探针。
15.权利要求14的杂交组合物，其中所述第二分子探针检测参考序列。
16.权利要求15的杂交组合物，其中所述参考序列是着丝粒序列。
17.权利要求16的杂交组合物，其中所述分子探针在权利要求8中定义。
18.权利要求14的杂交组合物，其中所述第一分子探针和所述第二分子探针检测侧接 一个或多个潜在断点的序列或在所述潜在断点内的序列。
19.权利要求14-18中任一项的杂交组合物，所述组合物还包含第三分子探针。
20.权利要求1-19中任一项的杂交组合物，其中所述第一分子探针是DNA探针、PNA探 针或LNA探针。
21.权利要求14-20中任一项的杂交组合物，其中所述第二分子探针是DNA探针、PNA 探针或LNA探针。
22.权利要求19-21中任一项的杂交组合物，其中所述第三分子探针是DNA探针、PNA 探针或LNA探针。
23.权利要求1-22中任一项的杂交组合物，其中所述分子探针还包含标记。
24.权利要求23的杂交组合物，其中所述标记是生色团、荧光团、生物素、DIG、抗体-半 抗原、染料或酶。
25.权利要求I-M中任一项的杂交组合物，其中所述杂交组合物中的极性非质子溶剂 浓度范围以体积计为至95%。
26.权利要求1-25中任一项的杂交组合物，其中所述杂交组合物中的极性非质子溶剂 浓度范围以体积计为5%至10%。
27.权利要求1-25中任一项的杂交组合物，其中所述杂交组合物中的极性非质子溶剂 浓度范围以体积计为10%至20%。
28.权利要求1-25中任一项的杂交组合物，其中所述杂交组合物中的极性非质子溶剂 浓度范围以体积计为20%至30%。
29.权利要求1- 中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂是无毒的。
30.权利要求中1- 任一项的杂交组合物，前提条件是所述杂交组合物不含甲酰胺。
31.权利要求1-30中任一项的杂交组合物，前提条件是所述杂交组合物含有小于10% 甲酰胺。
32.权利要求1-31中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂具有内酯、砜、亚 硫酸、腈和/或碳酸官能团。
33.权利要求1-32中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂的分散溶度参数 范围为17. 7MPa1/2至22. OMPa172,极性溶度参数范围为13MPa1/2至23MPa1/2，氢键溶度参数范 围为 3MPa1/2 至 13MPa1/2。
34.权利要求1-33中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂具有环状基本结构。
35.权利要求1-34中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂选自
36.权利要求1-35中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂选自乙酰苯胺、R1-C^N其中X为0，Rl为烷基二基，和
37.权利要求1-35中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂选自
38.权利要求1-35中任一项的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂是
39.权利要求1-38中任一项的杂交组合物，所述组合物还包含至少一种选自以下的额 外组分缓冲剂、盐、促进剂、螯合剂、去垢剂和封闭剂。
40.权利要求39的杂交组合物，其中所述促进剂是硫酸葡聚糖，所述盐是氯化钠和/或 磷酸钠。
41.权利要求40的杂交组合物，其中硫酸葡聚糖浓度是5%至40%，氯化钠浓度是OmM 至1200mM，和/或磷酸钠浓度是OmM至50mM。
42.权利要求41的杂交组合物，其中硫酸葡聚糖浓度是10%至30%，氯化钠浓度是 300mM至1200mM，和/或磷酸钠浓度是5mM至20mM。
43.权利要求39的杂交组合物，其中所述促进剂选自甲酰胺、甘油、丙二醇、1，2_丙二 醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇，所述缓冲剂是柠檬酸缓冲剂。
44.权利要求43的杂交组合物，其中甲酰胺浓度为0.1_5%，甘油、丙二醇、1，2_丙二 醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇的浓度为0. 至10%，柠檬酸缓冲剂浓度为ImM至
45.权利要求39的杂交组合物，其中所述封闭剂选自人类总DNA、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA和小牛胸腺DNA。
46.权利要求45的杂交组合物，其中所述人类总DNA、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA和小 牛胸腺DNA的浓度是0. 01-10 yg/μ L·
47.权利要求1-46中任一项的杂交组合物，所述组合物包含40%的至少一种极性非质 子溶剂、10%硫酸葡聚糖、300mM氯化钠和5mM磷酸钠。
48.权利要求1-46中任一项的杂交组合物，所述组合物包含15%的至少一种极性非质 子溶剂、20%硫酸葡聚糖、600mM氯化钠、IOmM磷酸钠和0. 1 μ g/μ 1人类总DNA。
49.权利要求1-46中任一项的杂交组合物，所述组合物包含15%的至少一种极性非质 子溶剂、20%硫酸葡聚糖、600mM氯化钠、IOmM柠檬酸缓冲剂pH 6. 2和0. 1 μ g/μ 1鲱鱼精 子DNA、或鲑鱼精子DNA、或小牛胸腺DNA、或0. 5%甲酰胺、或1 %乙二醇、或1 % 1，3_丙二 醇、或甘油。
50.权利要求1-49中任一项的杂交组合物，其中所述含水组合物在室温下包含不止一相。
51.一种包含权利要求1-41中任一项的组合物的试剂盒。
52.一种试剂盒，所述试剂盒包含(a)检测染色体畸变相关核苷酸序列的第一分子探针，和(b)包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交组合物，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。
53.权利要求51或52的试剂盒，所述试剂盒还包含显色剂。
54.权利要求51或52的试剂盒，其中所述试剂盒经设计用于细胞学。
55.权利要求51或52的试剂盒，其中所述试剂盒经设计用于组织学。
56.权利要求52的试剂盒，其中所述极性非质子溶剂按照权利要求25-38中任一项的 定义。
57.权利要求51-56中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒经设计用于FISH或CISH实验。
58.一种检测染色体DNA中的靶标的方法，所述方法包括 -提供与染色体DNA中的靶标杂交的至少一种分子探针， -提供染色体DNA，-提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交组合 物，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)，-将所述分子探针、所述染色体DNA和所述杂交组合物混合在一起，其时间至少足以使 所述分子探针与所述靶标杂交，和 -检测所述靶标。
59.一种确定核酸序列中染色体畸变存在的方法，所述方法包括 -提供至少一种分子探针，-提供所述核酸序列，-提供包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂的杂交组合 物，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)，-将所述分子探针、所述核酸序列和所述杂交组合物混合在一起，其时间至少足以使所 述分子探针与所述核酸序列杂交，和 -检测所述至少一种分子探针， -并确定染色体畸变的存在。
60.一种确定核酸序列中染色体畸变存在的方法，所述方法包括 -提供所述核酸序列，-提供包含至少一种分子探针和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非 质子溶剂的杂交组合物，-将所述杂交组合物用于所述核酸，其时间至少足以使所述分子探针与核酸序列杂交，和-检测所述至少一种分子探针，-并确定染色体畸变的存在，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。
61.权利要求58-60中任一项的方法，其中所述极性非质子溶剂按照权利要求25-38中 任一项的定义。
62.一种确定核酸序列中染色体畸变存在的方法，所述方法包括 -提供所述核酸序列，-将权利要求1-50中任一项的组合物用于所述核酸序列，其时间至少足以使所述分子 探针与核酸序列杂交，和-确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中。
63.权利要求58-62中任一项的方法，其中提供足够量的能量使所述第一和第二核酸 杂交。
64.权利要求63的方法，其中通过加热所述杂交组合物和核酸序列而提供能量。
65.权利要求64的方法，其中通过使用微波、热浴、加热板、加热线、珀耳帖元件、感应 加热或加热灯来进行所述加热步骤。
66.权利要求58-65中任一项的方法，其中所述核酸序列是双链的并且所述分子探针 是单链的，所述核酸序列是双链的并且所述分子探针是双链的，所述核酸序列是单链的并 且所述分子探针是单链的，或者所述核酸序列是单链的并且所述分子探针是双链的。
67.权利要求58-66中任一项的方法，其中所述变性和杂交步骤单独发生。
68.权利要求58-67中任一项的方法，其中所述杂交步骤包括所述杂交组合物、分子探 针和核酸序列的加热和冷却步骤。
69.权利要求58-68中任一项的方法，其中所述杂交步骤需要不到8小时。
70.权利要求69的方法，其中所述杂交步骤需要不到1小时。
71.权利要求58-70中任一项的方法，其中所述冷却步骤需要不到1小时。
72.权利要求71的方法，其中所述冷却步骤需要不到30分钟。
73.权利要求58-72中任一项的方法，其中所述核酸序列是在生物样品内。
74.权利要求73的方法，其中所述生物样品是组织样品。
75.权利要求58-74中任一项的方法，其中所述含水组合物在室温下包含一相。
76.权利要求58-74中任一项的方法，其中所述含水组合物在室温下包含多相。
77.权利要求76的方法，其中所述含水组合物的各层混合在一起。
78.权利要求58-77中任一项的方法，所述方法还包括封闭步骤。
79.—种诊断染色体畸变相关的先天性遗传疾病、癌症或感染的方法，所述方法包括 -提供来自受试者的组织样品，其中所述组织样品包含核酸序列，-按照实施方案58-78中任一项的方法，确定染色体畸变是否存在于所述核酸序列中，和-如果染色体畸变存在于所述组织样品中，则诊断所述先天性遗传疾病、癌症或感染。
80.组合物在杂交测定中的用途，所述杂交测定用于检测染色体畸变相关的核苷酸序 列，所述组合物包含检测染色体畸变相关核苷酸序列的分子探针和杂交组合物，所述杂交 组合物包含以体积计至95%的至少一种极性非质子溶剂。
81.权利要求1-50中任一项的组合物在权利要求80中的用途。
全文摘要
本发明提供用于检测染色体畸变相关核酸序列的组合物和方法。本发明可以例如在杂交中不用甲酰胺或减少对甲酰胺的依赖性。用于本发明的组合物包含含水组合物，其含有至少一个核酸序列和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂。
文档编号C12Q1/68GK102046808SQ200980119333
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者K·H·皮特森, S·H·马希森, T·S·普尔森 申请人:丹麦达科有限公司