专利名称：选择方法ii的制作方法
选择方法11本发明涉及一种用于产生转化植物细胞的方法。更具体地说，该方法涉及用转化 盒CTransformation Cassette)转化植物细胞，其中所述转化盒靶向植物质体并且包含选 择基因，例如异戊烯基转移酶(IPT)，以及转基因。在选择转化质体以后，在植物细胞中诱导 重组酶的表达，其导致从质体切除选择基因以及在质体中表达转基因。本发明还提供了包 括转化盒的细胞和植物。在农业中基因修饰(GM)粮食作物的使用正快速增长，在2005年世界市场大约为 ￡140亿。然而，在科学家、政治家、监管机构以及大众中，日益关注有关通过花粉转基因从 GM作物扩散到其它植物物种从而产生所谓的“超杂草”的风险。在现在农业中所使用的所有商业GM作物具有包含转基因的工程核基因组，其中 所述转基因赋予所期望的性状如对疾病、昆虫、恶劣的环境条件的抗性，以及增加的维生素 含量、香味、以及贮存时间。然而，关于核转基因存在多种严重问题，包括基因沉默和低水平 的转基因表达。解决与核转基因有关的问题的一种方式是将转基因插入植物的质体基因组 中。质体是植物特有的细胞器。每个植物细胞包含大约100种质体，每种质体包含大 约100个基因组。这实际上意味着，与植物核转化相比，其中每个植物细胞将具有至多2-3 个拷贝的基因，当将基因插入到质体基因组中时，每个植物细胞包含大约10，000个拷贝的基因。相对于核基因表达，在质体中转基因的表达具有许多优点(i)转基因不会通过 花粉扩散；(ii)高水平表达蛋白质(高达总细胞蛋白的47%) ； (iii)由于质体节制，蛋白 质的“毒性”效应降低；(iv)多种基因的同时表达便于生化途径工程；以及(ν)消除了基因 沉默。质体基因工程具有明确的基础和适用的应用，因为潜在地在很小的环境风险下可以 高水平生产任何蛋白质，从而开辟了生产可食用疫苗、生物药品以及具有农艺价值的产品 的可能性。目前，用来选择质体(其已用转基因加以转化)的仅有的可靠的选择系统是基于 使用抗生素如壮观霉素(奇放线菌素，spectinomycin)。这样的选择系统的一个缺点在于， 它们还将选择对壮观霉素具有抗性的自发核糖体突变体。鉴于所涉及的时间尺度，这是一 个较大的问题。本发明是基于质体转化的选择和再生系统，其基于在质体中基因如异戊烯基转移 酶(IPT)基因(细胞分裂素生物合成)的过度表达。该系统便于用缺乏细胞分裂素(由于 在质体中的细胞分裂素生产)的培养基直接选择包含转化质体的细胞。因此该系统提供了 没有抗生素的选择和再生系统，该系统将克服与自发壮观霉素突变体有关的问题并关心在 GMO中抗生素抗性基因的使用。虽然IPT已先前在植物核转化中被用作选择性标记(例如EP 1069855A)，但先前 没有启示它用于质体转化。本领域技术人员将知道以下事实质体是在植物细胞内的半自 主性细胞器(具有它们自己的基因组和代谢)。尤其是，先前未表明，在质体中制备IPT前 体或产生的任何IPT能够扩散出质体而进入细胞质以引发细胞分裂素信号从而刺激枝条再生。因此，用于选择质体选择基因的标准不同于用于选择基因组选择基因的那些标准。由于以下事实，S卩，在成体植物中植物激素生物合成多肽的过度表达导致受损害 的发育，所以在已发生选择和最初再生以后优选除去植物激素生物合成基因。仅可以在除 去植物激素生物合成基因以后，才可能激活上述转基因(表达感兴趣的多肽)，使得还可以 消除在选择和再生期间由于转基因表达所引起的任何不利影响。在一种实施方式中，本发明提供了一种用于产生转化植物细胞的方法，该方法包 括以下步骤(i)用基因构建物(genetic construct)转化植物细胞，其中基因构建物包含旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件，其中第一和第二同源重组元件能够引导转化盒整合到存在于植物细胞中的至少 一种质体的基因组中，其中转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒(Excision Cassette),(c) 一种或多种转基因，(d)第一终止元件，其中切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件，(b2)可选的第二启动子(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，以及可选 地编码多肽的核苷酸序列，其赋予对抗生素的抗性，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别。在一些实施方式中，该方法另外包括以下步骤(ii)用缺乏一种或多种植物激素生物合成多肽或抗生素的培养基选择转化植物 细胞。在其它实施方式中，该方法另外包括以下步骤(iii)在植物细胞中表达重组酶，其中重组酶是识别第一和第二位点特异性重组 元件的重组酶。本发明的方法适合于可以被转化和再生的所有植物。所述植物可以是单子叶植物 或双子叶植物。合适的植物的实例是谷类(水稻、小麦、大麦、燕麦、高粱、玉米)、豆类(苜蓿、扁 豆、花生、豌豆、大豆)、油料作物(棕榈、向日葵、椰子、油菜、橄榄)、经济作物(棉花、甘蔗、 木薯)、蔬菜作物(马铃薯、番茄、胡萝卜、甘薯、甜菜、南瓜、黄瓜、莴苣(生菜)、花椰菜、花 椰菜、食荚菜豆、卷心菜(甘蓝)、芹菜、洋葱、大蒜)、水果/树木和坚果(香蕉、葡萄哈密瓜、 香瓜、西瓜、草莓、橘子、苹果、芒果、鳄梨、桃、葡萄柚、菠萝、枫、杏仁)、饮料(咖啡、茶、可可 粉)、以及木材树(栎树、黑胡桃、悬铃木)。其它合适的植物包括藓类和浮萍。优选地，植 物是烟草或生菜。
可以以任何方便的形式来使用待转化的植物细胞，例如，作为个别细胞、细胞群， 以分离(离解)形式或未分离(离解)形式，或作为植物组织或植物部分的一部分。优选 地，细胞存在于从完整植物除去的叶子中。优选使用主动生长的叶子。术语“质体”用来包括在真核植物的细胞质中发现的所有细胞器，其包含由双膜结 合的DNA，并发育自常见类型，即前质体。质体可以包含色素和/或贮存材料。质体的实例包括叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、色质体、油质体(造油体)以 及老年质体(成体质体)。优选地，质体是绿色质体，最优选叶绿体。如在本文中所使用的，术语“基因构建物”是指核酸分子，其包含规定的元件和盒。 基因构建物可以，例如，以载体或质粒的形式。它还可以包含其它元件，其使得它可以处理 和再生，如复制起点、选择元件、以及多克隆位点。通常，基因构建物将是双链核酸分子，优 选dsDNA分子。第一和第二同源重组元件是这样的重组元件，其能够引导转化盒整合到存在于植 物细胞中的至少一种质体的基因组中。在将基因构建物转化到植物细胞中以后，第一和第二同源重组元件与在所选质体 的基因组中的对应序列重组，导致转化盒插入到所选质体的基因组中。选择同源重组元件的核苷酸序列，使得转化盒特异性地靶向一种或多种所选质 体。尤其是，选择同源重组元件的核苷酸序列，使得没有或基本上没有转化盒被整合到植 物的核基因组或植物的线粒体基因组中。换句话说，同源重组元件的核苷酸序列优选是质 体特异性的，即，相应的序列并不存在于核基因组中并且优选并不存在于上述植物的线粒 体基因组中。这可以通过避免存在于植物的核基因组中以及可选地存在于线粒体基因组中 的序列来进行。通过标准方式，例如，通过核基因组的Southern印迹并借助于标记的序列 探针或通过序列分析，本领域技术人员将能够容易地检测特异性序列是否存在于核基因组 中。除了上述外，可以使用来自质体基因组的任何序列，只要所选的插入位点对于细 胞不是致死的，即，它并不导致细胞死亡。优选地，插入位点不在质体基因的编码区中。第一和第二同源重组元件的序列的取向应与质体基因组中的取向相同以便于有 效的同源重组。为了使转化盒靶向质体基因组，第一和第二同源重组元件的核苷酸序列必须相同 或基本相同于所选植物质体的基因组中的序列。在本发明的范围内，术语“基本上相同”是指第一和第二同源重组序列的核苷酸序 列独立地大于95 %，优选大于98 %或大于99 %以及特别优选100 %相同于在待转化的质 体中存在的序列。可以利用序列对比的Clustal方法并使用默认参数，例如KTUPLE UGAP PENALTY = 3、WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，来确定百分比序列同一性。类似地，第一和第二同源重组元件的核苷酸序列应优选不相同于或基本上相同于 在所选植物的核基因组中的序列。在该范围内，术语“基本上相同”是指第一和第二同源 重组序列的核苷酸序列独立地小于50%，更优选小于70%或小于90%相同于在待转化植 物的核基因组中存在的序列。可以利用序列对比的Clustal方法并使用默认参数，例如 KTUPLE UGAPPENALTY = 3、WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，来确定百分比序列同 一性。
优选地，第一和第二同源重组序列的长度将各自独立地是50-2500、50-2000、 50-1500或50-1000个核苷酸，更优选长度约150、约1000或约1200个核苷酸。在质体基因组中，第一和第二同源重组序列之间的距离可以是0-4000个核苷酸 或更多。优选地,距离是约1-100、100-500、500-1000或1000-3000个核苷酸。存在于第一和第二同源重组之间的遗传元件(即，遗传元件(a)-(d))的总长度优 选少于4000个核苷酸。优选地，第一同源重组序列是烟草(Nicotiana tabacum)(登录号Z00044)叶绿 体基因组DNA的核苷酸104091-105380 ；和/或优选地，第二同源重组序列是烟草(登录号 Z00044)叶绿体基因组DNA的核苷酸105381-106370。在另外的其它实施方式中，第一同源重组序列优选是烟草(登录号Z00044)叶绿 体基因组DNA的核苷酸1(^925-101857 ；和/或第二同源重组序列是烟草(登录号Z00044) 叶绿体基因组DNA的核苷酸100933-100130。转化盒启动子(a)必须是在所选植物质体中可操作的转化盒启动子。该启动子是 这样的启动子，其能够在已切除所述切除盒以后引发转基因的转录；以及能够在切除盒并 不包含自己的启动子的情况下引发编码植物激素生物合成多肽的核苷酸序列的转录。该启 动子可以，例如，是来自植物或细菌基因的启动子。优选地，启动子是植物特异性的。合适的启动子的实例包括PpsbA、RbcL以及ftrri启动子。优选地，启动子是ftrn启动子(例如，质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303,登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。其它优选的启动子包括ftrn-rbcl-ds启动子构建物，如图M以及其图例所示； Prrn-atpB-ds启动子构建物，如图25以及其图例所示；以及ftrn-T7glO启动子构建物，如 图沈以及其图例所示。在一些实施方式中，启动子是可诱导启动子。这便于选择基因的可诱导的、受控表 达。例如，可诱导启动子可以是通过IPTG可诱导的，例如ftrnL启动子。其它可诱导启动 子包括通过光、黑暗、乙醇、干旱、金属、病原体、生长调节剂、热、冷、半乳糖以及其它糖可诱 导的那些可诱导启动子。可替换地，启动子是高表达水平启动子。切除盒包括第一位点特异性重组元件；可选地，第二启动子；编码植物激素生物 合成多肽的核苷酸序列；终止序列；以及第二位点特异性重组元件。第一和第二位点特异性重组元件是核苷酸的序列，其能够被位点特异性重组酶识 别和/或结合，其中所述位点特异性重组酶是通过重组酶所产生的。位点特异性重组元件 必须旁侧切除盒中的遗传元件，例如元件(b2)(如果使用的话)、(b3)、(b4)、任何其它所期 望的元件。第一和第二重组元件的序列将彼此相同或基本上相同；并且将相对于彼此处于 相同取向(例如，均为5' -3'或均为3' -5')。当重组酶是Cre时，位点特异性重组序列优选为Iox序列。位点特异性Iox重组 位点是34bp序列；这些重组位点作为用于Cre重组酶多肽的结合位点。野生型Iox序列是 优选的(^10 J, Niu Qff, Moller SG，Chua NH (2001) Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. Nat. Biotechnol. 19,157-161.)。切除盒启动子(当存在时)必须是在所选的植物质体中可操作的启动子。该启动 子是能够引发植物激素生物合成基因的转录的启动子。该启动子可以是来自植物或细菌基因的启动子。优选地，启动子是植物特异性的。合适的启动子的实例包括I^sbA、RbcL以及 Prrn启动子。优选地，启动子是ftrn启动子(例如，质体核糖体RNA (rrn)操纵子启动子 (nt 59034-59303,登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。植物激素生物合成多肽作为选择标记，从而便于选择已用转化盒转化的植物细 胞。植物激素生物合成多肽可以是任何多肽，其涉及植物细胞分裂素或植物生长素或其它 植物生长调节剂的合成，或其调节植物细胞分裂素或植物生长素或其它植物生长调节剂的 生产或代谢。优选地，存在编码1、2、3、或4个植物激素生物合成多肽的核苷酸序列。编码植物 激素生物合成多肽的核苷酸序列可以存在于操纵子中，并具有单个可选的启动子和终止元 件。可替换地，植物激素生物合成多肽核苷酸序列可以各自具有它们自己的启动子和终止 元件。进一步的选项是，存在编码植物激素生物合成多肽的两个或更多的核苷酸序列，作为 融合蛋白，可选地具有连接蛋白的短接头序列(例如，编码1-10个氨基酸接头序列，例如聚 甘氨酸接头)。在其它实施方式中，编码植物激素生物合成多肽的一些核苷酸序列可以存在 于操纵子中和/或作为融合蛋白，并且其它核苷酸序列具有它们自己的启动子和/或终止 子。在一些实施方式中，植物激素生物合成多肽是IPT (异戊烯基转移酶)，其是与细 胞分裂素生物合成有关的酶。IPT核苷酸序列可以来自任何合适的来源。由于密码子用法， 细菌IPT基因是优选的，这是因为核基因在叶绿体不可能表达到最高水平。优选地，IPT核苷酸序列来自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或来自 植物(例如，来自正被转化的植物)。在其它实施方式中，植物激素生物合成多肽是iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)和/或 iaaM(色氨酸单加氧酶)，其是与植物生长素生物合成有关的酶。核苷酸序列可以来自任何 来源。由于密码子用法，细菌iaaH和/或iaaM基因是优选的。优选地，iaaH和/或iaaM核苷酸序列来自根瘤土壤杆菌。在本发明的其它实施方式中，其中涉及植物生长素生物合成酶，可以用缺乏植物 生长素的培养基来选择转化植物。自然存在的植物生长素的实例包括4-氯吲哚乙酸、苯乙 酸(PAA)以及吲哚-3- 丁酸(IBA)。在本发明的一些优选实施方式中，植物激素生物合成酶是iaaH和iaaM，优选来自 根瘤土壤杆菌。切除盒终止子可以防止在切除所述切除盒以前转基因的过早表达。为此可以使用 任何终止子，只要它在被转化的植物细胞中被识别。尤其是，终止子可以是植物终止子或细 菌终止子。合适的终止子的实例包括rrn、psbA、rbcL以及T7终止子。优选的终止子是TrbcL终止子(例如，核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺 苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。在本发明的一些实施方式中，在切除盒中所使用的启动子和终止子并不来自相同 质体基因。在本发明的范围内，术语“转基因”(即，元件(C))用来指被引入到质体的基因组 中的核酸分子。转基因可以是，例如，基因组DNA、cDNA或合成核酸分子，其编码肽或多肽；
11编码mRNA、tRNA或核酶的核酸分子；或任何其它核酸分子。转基因的实例包括那些转基因，其编码抗体、抗生素、除草剂、疫苗抗原、酶、酶抑 制剂以及设计肽。单抗原或多抗原可以产生自病毒科、细菌、真菌或其它病原体。抗原可以表达为多 种抗原的单个单位或多个单位，例如用于广谱疫苗开发。可以产生用于化妆品的酶(例如，超氧化物歧化酶、过氧化物酶等)。还可以产生 用于去污剂组合物的酶。本发明特别涉及具有特异性活性的蛋白/酶的生产，例如，用来提高免疫反应的 免疫刺激剂，如干扰素；以及生长因子，例如转化生长因子-β (TGF-β)、骨形态发生蛋白 (BMP)、神经营养蛋白(NGF、BDNF、NT3)、成纤维细胞生长因子(FGF)、蛋白水解酶(木瓜蛋白 酶、菠萝蛋白酶)、以及食品补充酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶)。本发明还涉及在质体中蛋白/酶的生产或过度表达，其使得植物更耐生物和非生 物胁迫，如盐和金属。其实例包括产生叶绿体转基因植物，其螯合铁(Fe)以在重要的农业 区清除过量金属，从而供未来的种植。本发明进一步涉及使用编码多肽的转基因，其可以改进在质体中的脂肪酸生物合 成。可以将一种或多种转基因插入到转化盒中。优选地，转基因序列是相邻的。转基因序列可以另外编码融合于感兴趣的多肽的蛋白质纯化标签。蛋白质纯化标 签的实例包括N末端流感血细胞凝集素-HA-表位(HA)和6个组氨酸氨基酸的序列(HIS6) 以及链球菌标签。每种转基因产品可以具有不同的亲和标记物。在已切除所述切除盒以后，第一启动子能够驱动转基因的表达，导致在质体中转 基因的产物的积累。通过任何合适的方式，可以从植物细胞纯化或分离转基因的产物。在本发明的一些实施方式中，组成型表达转基因，而与是否已除去所述切除盒无 关。在这样的实施方式中，转基因可以表达自其自己的启动子。如果在再生期间植物并不 显示转基因表达的任何有害影响，则这样的实施方式是有用的。转化盒终止子(遗传元件(d))会终止转基因的表达。为此可以使用任何终止子， 只要它在被转化的植物细胞中被识别。尤其是，终止子可以是植物终止子或细菌终止子。合适的终止子的实例包括TrbcL或TspbA聚腺苷酸加成序列。优选的终止子是 psbA聚腺苷酸加成序列。在转化盒中，优选以次序(a)、(b)、(c)、(d)可操作地连接元件。在切除盒中，第一和第二位点特异性重组元件必须旁侧可选的启动子(当存在 时)、编码植物激素生物合成多肽的核苷酸序列以及终止元件。在本发明的一些实施方式中，编码植物激素生物合成多肽的核苷酸序列和终止元 件将在转化盒的启动子的下游(即3')，因而后面的启动子将能够驱动植物激素生物合成 多肽的表达。因此，在本发明的一些实施方式中，转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，包括(bl)第一位点特异性重组元件，
(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别，(c) 一种或多种转基因，(d)第一终止元件，在5' -3'方向上以上面规定的次序可操作地连接。在本发明的该实施方式中，第一启动子能够驱动编码植物激素生物合成多肽的核 苷酸序列的表达(例如，如图3-4所示)。在除去所述切除盒以后，第一启动子驱动转基因 的表达。在本发明的其它实施方式中，与第一启动子、转基因以及第一终止元件相比，切除 盒将是处于反方向。在该实施方式中，切除盒的表达部分将以反方向存在于这样的核苷酸 链中，其互补于编码第一启动子、转基因以及第一终止元件的核苷酸链。在这样的实施方式中，切除盒将包含第二启动子，其能够驱动编码植物激素生物 合成多肽的核苷酸序列的表达。在本发明的该实施方式中，转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c) 一种或多种转基因，(d)第一终止元件，其中(a)、(b)、(c)以及(d)在5' -3'方向上以上面规定的次序可操作地加以连 接，其中切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件，(b2)第二启动子，(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别，并且其中可操作性连接切除盒的部分并且其中与(a)、(c)以及(d)相比，切除盒处于 反方向。在该实施方式中，第二启动子驱动编码植物激素生物合成多肽的核苷酸序列的表 达(例如，如图5-6所示)。在除去所述切除盒以后，第一启动子驱动转基因的表达。转化盒并不限于本文规定的部分(a)-(d)。它可以例如另外包含5' -UTR以增加 转基因的表达水平和/或3'-另外的氨基酸以增加蛋白质稳定性。在本发明的一些实施方式中，转化盒另外包含第二选择性标记基因，例如抗生素 抗性基因，优选编码壮观霉素腺苷酸转移酶的核苷酸序列(例如，aadA基因)。这种多肽赋 予对抗生素壮观霉素的抗性。可以将编码壮观霉素腺苷酸转移酶的核苷酸序列置于转化盒 中的启动子之一的下游。它可以例如被置于下游并可操作性地连接至第一启动子；或置于下游并可操作性地连接至编码植物激素生物合成多肽(例如，IPT)的核苷酸序列；或置于 上游并可操作性地连接至编码植物激素生物合成多肽(例如，IPT)的核苷酸序列。在还有的其它实施方式中，转化盒排除第二选择性标记基因和/或排除核苷酸序 列，其赋予对抗生素的抗性。在一些实施方式中，转化盒另外包含LacI基因，优选在适当启动子(例如T7)的 控制下，以便于可诱导的表达。在将转化盒成功递送到质体以后，用缺乏植物激素生物合成多肽的培养基选择转 化细胞。通常，通过添加细胞分裂素和植物生长素来再生植物。因为转化质体将优选产生 IPT，因而产生细胞分裂素，所以在仅植物生长素存在的条件下可以选择和再生植物。用于 选择的细胞将优选是叶细胞。在本发明的一些实施方式中，在细胞分裂素抑制剂(例如，细胞分裂素氧化酶或 化学抑制剂)存在的情况下选择植物，以使细胞分裂素从生物合成位点到植物其它部分的 渗漏最小化。这减少了在植物中的镶嵌性(镶嵌现象)。在本发明的一些实施方式中，该方法另外包括以下步骤(iii)在植物细胞中表达重组酶，其中重组酶是识别第一和第二位点特异性重组 元件的重组酶。该重组酶是位点特异性重组酶。位点特异性重组酶是一种多肽，该多肽能够结合 于位点特异性重组元件并在位点特异性重组元件附近的核酸分子中诱导交换事件。在本发 明中，重组酶的表达导致从质体基因组切除所述切除盒。在本发明的范围内，重组酶是这样的一种重组酶，其能够结合于存在于切除盒中 的第一和第二位点特异性重组元件，导致以标准方式切除所述切除盒。位点特异性重组元件/位点特异性重组酶的实例包括Cre-lox，来自酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisae)的 FLP-FRP 系统(0 ‘ Gorman S, Fox DT，Wahl GM. (1991) Recombinase-mediated gene activation and site-specificintegration in mammalian cells. Science. 25，1351-1555.))，来自噬菌体 Mu 的 GIN/gix 系统(Maeser S and Kahmann R. (1991)The Gin recombinase ofphage Mu can catalyse site-specific recombination in plant protoplasts. MoIGen Genet. 230,170-176.)或来自鲁氏酵 母菌(Zygosaccharomyces rouxii)的 R/RS 系统(Onouchi H, Yokoi K, Machida C, Matsuzaki H, Oshima Y, Matsuoka K, Nakamura K, Machida Y. (1991)Operation of an efficientsite-specific recombination system of Zygosaccaromyces rouxii in tobaccocells. Nucleic Acids Res. 19,6373-6378·)。编码重组酶的核苷酸序列可以包括内含子，优选植物特异性内含子。这样的内含 子的存在将抑制重组酶多肽在原核生物例如细菌中的表达。优选的重组位点是Iox连同重组酶Cre。优选地，使用的重组酶序列是编码Cre多 肽的cDNA序列。优选地，通过重组酶从质体基因组切除所有或基本上所有切除盒。然而，本领域技 术人员将明了，一个或多个重组元件的一些或所有序列可以留在质体基因组中。通过任何 合适的方式，重组酶可以表达在细胞中。在本发明的一些实施方式中，植物细胞是这样一种细胞，其已经包括被整合到核基因组中的可表达构建物，其中可表达构建物包括编码质体靶向的转运肽的核苷酸序列和 重组酶(可操作性连接的，即，在框架中)。可表达构建物可以例如通过同源重组被引入到 核基因组中。在这样的情况下，重组酶必须是在可诱导启动子的调控下。借助于构建物，这 样的可诱导启动子可以被引入，或构建物可以被整合到相邻于内源性可诱导启动子。通过交叉，可以从期望的群体除去包含编码重组酶的位于核的序列的植物，其中， 由于这种性状的分离，可能失去上述序列。在本发明的其它实施方式中，植物细胞是这样一种细胞，其已经包括被整合到期 望的质体的基因组中的可表达构建物，其中可表达构建物包括编码重组酶的核苷酸序列。 可表达构建物可以例如通过同源重组已被引入到质体基因组中。在这样的情况下，重组酶 必须是在可诱导启动子的调控下。借助于构建物，这样的可诱导启动子可以已被引入，或构 建物可以已被整合到相邻于内源性可诱导启动子。因此，在本发明的一些实施方式中，步骤(iii)包括(iii)从可操作性地连接至 编码重组酶(其存在于植物细胞中)的核苷酸序列的可诱导启动子，在植物细胞中诱导重 组酶的表达，其中重组酶识别第一和第二位点特异性重组元件。优选地，可操作性地连接至编码重组酶的核苷酸序列的可诱导启动子存在于植物 细胞的核基因组中。在其它优选的实施方式中，可操作性连接于编码重组酶的核苷酸序列的可诱导启 动子存在于植物细胞的质体基因组中。在本发明的其它实施方式中，在步骤⑴以前、与步骤⑴同时或在步骤⑴以 后；或在步骤(ii)以前、与步骤(ii)同时或在步骤(ii)以后，用重组酶载体来转化植物细 胞，所述重组酶载体包括可操作性连接于编码重组酶的核苷酸序列的启动子。重组酶载体是这样的核酸载体，该核酸载体包括能够驱动下游重组酶的表达的启 动子元件。优选设计上述载体，使得重组酶仅在或基本上仅在质体中表达或特异性地靶向 或基本上特异性地靶向质体。在重组酶载体中的启动子必须是在待转化的植物细胞中可操作的启动子。该启动 子可以，例如是来自植物或细菌基因的启动子。优选地，启动子是植物特异性或质体特异性 的。最优选地，启动子是可诱导启动子如XVE(Zuo J, Niu Qff, Chua NH. (2000)Technical advance :An estrogenreceptor—based transactivator XVE mediates highly inducible gene expressionin transgenic plants. Plant J. 24，265—273.)。在本发明的范围内，术语“植物特异性的”是指植物特异性的或基本上植物特异性 的。类似地，术语“质体特异性的”是指质体特异性的或基本上质体特异性的。启动子可以是或可以不是可诱导启动子。如果在选择(步骤(ii))以前或期间将 重组酶载体引入到植物细胞中，则优选启动子是可诱导的。能够在植物中操作的可诱导启 动子的实例包括光可诱导启动子、金属可诱导启动子、热激启动子以及其它环境可诱导启 动子。优选地，启动子是可诱导启动子，例如XVE启动子(Zuo J，Niu Qff,Chua NH. (2000) Technical advance :An estrogen receptor—basedtransactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenicplants. Plant J. 24，265—273.)或 lac 启动子。
在本发明的一种实施方式中，重组酶载体包括可操作性地连接于核苷酸序列的启 动子，所述核苷酸序列编码靶向质体的转运肽和重组酶。在表达以后，将产生多肽产物，其包括可操作性连接于重组酶多肽的靶向质体的 转运肽。在该实施方式中，启动子可以是或可以不是质体特异性的。在本发明的范围内，术语“靶向质体的转运肽”是指这样的肽序列，该肽序列能够 以特异性或基本上特异性方式使重组酶多肽靶向质体。在表达以后，将产生重组酶多肽并 借助于靶向质体的肽将该多肽特异性地导入到质体中。靶向质体的转运肽的实例包括来自靶向质体的蛋白的靶向质体的转运肽。优选地，靶向质体的转运肽是能够使重组酶多肽靶向叶绿体的转运肽。最优选地，靶向质体的转运肽是来自基质质体靶向的蛋白的靶向质体的转运肽。靶向质体的转运肽的具体实例包括来自AtABCl的转运肽(SimonGeir Moller, Tim Kunkel and Nam-Hai Chua. (2001) “ A plastidic ABC proteininvolved in intercompartmental communication of light signaling " , Genes andDev.15, 90-103.)；来自 AtMinEl 的转运肽(Jodi Maple, Nam-Hai Chua andSimon Geir Moller (2002) " The topological specificity factor AtMinEl isrequired for correct plastid division site placement in Arabidopsis" , Plant J. 31, 269-277)；以及来自 GIANT CHL0R0PLAST 1 的转运肽(Jodi Maple, Makoto Τ. Fujiwara, Nobutaka Kitahata, Tracey Lawson, Neil Baker, ShigeoYoshida and Simon Geir Moller (2004) " GIANT CHL0R0PLAST 1 isessential for correct plastid division in Arabidopsis ". Current Biology. 14，776-781))。最优选地，重组酶载体包括XVE启动子，其可操作性地连接于编码靶向质体的转 运肽的核苷酸序列，以及CRE重组酶。重组酶载体还可以包括其它元件，例如，nptll基因(卡那霉素抗性)，以便于转化 细胞的选择。因此，在本发明的一些实施方式中，步骤(iii)包括(iii)用重组酶载体转化植 物细胞，所述重组酶载体包括启动子、编码靶向质体的转运肽的核苷酸序列以及重组酶，其 中重组酶是识别第一和第二位点特异性重组元件的重组酶。特别优选地，本发明的步骤(iii)包括(iii)用重组酶载体转化植物细胞，上述 重组酶载体包括启动子、编码靶向质体的转运肽的核苷酸序列以及重组酶，其中启动子能 够驱动编码靶向质体的转运肽的核苷酸序列以及重组酶在植物细胞中的表达，并且其中， 在植物细胞中表达以后，重组酶多肽通过转运肽而靶向质体。更优选地，启动子是可诱导启 动子。在本发明的其它实施方式中，基因构建物另外包括如本文定义的重组酶载体。本领域技术人员将知道用核酸载体来转化植物细胞的许多方法。这些方法包括 直接DNA摄取到原生质体中、PEG介导摄取到原生质体、微粒轰击、电穿孔、热激、DNA的微 注射、组织外植体或细胞的微粒轰击、植物组织的真空渗入、借助于土壤杆菌的植物组织的 T-DNA介导转化、以及植物(优选烟草)液体培养。为了转化包含所选质体的植物细胞，可以使用任何这样的合适的方法。在本发明的一些实施方式中，待转化的植物细胞是保卫细胞，即，气孔保卫细胞。这样的细胞已表明是全能的，因此再生应当是更有效的。保卫细胞可以用作表皮条或用作 分离的保卫细胞原生质体。(Hall et al. 1996. 112 889-892，Plant Physiology ；Hall et al.1996，14. 1133-1138，NatureBiotechnology)。为了使基因构建物靶向质体，生物导弹(biolistic)转化是优选的。这涉及将核 酸载体涂敷的金颗粒(微粒)发射到植物组织的质体中，接着是转化质体的选择和植物再 生。优选地，植物组织是植物叶片，虽然还可以使用胼胝体(就水稻转化来说)。本发明的方法优选还包括以下另外的步骤在植物细胞中诱导重组酶的表达。该步骤将在重组酶载体/可表达构建物和转化盒均存在于植物细胞中以后进行。 优选地，该步骤将在用缺乏植物激素细胞分裂素的培养基选择植物细胞以后进行。可以通过施加诱导剂来诱导重组酶的表达，其导致激活存在于重组酶载体中的 启动子或内源性启动子或可表达构建物。表达重组酶多肽，然后使它结合于切除盒中的第 一和第二位点特异性重组元件，从而导致所述盒的切除。(如本领域技术人员将明了的，位 点特异性重组元件之一和某个相邻序列可以留在质体基因组中)。在从质体基因组已除去编码植物激素生物合成多肽的核苷酸序列以后，存在于转 化盒中的启动子将能够直接表达下游转基因，因而产生感兴趣的多肽。通常，在细胞分裂素(嫩枝形成)和植物生长素(根形成)存在的情况下再生植 物。在再生包含IPT基因(产生细胞分裂素)的植物的情况下，适当的细胞/组织(例如， 叶节)将被置于仅包含植物生长素的培养基上(用于根再生)，而由于IPT基因的存在将发 生嫩枝再生。本发明还提供了一种用于制备转基因产品的方法，该方法包括用于产生转化植物 细胞的方法(如上文所描述的)，以及另外包括从质体纯化转基因产品。本发明的一种特别优选的实施方式包括用于产生转化植物细胞的方法，该方法包 括以下步骤(i)用基因构建物转化植物细胞，其中基因构建物包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件，其中第一和第二同源重组元件能够引导转化盒整合到存在于植物细胞中的至少 一种质体的基因组中，其中转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c) 一种或多种转基因，(d)第一终止元件，其中所述切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件，(b2)可选的第二启动子(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别，并且其中第一和第二位点特异性重组元件是Iox元件并且重组酶是Cre。本发明的另一种特别优选的实施方式包括用于产生转化植物细胞的方法，该方法 包括以下步骤(i)用基因构建物转化植物细胞，其中基因构建物包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件，其中第一和第二同源重组元件能够引导转化盒整合到存在于植物细胞中的至少 一种质体的基因组中，其中转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c) 一种或多种转基因，(d)第一终止元件，其中切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件，(b2)可选的第二启动子(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，其中一个 或多个的多肽是IPT，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别。本发明的又一种特别优选的实施方式包括用于产生转化植物细胞的方法，该方法 包括以下步骤(i)用基因构建物转化植物细胞，其中基因构建物包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件，其中第一和第二同源重组元件能够引导转化盒整合到存在于植物细胞中的至少 一种质体的基因组中，其中转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c) 一种或多种转基因，(d)第一终止元件，其中切除盒包含(bl)第一位点特异性重组元件，(b2)可选的第二启动子(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，其中一个 或多个的多肽是IPT，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别并且其中第一和第二位点特异性重组元件是Iox元件且重组酶是Cre。又一种特别优选的实施方式提供了一种用于产生转化植物细胞的方法，该方法包 括以下步骤(i)用基因构建物转化植物细胞，其中基因构建物包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件，其中第一和第二同源重组元件能够引导转化盒整合到存在于植物细胞中的至少 一种质体的基因组中，其中转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c) 一种或多种转基因，(d)第一终止元件，其中切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件，(b2)可选的第二启动子(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，其中一个 或多个的多肽是IPT，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别并且其中第一和第二位 点特异性重组元件是Iox元件且重组酶是Cre，(ii)用缺乏IPT的培养基选择转化植物细胞；以及(iii)在植物细胞中，以导致从质体基因组切除所述切除盒的水平表达Cre重组酶。本发明还提供了一种如本文定义的转化盒、以及如本文定义的重组酶载体。本发明进一步提供了一种包括本发明的转化盒的植物细胞、包含本发明的重组酶 载体的植物细胞、以及包含本发明的转化盒和重组酶载体的植物细胞。本发明进一步提供了一种包含本发明的转化盒的转基因植物、包含本发明的重组 酶载体的转基因植物、以及包含本发明的转化盒和重组酶载体的转基因植物。本发明进一步提供了一种包含本发明的转化盒的植物种子、包含本发明的重组酶 载体的植物种子、以及包含本发明的转化盒和重组酶载体的植物种子。本发明进一步提供了一种包含本发明的转化盒的植物质体、包含本发明的重组酶 载体的植物质体、以及包含本发明的转化盒和重组酶载体的植物质体。另外，本发明提供了一种利用本发明的方法可获得或获得的植物细胞。
图1是示出了 IPT基因切除和YFP基因激活的总体原则的示意图。包含IPT基因的pPTIOOl-YFP被夹在两个Iox位点之间，其便于在再生以后的CRE 介导的IPT切除。IPT基因的除去导致同时转基因(YFP)激活。
图2 =CRE 诱导切除 pPTIOOl-YFP 中的 IPT 盒。包含pPTIOOl-YFP载体的大肠杆菌DH5a细胞的明场(A)和荧光⑶图像。包含 pPTIOOl-YFP和pERlO-TP.CRE载体的大肠杆菌DH5a细胞的明场(C)和荧光(D)图像(图 1)。在pPTIOOl-YFP中IPT盒的CRE诱导切除导致来自ftrn启动子的YFP的组成型表达。 (E)利用跨越TrbcL和TpsbA终止子的引物在pPTIOOl-YFP载体中IPT盒的CRE诱导切除 的PCR证实(图3)。M 分子量标记。图 3 (A)pPTIOOl 和(B)pPT1001-YFP 载体的示意图。HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； Prrn 质体核糖体RNA (rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体 基因组DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷 酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基 因组DNA) ；YFP 黄色荧光蛋白；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。图4 包含蛋白质纯化标签的修饰pPTIOOl-YFP载体(pPTIOOl载体系列)的示意图。(A) pPTIOOla-YFP,包含N末端流感血细胞凝集素-HA-附加表位(HA3)的 pPTIOOl-YFP。(B)pPTIOOlb-YFP，包含 6 个 N 末端组氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI001-YFP。(C) pPTI001c-YFP,包含C末端流感血细胞凝集素-HA-附加表位(HA3)的 pPTIOOl-YFP。(D) pPT100Id-YFP，包含 6 个 C 末端组氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI001-YFP。为了便于使用EcoRV 作为来自在(C)pPTIOOlc-YFP 禾Π (D)pPTIOOld_YFP 中的 YFP 的克隆位点下游，修饰IPT DNA序列，以将在核苷酸位置519处的腺嘌呤改变成胍(+1作为 在起始密码子中的腺嘌呤)，从而除去内源性EcoRV位点。图 5 (A) pPTI002 和(B) pPTI002_YFP 载体的示意图。HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； Prrn 质体核糖体RNA (rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体 基因组DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷 酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基 因组DNA) ；YFP 黄色荧光蛋白；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。载体系列ρΡΤΙ002的结构(还参见图6)是用来确保在CRE介导切除以前不存在 从ftrn启动子到上述转基因(在这种情况下为YFP)的遗漏表达。虽然这似乎并不是真正 的问题，如图2所示，但我们已将IPT基因和YFP基因置于相反取向。图6 包含蛋白质纯化标签的修饰PPTI002-YFP载体(pPTI002载体系列)的示意 图。 (A) pPTI002a-YFP,包含N末端流感血细胞凝集素-HA-附加表位(HA)的 PPTI002-YFP。 (B)pPTI002b-YFP，包含 6 个 N 末端组氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI002_YFP。
(C) pPTI002c-YFP,包含C末端流感血细胞凝集素-HA-附加表位(HA)的 PPTI002-YFP。(D)pPTI002d-YFP，包含 6 个 C 末端组氨酸氨基酸(HIS6)的 pPTI002_YFP。为了便于使用EcoRV 作为来自在(C)pPTI002c_YFP 禾Π (D)pPTI002d_YFP 中的 YFP 的克隆位点下游，修饰IPT DNA序列，以将在核苷酸位置519处的腺嘌呤改变成胍(+1作为 在起始密码子中的腺嘌呤)，从而除去内源性EcoRV位点。图 7 :pER10/TPCRE 的示意图。XVE作为可诱导启动子，其驱动TP-CRE (融合于CRE的转运肽)表达。该转基因的 选择是通过由nptll基因赋予的卡那霉素抗性。图8 使用IPT选择性标记来选择和再生阳性叶绿体转基因植物。A)质体转化以后的第一轮选择表明在没有细胞分裂素存在的情况下存在新的嫩芽。B)来自A所示的初级转化体的第二轮选择。C)用于CRE渗入和GFP激活的再生叶绿体转基因烟草植物(图10)。图9 转基因插入烟草质体基因组的证实。利用在烟草叶绿体基因组的旁侧区中 的引物和在盒内退火到TrbcL终止子的引物，证实了在同源重组位点pPTIOOl/YFP插入烟 草叶绿体基因组。示出的泳道WT，野生型；#1，再生物1 ’#2再生物2 ；M，标记。图10 在烟草叶细胞中YFP表达的诱导。在pER10/TP. CRE的渗入和诱导以后，通过荧光显微镜分析的包含pPTIOOl/YFP转 化盒的再生物叶绿体转基因烟草植物。通过落射荧光显微镜并利用Volocity II软件来俘 获重建YFP荧光团(YFP)和叶绿素自身荧光(Chlorophyll)的扩展焦点图像。比例尺= 5 μ m0图11 质体转化载体pPTI005 HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； PpsbA 质体psbA启动子；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；T7 :T7转录终止序列；Prrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基因组 DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重组序列(ntl05381_106370，登录号Z00044烟 草叶绿体基因组DNA)。图12 质体转化载体ρΡΤΙ007 H0M3 同源重组序列(nt 1(^925-101857，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； PpsbA 质体psbA启动子；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；T7 :T7转录终止序列；Prrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基因组 DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4 同源重组序列(nt 100933-100130，登录号Z00044 烟草叶绿体基因组DNA)。
图13 质体转化载体ρΡΤΙ008 H0M3 同源重组序列(nt 1(^925-101857，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； ftrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基 因组DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；aadA:壮观霉素腺苷酸转移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4 同源重组序 列(nt 100933-100130，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。IPT. aadA盒构建为操纵 子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6个碱基对隔离物。图14 质体转化载体ρΡΤΙ009 H0M3 同源重组序列(nt 1(^925-101857，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； ftrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基 因组DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；aadA:壮观霉素腺苷酸转移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4 同源重组序 列(nt 100933-100130，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。IPT. aadA盒表达为融合蛋 白。在IPT a基因之前有SD序列和a 6个碱基对隔离物并且两个可读框由8个甘氨酸接 头序列隔开。图15 质体转化载体pinPTI。每种pPTI载体包含组成型表达LacI基因。ρΡΤΙ003作为一个实例示出。将修饰 的ftrn启动子(ftTnL)插入IPT. aadA盒的上游，从而便于IPT. aadA盒的可诱导、受控表 达。(A)pindlPTI，包含LacI可读框并在IPT. aadA盒上游的ftrn启动子序列和修饰PrrnL 启动子的调控下的pPTI。(B)pind2PTI，包含LacI可读框并在IPT. aadA盒上游的T7启 动子序列和修饰ftrnL启动子调控下的pPTI。HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380, 登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；Prrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；IPT 来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基 转移酶基因；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；TrbcL 核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧 酶聚腺苷酸加成序列(ntl02539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶 绿体基因组DNA)。IPT. aadA盒构建为操纵子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6 个碱基对隔离物。图16 质体转化载体pPTI+将修饰每种pPTI载体以包含修饰的ftrn-trbcUPrrn启动子构建物，由ftrn启 动子和rbcL 5'翻译调控区构成)，以最终产生外源蛋白的更高水平的表达。PPTI003作 为一个实例示出。HOMl 同源重组序列(ntl04091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因 组DNA) ；Prrn-t 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟 草叶绿体基因组DNA)以及rbcL 5'翻译调控区；IPT 来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移 酶基因；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；TrbcL 核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧酶聚 腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA 聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基
22因组DNA)。IPT. aadA盒被构建成操纵子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6个碱 基对隔离物。图 17 :pPTI003HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； ftrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基 因组DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；aadA:壮观霉素腺苷酸转移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重组序 列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。IPT. aadA盒被构建为操纵 子。在IPT和aadA基因之前均有SD序列和6个碱基对隔离物。pPTI004HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； ftrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基 因组DNA) ；IPT:来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；aadA:壮观霉素腺苷酸转移酶 基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685， 登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M2 同源重组序 列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。IPT. aadA盒表达为融合蛋 白。在IPT a基因之前有SD序列和6个碱基对隔离物并且两个可读框由8个甘氨酸接头 序列隔开。图18 质体转化载体pPTAOOlHOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； ftrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿 体基因组DNA) ；iaaH:来自根瘤土壤杆菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 来自根瘤土壤杆菌 的色氨酸单加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。iaaH. iaaM盒被构建为操纵子。在iaaH和iaaM基因之前均有SD序列和6个碱基对隔离物。图19 质体转化载体pPTA002HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； ftrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿 体基因组DNA) ；iaaH:来自根瘤土壤杆菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 来自根瘤土壤杆菌 的色氨酸单加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。iaaH. iaaM盒表达为融合蛋白。在iaaH a基因之前有SD序列和6个碱基对隔离物并且两个可读 框由8个甘氨酸接头序列隔开。图20 质体转化载体pPTA003HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；iaaH 来自根瘤土壤杆菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 来自根瘤土壤杆菌的色氨酸单加氧酶；Prrn:质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。iaaH. iaaM盒被构建为操纵子。在iaaH和iaaM基因之前均有SD序列和6个碱基对隔离物。图21 质体转化载体pPTA004HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)； TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录 号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；iaaH 来自根瘤土壤杆菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 来自根瘤土壤杆菌的色氨酸单加氧酶；Prrn:质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt 59034-59303，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M2:同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。iaaH. iaaM盒表达为融合蛋白。在iaaH a基因之前有SD序列和6个碱基对隔离物并且两个可读 框由8个甘氨酸接头序列隔开。图22 质体转化载体pPTA005HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组 DNA) ；PpsbA:质体psbA启动子；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；T7 :T7转录终止序 列；ftTn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt59034_59303，登录号Z00044烟草叶 绿体基因组DNA) ；iaaH:来自根瘤土壤杆菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 来自根瘤土壤杆 菌的色氨酸单加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列 (ntl02539-102685,登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成 序列；H0M2 同源重组序列(nt 105381-106370,登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。 iaaH. iaaM盒被构建为操纵子。在iaaH和iaaM基因之前均有SD序列和6个碱基对隔离 物。图23 质体转化载体pPTA006HOMl 同源重组序列(nt 104091-105380，登录号Z00044烟草叶绿体基因组 DNA) ；PpsbA:质体psbA启动子；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；T7 :T7转录终止序 列；Prrn 质体核糖体RNA(rrn)操纵子启动子(nt59034_59303，登录号Z00044烟草叶 绿体基因组DNA) ；iaaH:来自根瘤土壤杆菌的吲哚乙酰胺水解酶；iaaM 来自根瘤土壤杆 菌的色氨酸单加氧酶；TrbcL 核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列 (ntl02539-102685,登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成 序列；H0M2 同源重组序列(nt 105381-106370,登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。 iaaH. iaaM盒表达为融合蛋白。在iaaH a基因之前有SD序列和6个碱基对隔离物并且两 个可读框由8个甘氨酸接头序列隔开。图M 质体转化载体pPTS4H0M4L 同源重组序列(nt 104065-102312，登录号Z00044烟草叶绿体基因组 DNA) ；Prrn-rbcl-ds 质体核糖体 RNA (rrn)操纵子启动子(nt590;34-59303，登录号 Z00044 烟草叶绿体基因组DNA)，rbcl是质体rbcL基因的5' -UTR并且下游序列(ds)序列编 码RbcL氨基酸1-14(Kuroda andMaliga(2001)) 0在叶绿体中，翻译起始密码子下游的序列是翻译效率的重要决定子。(Plant Physiol, volume 125 (I)Page 431，图1) ；IPT 来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；TrbcL 核 酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(ntl02539-102685，登录号Z00044 烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4R 同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。图25 质体转化载体pPTS5H0M4L 同源重组序列(nt 104065-102312，登录号Z00044烟草叶绿体基因组 DNA) ；Prrn-atpB-ds 质体核糖体 RNA(rrn)操纵子启动子(nt590;34-59303，登录号 Z00044 烟草叶绿体基因组DNA)，atpb是质体atpb基因的5 ‘ -UTR并且下游序列(ds)序列编 码AtpB氨基酸1-14 (Kuroda andMaliga(2001)) 在叶绿体中，翻译起始密码子下游的 序列是翻译效率的重要决定子。(Plant Physiol, volume 125 (I)Page 431，图1) ;IPT 来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；aadA 壮观霉素腺苷酸转移酶基因；TrbcL 核 酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(ntl02539-102685，登录号Z00044 烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列；H0M4R :同源重组序列(nt 105381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。图沈质体转化载体pPTS6H0M4L 同源重组序列(nt 104065-102312，登录号Z00044烟草叶绿体基因组 DNA) ；Prrn-T7gl0 质体核糖体 RNA(rrn)操纵子启动子(nt590;34-59303，登录号 Z00044 烟草叶绿体基因组DNA)，T7gl0是大肠杆菌噬菌体T7基因10的5' -UTR(Kuroda and Maliga(2001)Complementarityof the 16S rRNA penultimate stem with sequences downstream of the AUGdestabilizes the plastid mRNAs. Nucleic Acids Res.volume 29 (4)page 972，图1) ；IPT :来自根瘤土壤杆菌的异戊烯基转移酶基因；aadA :壮观霉素 腺苷酸转移酶基因；TrbcL:核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶聚腺苷酸加成序列(nt 102539-102685，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA) ；TpsbA :psbA聚腺苷酸加成序列； H0M4R 同源重组序列(ntl05381-106370，登录号Z00044烟草叶绿体基因组DNA)。在以下实施例中进一步限定本发明，其中，除非另有说明，否则份数和百分比是按 重量计并且度是摄氏度。应当理解，这些实施例，虽然表明是本发明的优选实施方式，但仅 以举例说明的方式给出。根据以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的 本质特征，并且在没有偏离本发明的精神和范围的情况下，可以进行本发明的各种变化和 改进，以使它适于各种用途和条件。因此，对于本领域技术人员来说，根据以上描述，除本文 示出和描述的那些改进之外，本发明的各种改进将是显而易见的。这样的改进也旨在落在 所附权利要求的范围内。本文提及的每个参考文献的全部内容以引用方式并入本文。 实施例实施例1如在图3和图5中详细描述的，在基因盒的任何一侧，利用来自烟草的叶绿体基因 组的1289bp同源重组序列(104091-105380nt)和989bp同源重组序列(105381_106370nt) (Shinozaki K, Ohme Μ, Tanaka Μ, Wakasugi Τ, Hayashida N, Matsubayashi Τ, Zaita N,Chunwongse J,Obokata J,Yamaguchi-Shinozaki K,Ohto C,Torazawa K,Meng BY,Sugita Μ, Deno H, Kamogashira Τ, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H, Sugiura Μ. (1986)The complete nucleotide sequence of thetobacco chloroplast genome : its gene organization and expression. EMBO J. 5，2043—2049.)来构建质体转 化载体pPTIOOl和ρΡΤΙ002。还已使用来自烟草叶绿体DNA的更短的同源重组序列(长度 为157和14;3bp)，其显示质体转化效率的3倍增加。为了证明原理，将黄色荧光蛋白(YFP)报告基因克隆到pPTIOOl和pPTI002中以 生成pPTIOOl-YFP (图3)和pPTI002-YFP(图5)。如在附录1中详细描述的，然后将这些载 体轰击到烟草叶子中。关于转化实验，使用了来自在温室中生长的植物的叶子而不是在洋 红盒中生长的植物的叶子，因为这可以增加转化效率。用10%超级漂白灭菌剂(Coventry) 对叶子进行杀菌10分钟并在无菌水中洗涤三次。然后切割叶子以适合用于轰击的平板。按 照这些策略，转化效率几乎增加10倍。因为pPTIOOl和ρΡΤΙ002载体系列也在细菌中起作用，所以我们测试了 IPT基 因的CRE介导切除是否在大肠杆菌细胞中最终功能上导致YFP基因激活和YFP荧光。图 1示出了表示系统的主要部分的示意图。产生化学感受态大肠杆菌DH5 α细胞并用载体 PER10-TP. CRE(其组成型表达TP. CRE融合蛋白)转化，然后用包含壮观霉素的LB培养 基加以选择。随后产生包含PER10-TP.CRE载体的化学感受态大肠杆菌DH5ci细胞并用 pPTIOOl-YFP加以转化。用包含壮观霉素和氯霉素的LB培养基来选择包含两种载体的细 胞。将单集落接种到包含壮观霉素和氯霉素的LB培养基中，并在用装备有用于YFP荧光的 滤光器(激发器HQ500/20、发射器S5!35/30)和Hamamatsu Orca,ER 1394冷却式CCD相机的 Nikon TE-2000U倒置式荧光显微镜分析YFP表达以前，生长至0. 4的0D600。利用Openlab 软件(Improvision)来俘获图像。用质粒DNA(其制备自大肠杆菌细胞)和引物TrbcL-F 和TpsbA-R(其跨越IPT盒区)来进行IPT切除的PCR证实。图2表明在添加CRE以前没 有IPT基因的切除(图2A和图2E)，而在CRE添加以后，在分子水平，IPT基因被除去(图 2E)，这导致YFP表达(图2D)。实施例2对植物发育具有毒性作用的蛋白质的表达由于毒性作用，在植物中高水平的外源蛋白的表达可以导致对植物发育的有害影 响。所描述的系统通过以下而克服了该问题将转基因插入到质体基因组中，其中它仍然是 休眠的直到通过CRE/lox介导的重组除去IPT选择性标记基因。将编码“植物毒性”蛋白的转基因插入到pPTIOOl载体系列的TrbcL和TspbA聚 腺苷酸加成序列之间或PPTI002载体系列的ftrn启动子和TspbA聚腺苷酸加成序列之间 的pPTIOOl或ρΡΤΙ002载体之一中(图3和图5)，然后利用附录1所示的协议将构建物转 化到质体中，接着是细胞分裂素介导的选择和再生。在再生以后，通过CRE介导的重组除去 IPT基因，然后激活毒性转基因，从而导致对最初植物再生的最小的不利影响。在表达以后， 可以利用图4和图6所示的pPTIOOl或ρΡΤΙ002载体系列中存在的亲和标记物之一来纯化 重组蛋白。实施例3在质体中具有作用的蛋白质的表达
质体在植物发育期间具有不可或缺的作用，因此其对在质体内表达蛋白(植物或 非植物)有利，其将对植物生长、发育具有积极作用和/或赋予作为整体的植物改进的特 性。由于在质体中转基因的高表达水平关联于以下事实作为选择性标记基因的IPT并不 导致自发核糖体突变体的产生(正如常见的壮观霉素选择性标记基因)，所以本发明代表 用于该用途的理想系统。将转基因插入到pPTIOOl载体系列的TrbcL和TspbA聚腺苷酸加成序列之间或 PPTI002载体系列的ftrn启动子和TspbA聚腺苷酸加成序列之间的pPTIOOl或pPTI002载 体之一中(图3和图幻，然后利用附录1所示的协议将构建物转化到质体中，接着是细胞分 裂素介导的选择和再生。在再生以后，通过CRE介导的重组除去IPT基因，并激活转基因， 从而导致对最初植物再生的最小的不利影响。实施例4真核生物蛋白的高水平表达由于不溶性和/或缺乏翻译后修饰，经常存在与真核生物蛋白在细菌系统中的表 达有关的问题。类似地，真核生物蛋白在哺乳动物细胞中的表达是昂贵和费力的。利用IPT 标记基因选择和转基因激活，本系统可以用于在质体中表达真核生物蛋白。如在实施例2和3中所描述的，可以将编码真核生物蛋白的任何基因插入到一种 或所有的pPTIOOl系列或ΡΡΤΙ002系列载体中，接着是转化、选择和再生(如前所述)。在 再生以后，可以利用图4和图6所示的亲和标记物来纯化表达的蛋白并用于下游应用。将被表达的可能的真核生物蛋白家族的非排它性清单包括抗体、酶、酶抑制剂以 及设计肽。实施例5原核蛋白的高水平表达由于质体的内共生起源，所以可以在质体中表达原核蛋白。如在实施例2和3中 所描述的，可以将编码原核蛋白的任何基因插入到一种或所有的pPTIOOl系列或PPTI002 系列载体中，接着是转化、选择和再生(如前所述)。在再生以后，可以利用图4和图6所示 的亲和标记物来纯化表达的蛋白并用于下游应用。实施例6来自相同启动子的多种蛋白质的协调表达由于质体的内共生起源，所以可以在质体中表达操纵子样基因结构。这意味着在 单启动子的调节下多种蛋白质的协调和同时表达。如在实施例2和3中所描述的，可以将编 码原核和真核生物起源(或混合起源)的蛋白质的多种基因插入到一种或所有的PPTIOOl 系列或ρΡΤΙ002系列载体中，接着是转化、选择和再生(如前所述)。实施例7在烟草的质体中来自pPTIOOl/YFP的YFP的表达将pPTI001/YFP载体轰击到烟草叶细胞中，然后用仅包含植物生长素的培养基和 用缺乏所有激素的培养基来选择再生物。获得再生物(图8)并转移到包含植物生长素的 二次选择培养基中，以在转移到土壤以前诱导根形成。通过PCR并利用载体特异性引物和 在烟草叶绿体基因组的旁侧区中的引物来证实在烟草质体基因组中加入有转化盒(图9)。 用pER10/TP. CRE，表达TP. CRE融合的双载体，浸润来自再生植物的叶子，接着诱导。在72小时以后，通过荧光显微镜分析了浸润组织(渗入组织)。揭示了包含GFP发荧光叶绿体的 细胞(图10)。实施例8另外和新的质体转化载体为了优化选择和再生系统，已进一步构建了新系列的质体转化载体。已进行了以 下修饰和添加1)除IPT基因以外还包含aadA基因，用于双重选择目的。2)包含新的同源重组位点(H0M3和H0M4)，其可以增加更加有效的同源重组和转 基因插入。3)包含IPTG可诱导启动子。4)包含修饰ftrri启动子以用于更高的表达水平。载体的详情示于图11-16中。所有例证的载体包含IPT选择性标记基因。实施例9使用植物生长素生物合成作为用于质体转化的选择性标记如在图18-21中详细示出的，在基因盒任何一侧利用来自烟草的叶绿体基因组 的 1289bp 同源重组序列(104091-105380nt)和 989bp 同源重组序列(105381_106370nt) (Shinozaki K, Ohme Μ, Tanaka Μ, Wakasugi Τ, Hayashida N, Matsubayashi Τ, Zaita N, Chunwongse J,Obokata J,Yamaguchi-Shinozaki K,Ohto C,Torazawa K,Meng BY,Sugita Μ, Deno H, Kamogashira Τ, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H, Sugiura Μ. (1986)The complete nucleotide sequence of thetobacco chloroplast genome : its gene organization and expression. EMBO J. 5，2043—2049.)来构建质体转 化载体pPTA001-pPTA004。还可以使用更短或更长的同源重组序列以确保适当的同源重组 事件。如在附录3中详细描述的，将这些载体轰击到烟草叶子中。关于转化实验，使用了 在洋红盒中生长的植物的有效生长的嫩叶。实施例10 对植物发育具有毒性作用的蛋白的表达由于毒性作用，在植物中高水平外源蛋白的表达可以导致对植物发育的不利影 响。所描述的系统通过组合以下可以克服该问题将转基因插入到质体基因组中，其中它仍 然是休眠的，直到通过CRE/lox介导的重组除去植物生长素选择性标记基因。将编码“植物毒性”蛋白的转基因插入到ftrn启动子和TpsbA聚腺苷酸加成序列 之间的pPTA001-pPTA004载体之一中(图18-21)，然后利用附录3所示的协议将构建物转 化到质体中，接着是植物生长素介导的选择和再生。在再生以后，通过CRE介导的重组除去 植物生长素基因并激活毒性转基因，从而导致对最初植物再生的最小的不利影响。在表达 以后，使用赋予期望性状的叶绿体转基因植物或纯化重组蛋白。实施例11在质体中具有作用的蛋白的表达质体在植物发育期间具有不可或缺的作用，因此对在质体内表达蛋白(植物或非 植物)是有利的，其将对植物生长、发育具有积极作用和/或赋予作为整体的植物改进的特
28性。由于在质体中转基因的高表达水平关联于以下事实作为选择性标记基因的iaaH和 iaaM并不导致白发核糖体突变体的产生(正如常见的壮观霉素选择性标记基因)，所以本 发明代表用于该用途的理想系统。将编码质体蛋白的转基因插入到ftrn启动子和TrbcL聚腺苷酸加成序列之间的 pPTA001-pPTA004载体之一中(图18-21)，然后利用附录3中所示的协议将构建物转化到 质体中，接着是植物生长素介导的选择和再生。在再生以后，通过CRE介导的重组除去iaaH 和iaaM基因并激活转基因，从而导致对最初植物再生的最小的不利影响。实施例12真核生物蛋白的高水平表达由于不溶性和/或缺乏翻译后修饰，经常存在与真核生物蛋白在细菌系统中的表 达有关的问题。类似地，真核生物蛋白在哺乳动物细胞中的表达是昂贵和费力的。利用iaaH 和iaaM标记基因选择和转基因激活，本系统可以用于在质体中表达真核生物蛋白。如在实施例10和11中所描述的，可以将编码真核生物蛋白的任何基因插入到一 种或所有pPTA001-pPTA004系列载体中，接着是转化、选择和再生(如前所述)。在再生以 后，可以纯化表达的蛋白并用于下游应用。将被表达的可能的真核生物蛋白家族的非排它清单包括抗体、酶、酶抑制剂以及 设计肽。实施例13原核蛋白的高水平表达由于质体的内共生起源，所以可以在质体中表达原核蛋白。如在实施例10和11中 所描述的，可以将编码原核蛋白的任何基因插入到一种或所有的ppTA001-pTA004载体中， 接着是转化、选择和再生(如前所述)。在再生以后，可以纯化表达的蛋白并用于下游应用。实施例14来自相同启动子的多种蛋白质的协调表达由于质体的内共生起源，所以可以在质体中表达操纵子样基因结构。这意味着 在单启动子的调节下多种蛋白质的协调和同时表达。如在实施例10和11中所描述的， 可以将编码原核和真核生物起源(或混合起源)的蛋白的多种基因插入到一种或所有 pPTA001-pPTA004载体中，接着是转化、选择和再生(如前所述)。实施例15另外和新的质体转化载体为了优化选择和再生系统，进一步构建了新系列的质体转化载体。进行了以下修 饰和添加1)除iaaH和iaaM基因以外还包含aadA基因，用于双重选择(图22_23，pPTA005 和 pPTA006)。2)包含具有不同长度和组成的新的同源重组位点，其可以增加同源重组和转基因 插入的效率。3)包含用来驱动转基因表达的各种可诱导启动子。4)包含修饰的ftrri启动子，以获得更高的表达水平。在图M-26中给出了本发明的其它优选构建物。
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附录1利用细胞分裂素选择的叶绿体转化的协议时间过程标准程序在3-5个月内产生转化植物。 轰击第一嫩芽3-8周·同种植物的传代培养生产3-4周·在分析以前，在土壤中生长1-2周设备设置氦枪Biorad PDS 1000 破裂盘 PSI :1100 破裂盘锁定盖(retaining cap)和盖子上的大载体(宏观载体，macrocarrier) 之间的间隙1/4〃·在停止屏支座下方的间隔环2·大载体送出组件的水平1 (从顶部)·培养皿(陪替氏培养皿)固定架的水平4(从顶部) 真空流入率最大·真空释放率减弱释放，使得其接近真空流入的速度。原液(储备溶液)· 2. 5M CaCl2高压灭菌器或过滤消毒· IM亚精胺游离碱，在灭菌H2O中· dH20· DNA, 1 μ g/ μ 1，在 dH20 或 IX TE 中· 100% 乙醇·70% 乙醇消耗品.IlOOpsi 破裂盘 停止屏·大载体·金颗粒DNA-金颗粒混合物的制备·将50mg的金颗粒悬浮在Iml的无水乙醇中作为储备悬浮液。·取0. 25ml的金储备悬浮液并微离心5秒。除去乙醇并用无菌蒸馏水洗涤3次， 在洗涤之间微离心3分钟。·将金再悬浮在0. 25ml dH20中。 将50 μ 1等分部分的金-H2O悬浮液加入到埃彭道夫管中。·在每个埃彭道夫管中连续添加10 μ 1 DNA, 1 μ g/ μ 150 μ 1 的 2· 5Μ CaCl220 μ 1的0. IM亚精胺游离碱 以最高速度涡旋5分钟。
·在每个管中添加200 μ 1的无水乙醇。·在离心机中以3000rpm旋转2秒。 除去尽可能多的上清液并在无水乙醇中冲洗沉淀物一次，然后以3000rpm离心2秒。 将沉淀物再悬浮在30 μ 1无水乙醇中(制备4-5个弹丸)。在冰上储存混合物。制备基因枪和消耗品·用70%乙醇或70%异丙醇对枪真空室和表面进行灭菌。·在70%乙醇中灭菌破裂盘和大载体固定架10分钟。在通风橱中风干。·将大载体浸泡在无水乙醇中以除去所有微量的Η20。在通风橱中风干。 打开氦气罐。将氦气罐调节器设定为1300psi (或高于破裂盘的额定值200psi)。轰击·将大载体急射到它们的固定架中。 将5 μ 1的金-DNA混合物吸移到大载体的中心上。混合物应均勻扩散开并且几 乎没有块。·将破裂盘置于定位环中并将环拧紧至氦桶。·将停止屏和带有金-DNA的大载体(在固定架中)置于锁定组件中并拧紧。·将组件置于真空室，水平1 (首先从顶部)。 放置样品，水平4。除去培养皿盖。·接通真空泵。·抽真空至 27-29 in. Hg。·按住并保持射击按钮直到破裂盘破裂。 释放真空并除去样品。·除去破裂盘、大载体以及停止屏。 如果需要的话，重复。·在实验结束时，关闭氦气罐。在枪中抽真空并通过枪释放剩余的氦，然后关闭氦 调节器。成功轰击的关键通常在于颗粒在大载体上的扩散。乙醇/金/DNA混合物应快速 扩散越过大载体的中心。所得的扩散应是颗粒的很细的涂粉，其均勻扩散并且几乎不包含 块。块会引起增加的细胞死亡。每30 μ 1金-DNA混合物给出4或5次轰击。剩余的混合物通常太稠密以致不可 能获得良好的结果。烟草制备和再生培养基MS =MS盐和维生素(IX)30g/l 蔗糖6g/l植物凝胶pH 5. 8高压灭菌器RMOP =MS 盐(IX)lmg/1 BAP0. lmg/1 NAA
100mg/l 肌醇30g/l 蔗糖6g/l植物凝胶pH 5. 8高压灭菌器RMOP-BAPpH 5. 8高压灭菌器MS+MS 培养基lmg/1 IBA (吲哚-3-丁酸)2μΜ 17-β-雌二醇pH 5. 8高压灭菌器组织培养·在包含MS培养基的洋红盒中利用无菌技术来微增殖烟草植物。·切除展开的叶并将背轴面置于位于RMOP培养基顶部的Whatman滤纸上。在轰 击滤纸以前，允许稍微干燥(1-2小时)叶子。每次轰击可以处理1-3片叶子，其覆盖大约 9cm培养皿的1/3。·轰击以后，密封平板并将叶子置于下的12:12光周期下2天。·在两天以后，将叶子切割成大约5mm2的部分并背轴面朝下地置于缺乏BAP的 RMOP培养基上。·绿色嫩芽可以收集自3-8周的漂白外植体。·切割来自这些嫩芽的叶子Omm2)并在相同选择性培养基中传代培养大约4周。 通常收集4个嫩芽/最初传代培养的嫩芽。这些嫩芽生根在包含MS培养基+Img/ 1 IBA禾口 2μ M 17-β-雌二醇的管中。·在分离后大约3-5周，将生根的嫩芽转移到土壤中。使植物在标准烟草条件 (16:8光周期，25°C )下生长。附注1.为了轰击，烟草叶子并不必须完全放平。2.在滤纸上2天以后烟草叶子将失去它们的膨胀。这是可行的。3.进行最少量的转移。需要完成的最大量的转移a.从在MS中生长的植物切除叶子。将叶子置于RMOP上的滤纸上。b.轰击以后2天，将叶外植体置于RMOP-BAP上。c. 3-8周以后，从绿色嫩芽除去叶子，切割，然后转移到RM0P-BAP。d.收集4个嫩芽，转移到在个别管中的MS+lmg/1 ΙΒΑ+2 μ M 17-β-雌二醇中。平均实验的转化频率是1. 5株稳定转化植物至0. 3株稳定转化植物/轰击。用于烟草叶绿体转化的培养基名称 组成容器 时间4MSSMS盐和维生素 洋红盒(IX)30g/l 蔗糖
6g/l植物凝胶
pH 5. 8
高压灭菌器
MFB1MS盐(IX) 培养皿(9cm) 2天
lmg/1 BAP
0.lmg/1 NAA
lmg/1硫胺素
100mg/l 肌醇
30g/l蔗糖
6g/l植物凝胶
pH 5. 8
高压灭菌器
MTS2MFB减去BAP 深培养皿 3-10周5
MFR3MSS 洋红盒 3-5周
lmg/1 IBA (吲
哚-3- 丁酸)
2μΜ 17-β-雌二
醇
附注1.MFB 用于轰击的培养基
2. MTS 用于转基因选择的培养基
3. MFR:用于生根的培养基
4.时间烟草叶子留在培养基中的时间
5.该时间包括第二选择时间
附录2
利用细胞分裂素和抗生素选择的用于质体转化的协议以及设备设
氦枪 Biorad PDS 1000
破裂盘PSI 1100
在破裂盘锁定盖和盖子上的大载体之间的间隙1/4"
在停止屏支座下方的间隔环2
大载体送出组件的水平1 (从顶部)
培养皿固定架的水平4(从顶部)
真空流入率最大
真空释放率减弱释放，使得它接近真空流入的速度。
原液
2. 5MCaCl2高压灭菌器或过滤消毒
在灭菌H2O中的IM亚精胺游离碱
dH20
在 dH20 或 IX TE 中的 1 μ g/ul 的 DNA
100%乙醇
·70% 乙醇消耗品.IlOOpsi 破裂盘 停止屏·大载体·金颗粒DNA-金颗粒混合物的制备·将50mg的金颗粒悬浮在Iml的无水乙醇中作为储备悬浮液。 取0. 25ml的金储备悬浮液并微离心5秒。除去乙醇并用无菌蒸馏H2O洗涤3次， 在洗涤之间微离心3分钟。·将金再悬浮在0. 25ml dH20中。 将50 μ 1等分部分的金-H2O悬浮液加入到埃彭道夫管中。·在每个埃彭道夫管中连续添加10 μ 1 DNA, 1 μ g/ μ 150 μ 1 的 2. 5Μ CaCl220 μ 1的0. IM亚精胺游离碱 以最高速度涡旋5分钟。·向每个管中添加200 μ 1无水乙醇。·在离心机以3000rpm旋转2秒。·除去尽可能多的上清液并在无水乙醇中冲洗沉淀物一次，在3000rpm下离心2秒。 将沉淀物再悬浮在30 μ 1无水乙醇中(制备4-5个弹丸)。在冰上储存混合物。制备基因枪和消耗品·用70%乙醇或70%异丙醇对枪真空室和表面进行灭菌。·在70%乙醇中灭菌破裂盘和大载体固定架10分钟。在通风橱中风干。·将大载体浸泡在无水乙醇中以除去所有微量的Η20。在通风橱中风干。 打开氦气罐。将氦气罐调节器设置为1300psi(或在破裂盘的额定值以上 200psi)。轰击·将大载体急射到它们的固定架中。
将5 μ 1的金-DNA混合物吸移到大载体的中心上。混合物应均勻扩散开并且几 乎没有块。·将破裂盘置于定位环中并拧紧到氦桶。·将停止屏和带有金-DNA的大载体(在固定架中)置于锁定组件中并拧紧。·将组件置于真空室中，水平1 (首先从顶部)。 将样品置于水平4。除去培养皿盖。·接通真空泵。·抽真空至 27_29in. Hg。·按住并保持射击按钮直到破裂盘破裂。
释放真空并除去样品。·除去破裂盘、大载体以及停止屏。 如果需要的话，重复。·在实验结束时，关闭氦气罐。在枪中抽真空并通过枪释放剩余的氦，然后关闭氦 调节器。附注1.成功轰击的关键通常在于颗粒在大载体上的扩散。乙醇/金/DNA混合物应快 速扩散越过大载体的中心。所得的扩散应是颗粒的很细的涂粉，其均勻扩散并且几乎不包 含块。并且块会引起细胞死亡。2.每30 μ 1金-DNA混合物给出4或5次轰击。剩余的混合物通常太稠密以致不 可能获得良好的结果。烟草制备和再生培养基MS =MS盐和维生素(IX)30g/l 蔗糖6g/l植物凝胶pH 5. 8高压灭菌器RMOP =MS 盐(IX)lmg/1 BAP0. lmg/1 NAAlmg/1 硫胺素1 OOmg/1 肌醇30g/l 蔗糖6g/l植物凝胶pH 5. 8高压灭菌器RMOP-BAP+ 壮观霉素500 μ g/ml 壮观霉素pH 5. 8高压灭菌器MS+ MS 培养基lmg/1 IBA (吲哚-3-丁酸)2μΜ 17-β-雌二醇pH 5. 8高压灭菌器组织培养·在包含MS培养基的洋红盒中利用无菌技术来微增殖烟草植物。·切除展开的叶并将背轴面置于位于RMOP培养基顶部的Whatman滤纸上。在轰
击滤纸以前，允许稍微干燥(1-2小时)叶子。每次轰击可以处理1-3片叶子，其覆盖大约 9cm培养皿的1/3。·轰击以后，密封平板并将叶子置于下的12:12光周期2天。·在两天以后，将叶子切割成大约5mm2的部分并背轴面朝下地置于缺乏BAP但包 含壮观霉素的RMOP培养基上。
·绿色嫩芽可以收集自3-8周的漂白外植体。·切割来自这些嫩芽的叶子Omm2)并在相同选择性培养基中传代培养大约4周。 通常收集4个嫩芽/最初传代培养的嫩芽。这些嫩芽生根在包含MS培养基+Img/ 1 IBA禾口 2μ M 17-β-雌二醇的管中。·在分离后大约3-5周，将生根的嫩芽转移到土壤中。使植物在标准烟草条件 (16:8光周期，25°C )下生长。
附注
为了轰击，烟草叶子并不必须完全放平。
在滤纸上2天以后烟草叶子将失去它们的膨胀。这是可行的。
进行最少量的转移。需要完成的最大量的转移
从在MS中生长的植物切除叶子。将叶子置于RMOP上的滤纸上。
轰击以后2天，将叶外植体置于RMOP-BAP+壮观霉素上。
3-8周以后，从绿色嫩芽除去叶子，切割，然后转移到RMOP-BAP+壮观霉素。
收集4个嫩芽，转移到在个别管中的MS+lmg/1 ΙΒΑ+2 μ Μ17- β -雌二醇中。
平均实验的转化频率为1. 5株稳定转化植物至0. 3株稳定转化植物/轰击。
用于烟草叶绿体转化的培养基
名称 MSS
MFB1
MTS'MFR3
组成
MS盐和维生素 (IX)
30g/l蔗糖 6g/l植物凝胶 pH 5. 8 高压灭菌器 MS 盐(IX) lmg/1 BAP 0. lmg/1 NAA lmg/1硫胺素 100mg/l 肌醇 30g/l蔗糖 6g/l植物凝胶 pH 5. 8 高压灭菌器 MFB减去BAP +壮观霉素 MSS
lmg/1 IBA (吲 哚-3- 丁酸) 2μΜ 17-β-雌:
容器 洋红盒
时间4
培养皿(9cm) 2天
深培养皿 3-10周
洋红盒
3-5周
36
附注1. MFB 用于轰击的培养基2. MTS 用于转基因选择的培养基3. MFR 用于生根的培养基4.时间烟草叶子留在培养基中的时间5.该时间包括第二选择时间附录3利用植物生长素选择的用于质体转化的协议设备设置氦枪Biorad PDS 1000 破裂盘 PSI :1100·破裂盘锁定盖和盖子上的大载体之间的间隙1/4〃·在停止屏支座下方的间隔环2·大载体送出组件的水平1 (从顶部)·培养皿固定架的水平4(从顶部)·真空流入率最大·真空释放率减弱释放，使得它接近真空流入的速度。原液· 2. 5M CaCl2高压灭菌器或过滤消毒·在灭菌H2O中的IM亚精胺游离碱· dH20·在 dH20 或 IX TE 中的 1 μ g/ul 的 DNA· 100% 乙醇·70% 乙醇消耗品.IlOOpsi 破裂盘·停止屏·大载体·金颗粒DNA-金颗粒混合物的制备·将50mg的金颗粒悬浮在Iml的无水乙醇中作为储备悬浮液。 取0. 25ml的金储备悬浮液并微离心5秒。除去乙醇并用无菌蒸馏H2O洗涤3次， 在洗涤之间微离心3分钟。·将金再悬浮在0. 25ml dH20中。 将50 μ 1等分部分的金-H2O悬浮液加入到埃彭道夫管中。·在每个埃彭道夫管中连续添加10 μ 1 DNA, 1 μ g/ μ 150 μ 1 的 2. 5Μ CaCl220 μ 1的0. IM亚精胺游离碱 以最高速度涡旋5分钟。
·向每个管中添加200 μ 1的无水乙醇。·在离心机以3000rpm旋转2秒。 除去尽可能多的上清液并在无水乙醇中冲洗沉淀物一次，在3000rpm下微离心2秒。 将沉淀物再悬浮在30 μ 1无水乙醇中(制备4-5个弹丸)。在冰上储存混合物。制备基因枪和消耗品·用70%乙醇或70%异丙醇对枪真空室和表面进行灭菌。·在70%乙醇中灭菌破裂盘和大载体固定架10分钟。在通风橱中风干。·将大载体浸泡在无水乙醇中以除去所有微量的Η20。在通风橱中风干。 打开氦气罐。将氦气罐调节器设置为1300psi(或在破裂盘的额定值以上 200psi)。轰击·将大载体急射到它们的固定架中。 将5 μ 1的金-DNA混合物吸移到大载体的中心上。混合物应均勻扩散开并且几 乎没有块。·将破裂盘置于定位环中并拧紧到氦桶。·将停止屏和带有金-DNA的大载体(在固定架中)置于锁定组件中并拧紧。·将组件置于真空室中，水平1 (首先从顶部)。 将样品置于水平4。除去培养皿盖。·接通真空泵。·抽真空至 27_29in. Hg。·按住并保持射击按钮直到破裂盘破裂。 释放真空并除去样品。·除去破裂盘、大载体以及停止屏。 如果需要的话，重复。·在实验结束时，关闭氦气罐。在枪中抽真空并通过枪释放剩余的氦，然后关闭氦 调节器。附注1.成功轰击的关键通常在于颗粒在大载体上的扩散。乙醇/金/DNA混合物应快 速扩散越过大载体的中心。所得的扩散应是颗粒的很细的涂粉，其均勻扩散并且几乎不包 含块。并且块会引起细胞死亡。2.每30 μ 1金-DNA混合物给出4或5次轰击。剩余的混合物通常太稠密以致不 可能获得良好的结果。烟草制备和再生培养基MS =MS盐和维生素(IX)30g/l 蔗糖6g/l植物凝胶pH 5. 8高压灭菌器RMOP =MS 盐(IX)0685]
0686]
权利要求
1. 一种用于产生转化植物细胞的方法，所述方法包括以下步骤 (i)用基因构建物转化所述植物细胞，其中，所述基因构建物包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件， 其中，所述第一和第二同源重组元件能够引导所述转化盒整合到存在于所述植物细胞 中的至少一种质体的基因组中， 其中，所述转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c)一种或多种转基因，(d)第一终止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件， (b2)可选的第二启动子，(b3)编码植物激素生物合成多肽IPT (异戊烯基转移酶)、iaaH(吲哚乙酰胺水解酶) 以及iaaM(色氨酸单加氧酶)的一个或多个核苷酸序列， (b4)第二终止元件， (b5)第二位点特异性重组元件，其中，所述第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别。
2.一种用于产生转化植物细胞的方法，所述方法包括以下步骤 (i)用基因构建物转化所述植物细胞，其中，所述基因构建物包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件， 其中，所述第一和第二同源重组元件能够引导所述转化盒整合到存在于所述植物细胞 中的至少一种质体的基因组中， 其中所述转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c)一种或多种转基因，(d)第一终止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件， (b2)可选的第二启动子，(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中，所述第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述方法另外包括以下步骤 ( )用缺乏一种或多种所述植物激素生物合成多肽的培养基选择转化植物细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述方法另外包括以下步骤 (iii)在所述植物细胞中表达重组酶，其中所述重组酶是识别所述第一和第二位点特异性重组元件的重组酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二位点特异性重组元 件是Iox位点。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述重组酶是Cre重组酶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述植物激素生物合成多肽是涉及 植物细胞分裂素或植物生长素或其它植物生长调节剂的合成、或调节植物细胞分裂素或植 物生长素或其它植物生长调节剂的生产或代谢的多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述植物激素生物合成多肽选自IPT(异戊烯基 转移酶)、iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)以及iaaM (色氨酸单加氧酶)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种转基因中的至少一 种编码抗体、抗生素、除草剂、疫苗抗原、酶、酶抑制剂或设计肽。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，选择所述同源重组元件的核苷酸序 列，使得所述转化盒特异性地靶向一种或多种所选的质体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，选择所述同源重组元件的核苷酸序 列，使得没有或基本上没有转化盒被整合到所述植物的核基因组中。
12.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，其中，步骤(iii)包括从可操作性连 接至核苷酸序列的可诱导启动子诱导所述植物细胞中重组酶的表达，所述核苷酸序列编码 存在于所述植物细胞中的重组酶，其中所述重组酶识别所述第一和第二位点特异性重组元 件。
13.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，其中，步骤(iii)包括在步骤(i) 以前、与步骤⑴同时或在步骤⑴以后；或在步骤(ii)以前、与步骤(ii)同时或在步骤 ( )以后，用重组酶载体转化所述植物细胞，其中所述重组酶载体包括可操作性连接至编 码重组酶的核苷酸序列的启动子。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述重组酶载体包括可操作性连接至核苷酸 序列的启动子，其中所述核苷酸序列编码靶向质体的转运肽和重组酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述靶向质体的转运肽是能够将所述重组酶 靶向叶绿体的转运肽。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述启动子是可诱导启动子。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述编码植物激素生物合成多肽的 核苷酸序列和所述第二终止元件在所述第一启动子的下游，其中所述第一启动子能够驱动 所述植物激素生物合成多肽的表达。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，包括(bl)第一位点特异性重组元件，(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中所述第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别；(C) 一种或多种转基因， (d)第一终止元件，在5’ -3’方向上以上面规定的次序可操作性地进行连接。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，与所述第一启动子、转基因以及 第一终止元件相比，所述切除盒处于反方向，并且所述切除盒包括第二启动子，所述第二启 动子能够驱动编码所述植物激素生物合成多肽的核苷酸序列的表达。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c)一种或多种转基因，(d)第一终止元件，其中(a)、(b)、(c)以及(d)在5’ -3’方向上以上面规定的次序可操作性地进行连接，其中所述切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件，(b2)第二启动子，(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中所述第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别，并且 其中可操作性连接所述切除盒的部分(bl)-(b5)，并且 其中，与(a)、(c)以及(d)相比，所述切除盒处于反方向。
21.一种用于产生转化植物细胞的方法，所述方法包括以下步骤 (i)用基因构建物转化所述植物细胞，其中所述基因构建物包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件， 其中所述第一和第二同源重组元件能够引导所述转化盒整合到存在于所述植物细胞 中的至少一种质体的基因组中， 其中所述转化盒包括(a)在所述植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c)一种或多种转基因，(d)第一终止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件， (b2)可选的第二启动子(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，其中所述多肽 之一是IPT，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中所述第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别，并且其中所述第一和第二位点特异性重组元件是Iox元件而所述重组酶是ere。
22.根据权利要求21所述的方法，另外包括以下步骤(ii)用缺乏IPT的培养基选择 转化植物细胞；以及(iii)在所述植物细胞中以导致从所述质体基因组切除所述切除盒的 水平表达Cre重组酶。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述转化盒另外包括编码赋予对抗 生素抗性的多肽的核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述抗生素是壮观霉素。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述植物选自由谷类(水稻、小麦、 大麦、燕麦、高粱、玉米)、豆科作物(苜蓿、扁豆、花生、豌豆、大豆)、油料作物(棕榈、向日 葵、椰子、油菜、橄榄)、经济作物(棉花、甘蔗、木薯)、蔬菜作物(马铃薯、番茄、胡萝卜、甘 薯、甜菜、南瓜、黄瓜、莴苣、椰菜、花椰菜、食荚菜豆、卷心菜、芹菜、洋葱、大蒜)、水果/树木 和坚果(香蕉、葡萄哈密瓜、香瓜、西瓜、草莓、橘子、苹果、芒果、鳄梨、桃、葡萄柚、菠萝、枫、 杏仁)、饮料(咖啡、茶、可可粉)、木材树(栎树、黑胡桃、悬铃木)、藓类以及浮萍组成的组。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述植物是烟草或莴苣。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述植物细胞是个体细胞、细胞群、 以分离形式或未分离形式，作为植物组织或植物部分的一部分，或原生质体或植物液体培 养物。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述植物细胞存在于植物叶片中。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述质体选自叶绿体、白色体、造粉 体、黄化质体、色质体、油质体以及老年质体。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述质体是绿色质体。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述质体是叶绿体。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二启动子是 PsbA, RbcL 或 Prrn 启动子。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二终止子是rrn、 psbA、rbcL或T7终止子。
35.一种用于产生植物的方法，包括通过根据前述权利要求中任一项所述的方法产生 植物细胞，并且由所述植物细胞再生植物。
36.一种通过根据权利要求1至34中任一项所述的方法获得或可获得的转化植物细胞。
37.一种通过根据权利要求35所述的方法获得或可获得的植物。
38.一种用于产生转基因产品的方法，包括根据前述权利要求中任一项所述的方法，以 及另外包括以下步骤纯化或分离所述转基因产品，以及可选地包装所述转基因产品。
39.一种通过根据权利要求38所述的方法获得或可获得的纯化或分离的转基因产品。
40.根据权利要求38所述的方法或根据权利要求39所述的纯化或分离的转基因产品， 其中，所述转基因产品是抗体、抗生素、除草剂、疫苗抗原、酶、酶抑制剂或设计肽。
41.一种基因构建物，包括旁侧转化盒的第一和第二同源重组元件，其中，所述第一和第二同源重组元件能够引导所述转化盒整合到存在于植物细胞中的 至少一种质体的基因组中， 其中所述转化盒包括(a)在植物细胞中可操作的第一启动子，(b)切除盒，(c)一种或多种转基因，(d)第一终止元件， 其中所述切除盒包括(bl)第一位点特异性重组元件， (b2)可选的第二启动子(b3)编码一种或多种植物激素生物合成多肽的一个或多个核苷酸序列，(b4)第二终止元件，(b5)第二位点特异性重组元件，其中所述第一和第二位点特异性重组元件能够由重组酶识别。
42.根据权利要求41所述的基因构建物，其中，所述第一和第二位点特异性重组元件 是Iox位点。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的基因构建物，其中，所述重组酶是Cre重组酶。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的基因构建物，其中，所述植物激素生物合成 多肽是涉及植物细胞因子或植物生长素或其它植物生长调节剂的合成、或调节植物细胞因 子或植物生长素或其它植物生长调节剂的生产或代谢的多肽。
45.根据权利要求44所述的基因构建物，其中，所述植物激素生物合成多肽选自 IPT (异戊烯基转移酶)、iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)以及iaaM (色氨酸单加氧酶)。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的基因构建物，其中，选择所述同源重组元件 的核苷酸序列，使得所述转化盒特异性地靶向一种或多种所选的质体。
47.根据权利要求41至46中任一项所述的基因构建物，其中，选择所述同源重组元件 的核苷酸序列，使得没有或基本上没有转化盒被整合到所述植物的核基因组中。
48.一种植物细胞或植物或植物种子，包括根据权利要求41至47中任一项所述的基因 构建物。
49.一种植物、植物细胞或植物种子，包括根据权利要求48所述的基因构建物，其中， 编码一种或多种植物激素生物合成肽(b3)的一个或多个核苷酸序列、以及可选的所述可 选的第二启动子(b2)和/或第二终止元件(b4)已从所述切除盒中切除，优选通过重组酶 对所述第一和第二位点特异性重组元件的作用。
50.一种用于产生转基因产品的方法，包括纯化或分离、以及可选地包装来自权利要求 48或49所述的植物细胞、植物或植物种子的转基因产品。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述转基因产品是抗体、抗生素、除草剂、疫苗 抗原、酶、酶抑制剂或设计肽。
52.一种通过根据权利要求50或51所述的方法获得或可获得的转基因产品。
全文摘要
本发明涉及一种用于产生转化植物细胞的方法。更具体地，该方法涉及用转化盒转化植物细胞，其中转化盒靶向植物质体并且包括选择基因，例如异戊烯基转移酶(IPT)，以及转基因。在选择转化质体以后，在植物细胞中诱导重组酶的表达，其导致从质体切除选择基因以及在质体中表达转基因。本发明还提供了包含转化盒的细胞和植物。
文档编号C12N15/82GK102137933SQ200980121779
公开日2011年7月27日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者约迪·马普勒, 蔡南海, 西蒙·盖尔·默勒 申请人:普拉斯泰德股份有限公司