用于有机酸生产的改良的酵母菌株的制作方法

专利名称：用于有机酸生产的改良的酵母菌株的制作方法
用于有机酸生产的改良的酵母菌株本发明涉及用酵母生产有机酸。更具体地，本发明涉及生产有机酸的酵母并涉及 通过过量表达一种或多种己糖转运蛋白的酵母生产有机酸的方法。
背景技术：
在食品和药学工业中广泛使用多种有机酸，并且有机酸作为化学工业的新结构单 元材料引起越来越多的关注(Werpy，T.和 G. Petersen，iTop Value Added Chemicals From Biomass. 2004，US Department of Energy :Oak Ridge TN)。特别地，如果它们通过环境友 好的发酵策略产生的话，则它们提供了对石油衍生的并因此是有限的结构单元材料的合理 的备选。此类有机酸的例子包括乳酸、柠檬酸、衣康酸和琥珀酸。用于此类方法的微生物包括细菌、丝状真菌和酵母。但是，此类方法具有许多不利 之处，特别地导致所需的长发酵期间和由于与高浓度杂质混合的低产物浓度而致的高的酸 纯化成本。成本是决定此种方法是否能真正用于结构单元生产的备选的至关重要的因素。因 此，人们寻找用微生物提高有机酸生产的生产性(productivity)的方法。增加生产性的一 个领域是增强生产菌株的强壮性。例如，具有低pH的培养基对于有机酸的生产是有利的，因为由此产生游离酸而非 阴离子形式，这通常降低纯化成本。但是，此种生产环境对微生物产生了高的应激培养基 是酸化的，从而细胞不得不积极地抵销跨质膜的增加的PH梯度。在低的外部pH时，有机酸 对细胞产生额外的应激，因为它们通过质膜扩散并酸化胞质。假定有这种应激，通过使用本 领域现有技术的话存在生产性的限制，因为微生物细胞最终将丧失生存力和代谢活性。抵销这种效应的一个可能性是分离更强壮的微生物菌株，即，在低pH能够改善生 存力和代谢活性的菌株。已提出了用于此类选择或分选策略的方法，例如US 20050112737 和 US 20070065899。事实上，用于增加生产性的许多方法依赖于假定生产环境(如酸应激)限制了生 产性，如之前所述。用于菌株改进的另一主要关注涉及产物形成率本身，这是从参与产物形 成的酶活性被增强的意义上来说的。通常增强的酶活性的例子包括重要的代谢途径如糖酵解，其通常提供用于生产有 机酸所需的中间体。但是，即使已知在酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，糖酵解流调 节的一个决定步骤是糖摄取，也就是将糖跨细胞膜转运，从未考虑将该事实用来在微生物 中提高有机酸生产的生产性。本发明涉及通过提高己糖摄取来提高微生物的有机酸生产性。已经显示在酿酒酵母(S. cerevisiae)中通过过量表达己糖转运蛋白能够改 善 CO2 和乙醇生产(EP0785275, US6159725, Perez 等人，2005，Guillaume 等人，2007，和 Gutierrez-Lomeli 等人，2008)。但是，从未描述过己糖摄取对用微生物进行有机酸生产的影响。糖摄取可以是微生物生产有机酸、特别是在低pH生产有机酸的限制因子似乎是难以相信的，但是令人吃惊的是，在酵母菌株中过量表达己糖转运蛋白可以如下所述改进 其有机酸生产性。在面包酵母中，至今已知20种基因编码类似于葡萄糖(己糖)转运蛋白或与己糖 摄取相关的蛋白质(HXT1至HXT17、GAL2、SNF3和RGT2)。已进行了许多不同的研究来确定 这些转运蛋白各自的特征(亲和性和能力(capacity))、以及构建缺失了一种或多种HXT基 因和不同组合的菌株、和最终构建组合了不同转运蛋白的亲和性和能力的嵌合蛋白。发明概述本发明的一个目的是提供用过量表达至少一种己糖转运蛋白的酵母生产有机酸 的方法。相对于不过量表达己糖转运蛋白的酵母菌株，至少一种己糖转运蛋白的过量表达 提高了有机酸的生产性。酵母菌株可能表达涉及目的有机酸生产的进一步的基因。在充分的培养基中通过 培养过量表达己糖转运蛋白的酵母生产有机酸，从而在培养基中积聚目的有机酸并随后通 过本领域已知的技术纯化至所需的程度。此外，我们显示通过己糖转运蛋白过量表达决定的糖酵解流的增加不仅对微生物 生产性而且对生物质累积可以具有积极的作用。相比背景酵母，所述现象可以是或多或少 明显的。附图简述

图1 在酿酒酵母GRF18U菌株中(过量)表达HXTl或HXT7基因。在用葡萄糖2% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。在上方图 中，将生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)、HXT1转化体(正方形、实线) 和HXT7转化体(三角形、实线)。在下方图中，对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(空心 符号)和乙醇生产(实心符号)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图2 在酿酒酵母CEN. Hi菌株中(过量)表达HXTl或HXT7基因。在用葡萄糖2% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。在左边， 将生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)，HXT1 (正方形、实线)转化体和 HXT7(三角形、实线)转化体。在右边，对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(空心符号)和 乙醇生产(实心符号)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图3 在酿酒酵母GRF18U(左图)或CEN. PK(右图)菌株中(过量)表达HXTl或 HXT7基因对于乙醇和生物质累积的影响给出了转化体相对于对照菌株在图1和2中描述的动力学的最大累积/生产计算 的生物质累积和乙醇生产的增加(表示为百分率)。图4. 1 在(过量)表达HXTl的GRF18U LpLDH转化的酿酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生产(空心符号)。在用葡萄糖5% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)和HXTl (正 方形、实线)转化体。对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。
图4. 2 在(过量)表达HXT7的GRF18U LpLDH转化的酿酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生产(空心符号)。在用葡萄糖5% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)和HXT7 (三 角形、实线)转化体。对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图5. 1 在(过量)表达HXTl的CEN. PK LpLDH转化的酿酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生产(实心符号)。在用葡萄糖5% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)，HXTl (正方 形、实线)转化体。对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图5. 2 在(过量)表达HXT7的CEN. PK LpLDH转化的酿酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生产(实心符号)。在用葡萄糖5% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)，HXT7 (三角 形、实线)转化体。对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图6. 1 (过量)表达多拷贝质粒中的HXTl基因和LpLDH基因的CEN. I3K酿酒酵母 菌株乙醇和乳酸生产(实心符号)。在用葡萄糖5% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)，和HXTl (正 方形、实线)转化体。对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图6.2 :(过量)表达多拷贝质粒中的HXT7基因和LpLDH基因的CEN. I3K酿酒酵母 菌株乙醇和乳酸生产(实心符号)。在用葡萄糖5% (w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D 660nm)，对于对照(圆圈、虚线)，和HXT7 (三 角形、实线)转化体。对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图7:在(过量)表达HXTl或HXT7基因的m850(酿酒酵母CEN.H(，pdc-，LpLDHa量表达)菌株中的乳酸生产。在250ml的四个带挡板的摇瓶中于含有4.5g/l CaCO3、无氨基酸且无 (NH4)2SO4YNB、lg/l脲、5g/l乙醇、和以葡萄糖9% (w/V)作为碳源的基本培养基中实施生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D 660nm,空心符号)，对于对照(圆圈、虚线)、 HXTl转化体(正方形、实线)和HXT7转化体(三角形、实线)。对于相应的菌株，测定了葡萄糖消耗(b，空心符号)和乳酸生产(C，实心符号)。阐述实施方案的描述在一个实施方案中，本发明涉及制备有机酸的方法，所述方法包括a.获得具有增加的己糖转运蛋白活性的重组酵母；b.在包含己糖的培养基中培养重组酵母，从而形成有机酸，和c.分离有机酸。本发明因此涉及产生有机酸的方法，通过在包含碳源的培养基中培养过量表达至 少一种与己糖摄取相关的基因的酵母菌株来产生有机酸。“在合适的培养基中培养酵母菌 株”的另一术语是“培养”酵母菌株。酵母可以在所选择的条件下生长是指例如通过660nm 处的光密度测定的生物质的量增加。在另一实施方案中，酵母菌株不在所选择的条件下生 长是指生物质不增加，但无论如何产生有机酸。己糖转运活性的提高是指己糖跨过质膜的转运率提高。这可以通过过量表达至少 一种己糖转运蛋白而实现。己糖转运蛋白因此是能够转运己糖的蛋白质。总己糖转运蛋白 活性的增加能够通过提高同源的己糖转运蛋白基因的表达或通过导入同源的或异源的己 糖转运蛋白基因的更多拷贝而实现。己糖转运蛋白活性的提高也可以通过表达或过量表达 调节己糖转运活性的基因来实现，优选地所述基因刺激己糖转运活性。应当注意的是，提高 己糖转运蛋白的能力而非提高其表达也在本发明的范围内。所生产的有机酸可以选自丙烯酸、乳酸、衣康酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、2，5-呋 喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、柠檬酸、葡糖二酸、谷氨酸、丙二酸、丙酸、葡糖酸、曲酸、 香豆酸、抗坏血酸、己二酸、乙酰丙酸或任一其它所需要的有机酸。在本发明的一个优选的实施方案中，除了己糖转运蛋白外，酵母菌株还过量表达 至少一种与生产有机酸相关的基因。例如，在一个实施方案中，酵母菌株表达己糖转运蛋白 和异源的乳酸脱氢酶基因，以使得酵母细胞产生乳酸。酵母菌株可以包含有利于有机酸生 产的进一步的遗传修饰。这些可以借助于基因重组技术或随机诱变或本领域已知的其它技 术导入。例如，前述的用于生产乳酸的酵母菌株优选地具有降低的丙酮酸脱羧酶活性，甚至 更优选的是敲除了任一丙酮酸脱羧酶活性。本发明中使用的用于生产有机酸的酵母菌株可以选自酵母的任一已知的属和 种。酵母例如由 N. J.W.Kreger-van Rij, "The Yeasts, "Vol. 1 of Biology of Yeasts, Ch. 2，A. H. Rose 禾口 J. S. Harrison 编著，Academic Press, London, 1987 所述。在一个实 施方案中，酵母的属可以是酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、 假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)Jii 巴利酵母属(Debaromyces)、拿逊酵母属(Nadsonia)、油脂酵母属(Lipomyces)、球拟 酵母属(Torulopsis)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、三角酵母属(Trigonopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、隐 求(Cryptococcus), ^.MM^M (Trichosporon) > ^Slgβ M (Aureobasidium) > 油脂酵母属(Lipomyces)、法夫酵母属(Phaffia)、红酵母属(Rhodotorula)、耶氏酵母属(Yarrowia)或许旺酵母属(khwarmiomyces)等。优选地，酵母选自酵母属、接合酵 母属或克鲁维酵母属。更优选地，酵母是酿酒酵母、拜耳接合酵母(Z.bailii)或乳酸克 鲁维酵母(K. lactis.)。在一个特别优选的实施方案中，酵母是酿酒酵母菌株GRF18U、 W303IB、BY4742 (Eurc^carf 登录号 Y10000)、CEN. PK 菌株 102-5B (MATa，ura3_52， his3-ll, leu2-3/112, TRP1, MAL2_8c， SUC2)禾口 113—1IC(MATa， ura3_52， his3_ll， TRP1, MAL2-8c, SUC2-Dr. P. Kotter, Institute of Microbiology, Johann Wolfgang Goethe-University, Frankfurt, Germany)> CEN.PK RWB837(MATa pdcl::IoxP pdc5::IoxP pdc6: :loxP ura3-52) (van Maris 等人，2004)、CEN. PK RWB876 和 CEN. PK m850 (Liu 和 Lievense 2005)或者拜耳接合酵母ATCC 60483 ；或者乳酸克鲁维酵母PM6-7A。酵母可以是单倍体或二倍体。在本发明的酵母菌株中欲过量表达的编码己糖转运蛋白基因的编码区可以自任 意来源分离。在一个实施方案中，己糖转运蛋白的编码区分离自酿酒酵母。应该指出的是， 如果编码区编码基本上同一于自生物体的细胞纯化的相同蛋白质的蛋白质序列，则编码区 是自该生物体“分离”的。优选地，将编码己糖转运蛋白的编码区以目的己糖转运蛋白在酵母中产生并基本 上有功能的方式掺入酵母中。此种酵母在文中可以被称为“功能性转化的”。功能性己糖转运蛋白有助于己糖的摄取。换句话说，己糖转运蛋白刺激己糖跨质 膜的转运。一旦自生物体的核酸提取出(“分离了”)编码区或通过化学手段合成了编码区， 可以将其制备用于转化入酵母并在酵母中表达。最小地，这涉及将编码区插入载体和可操 作地连接至在该载体上存在的并在酵母中是有活性的启动子。可以使用任一载体(整合型 的、染色体的或游离型的)。可以使用在目的宿主中有活性的任一启动子(同源的或异源的；组成型的、可诱 导的或阻抑型的)。此种插入可以涉及使用限制性核酸内切酶来在可操作地连接至启动子 是可能的所希望的位点处“打开”载体，然后将编码区连接至所希望的位点。根据需要，在 插入载体前，可以制备编码区用于目标生物体。这可以涉及改变在编码区中使用的密码子， 以更充分地匹配目标生物体的密码子使用；改变编码区中可能削弱编码区的转录或翻译或 者编码区的mRNA转录物稳定性的序列；或者添加或去除编码信号肽的部分(由编码区编码 的指导蛋白质至特定的位置(例如细胞器、细胞膜或细胞器膜，或胞外分泌)的蛋白质的区 域)，以及本领域已知的其它可能的制备等。不管编码区是否被修饰，当编码区插入载体，它可操作地连接至在酵母中有活性 的启动子。启动子如所知的那样，是能够指导邻近的编码区转录的DNA序列。如已经描述 的那样，启动子可以是组成型的、可诱导的或阻抑型的。组成型启动子持续地指导邻近的编 码区的转录。可诱导的启动子可以被添加至培养基的合适的诱导剂分子诱导，这取决于启 动子的身份。阻抑型启动子可以被添加至培养基的合适的阻抑剂分子阻抑，这取决于启动 子的身份。在一个实施方案中，启动子是组成型的。在一个进一步的实施方案中，组成型启 动子是酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子。包含可操作地连接至启动子的编码区的载体可以是质粒、粘粒或酵母人工染色 体，以及本领域已知的其它适于在酵母中使用的载体等。除了可操作地连接至启动子的编码区外，载体可以还包含其它遗传元件。例如，如果不期望将载体整合入酵母基因组，载体 可以包含复制起点，其允许载体传递至包含该载体(例如2 μ衍生的或ARS/CEN)的酵母的 子代细胞。如果期望将载体整合入酵母基因组，载体可以包含与酵母基因组中存在的序列 同源的序列，并且也可以包含促进整合的编码区。为了确定哪些酵母细胞是经转化的，载体 可以包含选择性标记或可筛选的标记，其赋予该酵母不同于未转化的酵母的表型，例如它 在包含对未转化的酵母致死的抗生素的培养基上存活或它代谢培养基的组分为未转化的 酵母不代谢的产物，以及其它表型等。此外，载体可以包含其它遗传元件，如限制性核酸内 切酶位点和一般在载体中存在的其它元件。在其中编码区可操作地连接至启动子的载体制备后，可以用该载体转化酵母 (即，可以将载体导入酵母群体的至少一个细胞)。酵母转化的技术是已经很好建立的，并 包括电穿孔、微射弹轰击和LiAc/ssDNA/PEG法等。转化的酵母细胞然后可以通过使用载体 上的可筛选的或选择性标记检测。应注意的是，短语“转化的酵母”具有与“重组酵母”实 质上相同的含义。转化的酵母可以是以转化技术接受了载体的酵母或可以是此种酵母的后 代。如果己糖转运蛋白是与宿主细胞同源的蛋白质，即其是天然存在于宿主细胞中的 蛋白质，宿主细胞中己糖转运蛋白的表达可以通过将天然的启动子序列与在宿主细胞中有 功能的另一启动子序列交换而调节.该目的可以例如通过用包含靶基因的同源序列、适于宿主细胞的目的酵母启动子 序列和选择性标记的重组DNA分子转化宿主细胞以允许定点重组而实现。应发生定点重组 以可操作地连接(重组的)酵母启动子序列和编码己糖转运蛋白的核苷酸序列。这导致己 糖转运蛋白从(重组的)酵母启动子序列而非天然的启动子序列表达。所选择的酵母启动 子可以相对于天然的启动子序列具有提高的启动子活性，导致己糖转运蛋白在宿主细胞中 的提高的表达。在已经获得重组酵母后，可以将酵母在培养基中培养。可以培养酵母的培养基可 以是本领域已知的适用于该目的的任一培养基。培养技术和培养基是本领域熟知的。在一 个实施方案中，可以在合适的容器中通过含水发酵实施培养。用于酵母发酵的一般容器的 例子包含摇瓶或生物反应器。通过酵母的有机酸生产方法可以以恒化器、分批培养、或补料分批培养、或任一已 知的培养类型实施。在一个优选的实施方案中，在低PH进行培养，以利于有机酸的纯化。优选地，培养 基的PH在培养开始或结束时或在这两个时刻小于4，甚至更优选地pH小于3，和甚至更优 选地pH小于2. 5。培养基可以包含D-葡萄糖或其它糖类(糖)如己糖或戊糖。它还可以包含酵母 生长所需的任一其它组分。D-葡萄糖可以是但无需是酵母生长所需的组分，它可以仅是有 机酸生产的前体。优选地，作为用于有机酸生产的前体的糖的浓度在培养开始时高并在结 束时低。优选地，糖浓度在开始时大于70g/l，甚至更优选地大于100g/l，甚至更优选地大 于150g/l。优选地，糖在培养期间完全地被消耗掉，从而在培养结束时优选的浓度是小于 10g/l，优选地小于5g/l，甚至更优选地小于lg/1。培养基可以包含非D-葡萄糖的碳源，如蔗糖、果糖、乳糖、D-半乳糖或植物性物质的水解产物等。在一个实施方案中，培养基也可以包含作为有机或无机分子的氮源。在一 个进一步的实施方案中，培养基也可以包含下列组分，如氨基酸；嘌呤；嘧啶；玉米浆；酵母 提取物；蛋白水解产物；水溶性维生素，如B族复合维生素；或无机盐如氯化物、氢氯化物、 磷酸盐，或Ca、Mg、Na、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Si的硫酸盐，等等。也可以包括本领域技 术人员已知的在酵母培养或发酵中有用的其它组分。培养基可以是但无需是缓冲的。在发酵期间，D-葡萄糖通过许多步骤被酵母内化并转化成有机酸。所产生的有机 酸可以在酵母中收集或者可以通过分泌或者通过导致有机酸穿过质膜转运的其它途径而 积聚在培养基中。基本培养基是本发明的用于有机酸生产的优选培养基；特别优选的培养基包含 D-葡萄糖和YNB。在培养进行了足够长的时间来产生所需浓度的有机酸后，可以分离有机酸。在谈 及有机酸时使用的“分离的”是指通过从酵母的或培养基的至少一种其它组分分离有机酸 而获得的更大纯度的状态。优选地，分离的有机酸是至少约90%纯，更优选地约95%纯，甚 至更优选地至少约99%纯。在酵母从培养基分离后分离有机酸的第一步可以是通过化学或酶处理、用玻璃 珠处理、超声处理、冷冻/熔化循环或其它已知的技术来裂解酵母。可以从酵母裂解物的 膜、蛋白质和核酸级分通过合适的技术纯化有机酸，如离心、过滤、微过滤、超滤、纳膜过滤、 液-液提取、结晶、用核酸酶或蛋白酶的酶处理、或层析等。分离积聚在培养基中的有机酸可以包括从培养基纯化有机酸。可以通过已知的技 术进行纯化，如使用离子交换树脂、活性碳、微过滤、超滤、纳膜过滤、液-液提取、结晶、蒸 馏或层析等。优选地酵母在培养步骤期间在培养基中积聚有机酸，优选地有机酸的浓度是稳定 的或允许增加。在本发明的一个实施方案中，在培养基中积聚大于10g/l有机酸。在一个更优选 的实施方案中，积聚了大于30、50、70、90或110g/l有机酸。在本发明的一个优选的实施方案中，提高己糖转运活性的基因选自己糖转运蛋白 基因或编码影响己糖转运的蛋白质的基因。己糖转运蛋白基因优选地分离自酿酒酵母。甚至更优选地，欲在酵母中过量表达 的己糖转运蛋白基因选自 HXTl、HXT2、HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、 HXTl 1、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、HXT17、GAL2。影响己糖转运的蛋白质可以是调节子或葡萄糖传感物或合适地表达己糖转运蛋 白所需的基因。编码影响己糖转运的蛋白质的基因优选地分离自酿酒酵母和甚至更优选地 选自 SNF3、GSF2 和 RGT2。在本发明的另一实施方案中，己糖转运蛋白基因包含一个序列，所述序列与选自 SEQ ID NO 6或7的序列同一或相应并具有选自SEQ ID NO 6或7的序列的功能特性，或包 含任一前述序列的功能等同变体。在本发明的另一实施方案中，除了第一己糖转运蛋白之外，在酵母中还过量表达 第二己糖转运蛋白。本发明提供了具有改进的有机酸生产率的重组酵母。为了构建此种酵母，将至少一种DNA构建体导入酵母，其中所述DNA构建体包含编码利于摄取己糖的蛋白质的至少一 种基因，由此编码利于摄取己糖的蛋白质的基因功能性表达。优选地，重组酵母包含至少一 种进一步的重组基因，所述进一步的重组基因编码与目的有机酸生产有关的蛋白质。本发明的一个实施方案是在培养基中积聚有机酸和过量表达至少一种己糖转运 蛋白的酵母菌株。本发明的进一步的实施方案是通过重组酵母菌株来增加己糖摄取活性而改进有 机酸生产性的方法。活性可以如前所述增强，特别地通过过量表达一种或多种己糖转运蛋 白。为了更好地解释本发明，提供了下列定义。“糖转运蛋白”是指任一蛋白质(如酶)，其能够转运糖如葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯 糖穿过质膜。糖转运蛋白可以是显示该促进活性的12个跨膜结构域超家族的成员。“己糖转运蛋白，，是指任一蛋白质(如酶)，其能够转运己糖如葡萄糖或果糖穿过 质膜。己糖转运蛋白可以是主要的易化超家族的成员。对于酵母中的酿酒酵母，目前已描 述了 20种己糖转运蛋白和相关的蛋白质，即HXTl至HXT17、GAL2、SNF3和RGT2。“有机酸”是具有酸性特性的有机化合物(即分子中含碳的一大类化学化合物的任 一成员)。最常见的有机酸是羧酸，其酸性与它们的羧基-COOH相关。通常地，与强的无机 酸相比较，有机酸是弱酸并且不完全解离。有机酸的例子是醋酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、抗 坏血酸、己二酸。“野生型酵母”是指这样的酵母，当可遗传的遗传改变导入所述酵母基因组时，导 致产生突变酵母。重申的是，突变酵母菌株具有不同于其野生型菌株的基因型，因为在其基 因组已经导入了在野生型酵母菌株的基因组中不存在的某些突变、缺失或插入。因此，野生 型酵母菌株缺乏突变酵母菌株的基因组中存在的改变。在一些情况下，突变酵母菌株可以 具有不同于野生型菌株的表型。突变酵母菌株可以通过本领域已知的方法制备，包括那些 涉及同源重组、定点诱变或随机诱变的方法等。在某些情况下，突变酵母菌株可以通过涉及 自然选择的方法恢复。“重组酵母”是指这样的酵母，其含有不天然存在于酵母中的核酸序列或含有内源 核酸序列的一个额外拷贝或多个额外拷贝，其中通过人类的活动将所述核酸序列导入该酵 母或其祖先细胞。重组DNA技术是熟知的，如在Sambrook等人，Molecular Genetics =A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,其提供了关于本令页域已知的 多种技术的进一步的信息并在本文中讨论。在该实施方案中，同源的和/或异源的基因的 编码区分离自具有该基因的生物体。所述生物体可以是细菌、原核生物、真核生物、微生物、 真菌、植物或动物。包含编码区的基因材料可以通过任一已知技术提取自生物体的细胞。此后，可以 通过任一合适的技术分离编码区。在一个已知的技术中，编码区通过首先制备基因组DNA 文库或cDNA文库，和其次在该基因组DNA文库或cDNA文库中如通过所选的与编码区至少 部分同源的或认为与编码区至少部分同源的经标记核苷酸探针探测该文库而鉴定编码区， 确定编码区的表达是否赋予包含该编码区的文库微生物可检测的表型，或通过PCR扩增所 需的序列。也可以使用用来分离编码区的其它已知技术。“碳源”是指有机化合物(例如，成分确定的碳源如葡萄糖等)或有机化合物的混合物(如酵母提取物)，其可以被微生物(如酵母)同化并用来制造新的细胞材料。有机化 合物的混合物可以是复合碳源，其中确切的组分和/或有机组分的量是未知的，或者是由 已知的有机化合物(如葡萄糖、果糖、麦芽糖等)以已知的量组成的成分确定的碳源。在某 些情况下，复合碳源也可作为复合氮源。复合碳源的例子包括淀粉、麦芽糖糊精、纤维素水 解产物和淀粉水解产物等，其已经与酶组合以产生葡萄糖。成分确定的碳源优选地是至少 约90Wt%纯，更优选地约95wt%纯，和最优选地约98wt%纯。例如，如果葡萄糖是唯一碳 源，那么碳源将包含至少约90 %葡萄糖。如果葡萄糖和果糖是成分确定的碳源的组分，那么 至少约90%的碳源是葡萄糖和果糖。成分确定的碳源优选地包含最小量的高级糖。“生物质(biomass) ”是指从提供给细胞的营养物生物转化而衍生的全部细胞内容 物。“基本培养基”或“合成培养基”是指用于培养微生物(如酵母)的培养基，其包含 氮源、盐、痕量元素、维生素和碳源，它们都是定义的。碳源可以包含至少一种葡萄糖、蔗糖、 乳糖、麦芽糖、半乳糖或果糖等。基本培养基包含非蛋白质氮源。合成培养基不包含其组分 未定义的例如营养物源，如可以用在复合培养基中的玉米浆、酵母提取物或胨等。“在液体培养基中培养”是指在液体培养基中生长微生物和/或在液体培养基中微 生物产生的有机酸的持续积聚。“发酵肉汤”是指当微生物(如酵母)在液体发酵培养基中培养时产生的肉汤。发 酵肉汤包含液体发酵培养基的任一未使用的组分和生物体发酵所得的任一代谢物或产物。“恒化器”是指允许连续培养微生物(如酵母)的设备，其中能够独立地控制特定 的生长率和细胞数。连续培养实质上是恒容的流动系统，可以发生向其连续地添加培养基 和从其连续地取出任一溢流。一旦此种系统处于平衡状态，则细胞数和营养物状态保持恒 定，并且系统处于稳态。恒化器允许通过稀释率和改变限制的营养物如碳源或氮源的浓度 控制群体密度和特定的生长率。本领域已知恒化器可以用于选择微生物的突变体。当培养物在恒化器中生长时， 通过改变条件(如，降低接种菌株生长所必需的次级碳源的浓度等)，选择群体中那些在改 变的条件下能够生长得更快的微生物并舍弃在新的条件下不很好地发挥作用的微生物。通 常，此种选择需要在恒化器培养的生长过程期间累进地增加或降低至少一种培养组分。“分批培养”是指微生物的密闭培养，其中生长是在一个固定体积的培养基中进 行，培养基由正在生长的生物体的作用而连续地改变直到它不再适于生长。在分批培养中， 除了在需氧培养中的分子氧外，微生物生长所需的所有营养物在开始培养前就存在于培养 基中。本领域已知分批培养(如摇瓶)中微生物的延长培养可以用来选择在接种菌株不生 长或生长得差的条件下生长得相对较好的自发突变体。“补料分批培养”是指随着微生物的培养过程向培养容器或发酵桶中的培养基提 供一种或多种营养物的培养技术。与恒化器培养相反，在培养期间微生物被包含。在一些 情况下，将全部营养物逐渐地补料至发酵桶。时间条件、温度条件、PH条件、需氧条件和某 些营养物补料至发酵桶的速率取决于所使用的具体菌株。“生产性(productivity) ”是指从生产过程每单位时间衍生的产物的量。“选择”是指将酵母置于利于具有一个特定基因型或多个特定基因型的细胞生长 的条件下。特定的基因型(通常是基因突变的结果)赋予所选择的酵母在某些环境条件下的优势从而所选择酵母的后代能够生长和/或替代亲本。术语“基因”是指编码肽、多肽、蛋白质或RNA分子的和在编码序列侧翼的参与调 节表达的染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成的DNA或其它DNA。“突变”是指核酸序列中的任一变化或改变。存在几种类型的突变，包括点突变、移 码突变和剪接突变。突变可以特异地或随机地进行。“可读框(0RF)”是指编码肽、多肽或蛋白质的DNA或RNA的区域。术语“启动子”或“启动子区”是指DNA序列，其包括通过对RNA聚合酶和/或在 正确的位点起始转录所必需的其它因子提供识别位点而控制产生信使RNA(mRNA)的元件。“质粒”是指环状的、染色体外的、自我复制的DNA部件。术语“基因组”包含染色体和在宿主细胞内的质粒这两者。“载体”是小的DNA部件。载体像“分子运载体”那样发挥作用，其携带目的DNA片 段进入宿主细胞。可以将外源DNA片段插入载体，它们可以含有或不含有目的调节序列和 编码序列、能使得载体和插入其中的外源DNA片段复制的复制起点、允许选择已摄入质粒 DNA的细胞和其它特征的遗传标志。载体可以是质粒或线性DNA分子。“转录”是指从DNA模板产生互补RNA的过程。“翻译，，是指从信使RNA产生蛋白质。术语“表达”是指转录基因以产生相应的mRNA和翻译该mRNA以产生相应的基因 产物，即肽、多肽或蛋白质。
“过量表达”是指一个给定基因的表达水平大于野生型酵母中的表达水平。短语“功能性地连接”或“可操作地连接”是指启动子或启动子区与编码序列或结 构序列以编码序列或结构序列的转录可以被启动子或启动子区指导的方向和距离连接。“异源DNA”是指来自与接受细胞不同的来源的DNA。“同源DNA”是指来自与接受细胞相同的来源的DNA。实施例1 构建(过量)表达HXTl或HXT7基因的酿酒酵母(GRF18U和CEN. PK)菌 株转化体和对照菌株的细胞生长、葡萄糖消耗和乙醇生产。使用从GRF18U菌株提取的基因组DNA作为模板，PCR扩增酿酒酵母HXTl和HXT7基因。用于扩增的寡核苷酸如下5，HXTl (SEQ ID NO. 1)5' -AAA ATC ATG AAT TCA ACT CCC GAT CTA-3，Tm :58. 93，HXTl (SEQ ID NO. :2)5' -AGC TTG TTT AGT TTA TTT CCT GCTG AAA-3' Tm :59.35，HXT7 (SEQ ID NO. :3)5' -A AAA ATG TCA CAA GAC GCT GCT ATT GCA-3' Tm :62.43，HXT7 exit (SEQ ID NO. :4)5' -ATA TAT TAA AAA CGT ATT TAC TTT TCA AGT-3' Tm :54.23，HXT7 (SEQ ID NO. :5)5' -AGT GTC GAC AAA TAA TTT GGT GCT GAA CAT-3' Tm :61.0所有扩增使用下列程序
94。C5分钟94°C15秒157.5°C30秒\ 30个循环Il0C1分钟30秒JITQ7分钟4°CS由于酿酒酵母HXT6和HXT7基因的编码序列之间的高序列同源性，对后者以两步 扩增。在第一步使用名为5，HXT7和3，HXT7exit的寡核苷酸，第二个寡核苷酸针对该基因 的外部区设计，其来自不同于HXT6基因相应区域的区域。单一的扩增条带随后用作两条寡 核苷酸5，HXT7和3，HXT7的模板，获得了目的基因的唯一可读框。将扩增片段分别亚克隆入大肠杆菌载体pSTBlue获得了质粒pSTBlueHXTl和 pSTBlueHXT7。将插入片段测序并得到了与保藏的酿酒酵母相应的序列(HXT1，GeneID 856494，SEQ ID NO 6 ；禾口 HXT7, GeneID :851943, SEQ ID NO 7)相同的序列。这些编码序列分别用于构建整合型表达质粒ρ022ΗΧΤ1和p022HXT7，使用了基础 的酿酒酵母整合型表达质粒pYX022(R&DSystems，Inc.，Wiesbaden, D)。对于质粒ρ022ΗΧΤ1的构建，将接受载体用EcoRI切割，钝端化和去磷酸化，而插入 片段是从PSTBlueHXTl质粒用Mlul/Rnll切下的片段。对于质粒p022HXT7的构建，将接受 载体和pSTBlueHXT7载体用EcoRI切割。DNA操作、大肠杆菌(NovabIue，Novagen)的转化和培养使用下列标准方案 (Sambrook J. ^A Molecular Cloning :A Laboratory Manual，^!二片反，Cold Spring Harbor Laboratory, New York，1989)。如果没有另外指出的话，其它分子生物学基本方案 也遵循该手册实施。所有使用的限制性酶和修饰酶来自NEB(New England Biolabs,UK)或 来自 Roche Diagnostics。这两种酿酒酵母菌株的转化基本上按照LiAc/PEG/ss-DNA方案(Gietz. 2002)实 施。所获得的整合型质粒的转化受益于将它们在营养缺陷型标志HIS3中的线性化。将转 化体置于选择性基本培养基，并在30°C生长3-4天后获得单菌落。为了检查HXT过量表达的效果，将独立的转化体(用携带HXTl或HXT7基因 的质粒转化的转化体)和分别的对照在基本培养基(YNB，1. 34 % w/V YNB,来自Difco Laboratories, Detroit, MI#919-15,2% w/V葡萄糖，用尿嘧啶或者用尿嘧啶和亮氨酸补 充)中摇瓶培养。图1和2分别在左边显示了在GRF18U和CEN. PK菌株的生长动力学期间 的细胞密度(0D 660nm)并且在右边显示了葡萄糖消耗和乙醇累积。葡萄糖消耗和乙醇累 积使用来自Megazyme的可商业获得的酶试剂盒(目录号分别为K_G LUHKL和Κ-ΕΤ0Η)按 照生产商的说明书来确定。在动力学期间，在所示的时间处(见图1和2的“小时”)收集 样品并确定所述参数。所进行的实验清楚地显示了在糖酵解启动子控制下的己糖转运蛋白的一个额外 拷贝的存在决定了糖的更快摄取(这一点能够从图Ib和2b空心符号所示的葡萄糖消耗曲线来说明)和更快且更高的乙醇生产(图Ib和2b，实心符号)。引人注目地，所述的效果 在大于一种酵母背景中证实(图1和2)。令人吃惊的是，如假设的那样，尽管HXTl过量表 达达到了略微更高的效果，但更高的糖酵解流的效果似乎具有非常相似的独立于过量表达 的己糖转运蛋白的动力学。而且，非常有兴趣强调的是，取决于酵母背景，更高的糖酵解流 的效果不同地分布于发酵产物或生物质累积，如图3所示，其中比较了两种菌株。最后，值 得考虑的是，不仅乙醇生产和/或生物质形成改善了，而且特异的生产性也改善了，换句话 说，需要达到更高的生产值的时间降低。实施例2 构建表达来自植物乳杆菌(LactcAacillus ρlantarum)的异源LDH活 性和(过量)表达HXTl或ΗΧΤ7基因的酿酒酵母(GRF18U和CEN. PK)菌株转化体和对照 菌株的细胞生长、葡萄糖消耗、乳酸和乙醇生产。已经用ρ022ΗΧΤ1和ρ022ΗΧΤ7表达载体转化的酿酒酵母菌株(GRF18U和CEN. PK) 进一步用称为YcplllbTLDH的质粒转化。通过将LDH基因插入基础酿酒酵母着丝粒质粒 Ycplaclll (LEU2标志物，ACX75457)中的拜耳接合酵母TPI启动子控制下获得所述质粒。为 了获得所述质粒，将植物乳杆菌LDH基因事先PCR扩增并亚克隆入大肠杆菌载体pSTBlue， 得到 pSTplLDH 质粒(Microb Cell Fact. 2006 年 1 月 30 日；5:4. Lactate production yield from engineered yeasts is dependent from the host background, the lactate dehydrogenase source and the lactate export. Branduardi P, Sauer M, De Gioia L, Zampella G, Valli M, Mattanovich D, Porro D.)。将大肠杆菌构建体和基础拜耳接合酵 母着丝粒表达质粒pZ3bT (Branduardi等人，2004)用EcoRI切割，后者也被去磷酸化，以获 得酵母表达载体pZ3bTLDH。来自所述质粒的包含LDH编码序列和酵母启动子和终止子区的 表达盒用BamHI平端化/NaeI切割并插入Ycplaclll接受质粒，用SmaI打开和去磷酸化， 得到Ycp 11 IbTLDH着丝粒表达质粒，然后将其用于转化上述酵母菌株。对于每一背景，对照 菌株是用单一的LDH基因和用于HXT (过量)表达的空质粒转化的相应的酵母菌株。两种酿酒酵母菌株的转化基本按照LiAc/PEG/ss-DNA方案(Technical Tips Online, http://tto. trends, com)实施。将转化体置于选择性基本培养基，并在30°C生长 3-4天后获得单菌落。独立的转化体在基本培养基(YNB，1. w/V YNB，来自Difco Laboratories, Detroit，MI#919-15，5% w/V葡萄糖，图4. 1-4. 2和5. 1-5. 2)中摇瓶培养。在两种菌株中， LDH表达决定了转化酵母将发酵丙酮酸为乙醇和乳酸共表达HXT基因决定了发酵产物累 积上的改进。在下图中报告的实验指共表达植物乳杆菌LDH和酿酒酵母HXTl或HXT7基因。 图4和图显示不同克隆和构建体达到的细胞密度(0D 660nm)，其中图4和图5b、c和d 分别显示生长动力学期间葡萄糖消耗以及乙醇和乳酸生产(在所示的时间处收集样品，见 图中的“小时”)。葡萄糖消耗以及乙醇和乳酸生产使用来自Megazyme的可商业获得的酶 试剂盒(目录号分别为K-GLUHKL，K-ETOH和K-LATE)按照生产商的说明书确定。引人注目 地，也在这些实验中增加的葡萄糖消耗流导致更快和更高地生产发酵产物，在这种情况下， 天然产生的乙醇和所产生的乳酸受益于细菌LDH的异源产生。重要地是注意两个途径似乎 是竞争的，从而改变发酵方向的葡萄糖级分在乳酸和乙醇之间分步。实施例3 构建表达来自植物乳杆菌的异源LDH活性和(过量)表达HXTl或HXT7 基因的酿酒酵母(CEN.PK)菌株；转化体和对照菌株的细胞生长、葡萄糖消耗、乳酸和乙醇生产。在这个实施例中，将用多拷贝植物乳杆菌LDH转化的CEN. PK菌株的乳酸和乙醇生 产与用HXTl或HXT7基因的一个额外的拷贝获得的生产相比较。将细菌乳酸脱氢酶用EcoRI从前面提及的pSTpILDH中切下和插入类似切割 和去磷酸化的质粒P^(212(基础的酿酒酵母多拷贝表达质粒p^(212，LEU2标志物，R&D Systems, Inc. , Wiesbaden, D)中，得到表达质粒p2121pLDH。将源自酵母转化的独立转化体 在基本培养基(YNB, 1. 34% w/V YNB，来自 Difco Laboratories, Detroit, MI#919-15,5% w/V葡萄糖)中摇瓶培养。图6. 1和6. 2在左边显示在CEN. Hi转化的菌株的生长动力学期间的细胞密度(0D 660nm)和葡萄糖消耗，在右边显示乙醇和乳酸累积。葡萄糖消耗以及乙醇和乳酸累积使用 来自Megazyme (目录号分别为K-GLUHKL，K-ETOH和K-LATE)的可商业获得的酶试剂盒，按 照生产商的说明书确定。在动力学期间，在所示的时间处(见图6. 1和6. 2的“小时”)收集 样品并确定所述参数。引人注目地，在表达一个额外的HXTl拷贝时乙醇和乳酸生产改善， 而在表达一个额外的HXT7拷贝时乳酸生产的提高对应于乙醇生产的平行降低。而且，该最 后一个实施例是再一次明显的生产性提高，因为达到乳酸生产的最高值早于对照菌株。最 后，关于使用着丝粒质粒中表达的LDH进行的实验，能够注意到多拷贝质粒表达的LDH的效 果显著地更高效。实施例4:在(过量)表达HXTl或HXT7基因的m850(酿酒酵母CEN·PK，pdc-， LpLDH)菌株中的乳酸生产。转化具有完全损坏的丙酮酸脱羧酶活性和携带在多拷贝酵母表达质粒中的植物 乳杆菌LDH的光养CEN. 1 m850菌株，以表达HXTl或HXT7基因的一个额外的拷贝。为了获 得所述转化体，构建了携带仅用作目标基因的营养缺陷型标志物和用于有效选择转化体的 显性标志物的酵母整合型质粒。该质粒的骨架是基础的酿酒酵母整合型表达质粒P^(022， HIS3标志物(R&D Systems, Inc.，Wiesbaden, D)。所述质粒用KpnI切割，钝端化和去磷酸 化，并与衍生自质粒pFA6KanMX4 (Wach等人，1994) Sphl/Mcl钝端化的KanR盒连接，得到质 粒p022KMX4。将所述质粒EcoRI切割和去磷酸化或EcoRI切割、钝端化和去磷酸化，并分别 与HXTl和HXT7序列连接，如实施例1中所述制备。将所得的质粒分别称为P022KMX4-1和 p022KMX4-7o然后将m850菌株用这两种质粒以及用空质粒转化。然后测试独立的转化体的葡 萄糖消耗和乳酸生产(m850菌株不能产生乙醇，因为损坏了所有的pdc活性，并且由于同样 的原因，它们不能以葡萄糖作为碳源存活，但是它们可以在非发酵碳源如乙醇和甘油上存 活，其中所述非发酵碳源确实用于该菌株操作的所有时期)，如图7所示。转化体如下生长它们在含有1. 7g/l无氨基酸的酵母氮基(YNB)、10g/l乙醇和 10g/l甘油的琼脂板上繁殖。使用两种不同的液体培养基来培养菌株预接种培养基，含 有 0. 31g/l CaCO3,1. 7g/l 无氨基酸和无(NH4)2SO4 的 YNB, 1. 5g/l 脲，10g/l 乙醇，和 0. 5g/ 1葡萄糖；以及发酵培养基，含有4. 5g/l CaCO3,1. 7g/l无氨基酸和无(NH4)2SO4的YNB，Ig/ 1脲，5g/l乙醇，和90g/l葡萄糖，如所述。于在250ml的四个带挡板的摇瓶中进行分 批培养。从在琼脂板上生长的新鲜培养物中收获细胞，并以600nm(0D600)0. 3的光密度来 接种IOOml预接种培养基。24小时后收获这些细胞并以600nm(0D600) 3. O的光密度来接种IOOml发酵培养基。监测分批培养约70小时。在所示的时间处收集样品并测定OD 660nm(图7a)，同时测试上清中的葡萄糖消 耗(图7b)和乳酸生产(图7c)。引人注目地，己糖转运蛋白过量表达的效果导致更快的葡萄糖消耗(至少对于过 量表达一个额外HXTl基因拷贝的菌株)和随后发生的更快的该菌株中可能的唯一发酵产 物乳酸的生产，导致提高的生产性。该实验揭示了将之前在实验菌株中显示的应用于已对 工业生产研发和优化的菌株中的可能性。参考文献Branduardi P, Valli M, Brambilla L, Sauer M, Alberghina L, Porro D. (2004) 酵母拜耳接合酵母用于异源蛋白质生产、分泌和用于代谢工程应用的新宿主(The yeast Zygosaccharomyces bailii :a new host for heterologous protein production, secretion and for metabolic engineering applications)，FEMS Yeast Res. 4, 493-504。Gietz，R. D.和 R. A. Woods. (2002)通过 liac/ss 运载体 dna/peg 方法转化酵母 (Transformation of yeast by the liac/ss carrier dna/peg method)， Methods in Enzymology 350 :87_96。PereziM. ,LuyteniK.，Michel，R.，Riou，C. ,BlondiniB. (2005)在酒发酵期间分析 酿酒酵母己糖载体表达低和高亲和性Hxt转运蛋白均表达(Analysis of Saccharomyces cerevisiae hexose carrier expression during wine fermentation :both low—and high-affinity Hxt transporters are expressed)，FEMS Yeast Research 5，351_3610Guillaume C，Delobel P, Sablayrolles JM，Blondin B. 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权利要求
1.用于生产有机酸的方法，所述方法包括a)培养酵母菌株，所述酵母菌株i)过量表达至少一种糖转运蛋白，和 )在培养基中积聚有机酸，以及b)纯化有机酸。
2.根据权利要求1的方法，所述方法包括a.获得具有增加的糖转运蛋白活性的重组酵母；b.在包含糖的培养基中培养重组酵母，从而形成有机酸，和c.分离有机酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述糖转运蛋白活性是己糖转运蛋白活性，且所述 糖是己糖。
4.根据权利要求1-3的方法，其中重组酵母过量表达至少一种己糖转运蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所产生的有机酸选自乳酸、衣康酸、琥 珀酸、柠檬酸、马来酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中酵母菌株过量表达至少一种涉及有机 酸生产的进一步的基因。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中酵母菌株是酵母属(Saccharomyces)、 接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、或克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)的菌株。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中己糖转运蛋白基因选自HXT1、HXT2、 HXT3、HXT4、HXT5、HXT6、HXT7、HXT8、HXT9、HXT10、HXT11、HXT12、HXT13、HXT14、HXT15、HXT16、 HXT17、GAL2、SNF3、和 RGT2。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中积聚了大于10g/l有机酸。
10.根据权利要求8的方法，其中用于己糖转运蛋白的基因分离自酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0
11.酵母菌株，其在培养基中积聚有机酸和过量表达至少一种糖转运蛋白，优选地己糖 转运蛋白。
12.改善有机酸生产性的方法，所述方法由重组酵母菌株通过提高糖摄取活性，优选地 己糖转运活性而实施。
13.改善生物质生产的方法，所述方法通过提高糖摄取活性，优选地己糖转运活性而实施。
14.根据权利要求12的方法，其中己糖摄取活性的提高通过过量表达己糖转运蛋白而 引起。
全文摘要
本发明涉及用过量表达至少一种糖转运蛋白的酵母生产有机酸。酵母可以表达与目的有机酸生产相关的进一步的基因。有机酸通过在充分的培养基中培养过量表达糖转运蛋白的酵母而产生、从而在培养基中积聚目的有机酸和随后通过本领域已知的技术纯化至目的程度。
文档编号C12P7/56GK102046775SQ200980119260
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月27日 优先权日2008年5月28日
发明者D·波罗, M·绍尔, P·布兰多尔迪 申请人:米兰-比科卡大学