用于生成rna病毒的新方法

专利名称：用于生成rna病毒的新方法
用于生成RNA病毒的新方法本发明提供了一种在辅助病毒存在下使用线性表达构建物生成负链区段化RNA 病毒的方法。
背景技术：
负链RNA病毒是一组动物病毒，其包含数种重要人类病原体，包括流感、麻疹、腮腺炎、狂犬病、呼吸道合胞、埃博拉(mx)la)和汉坦病毒(hantavirus)。这些RNA病毒的基因组可以是单分子的或区段化的，而且是单链(_)极性的。这些病毒共享两项关键要求它们的基因组RNA必须有效拷贝成病毒RNA，即可用于掺入后代病毒颗粒的形式及转录成mRNA，其翻译成病毒蛋白质。真核宿主细胞通常不含用于复制RNA 模板或用于自负链RNA模板翻译多肽的机制。因此，负链RNA病毒编码并携带RNA依赖性 RNA聚合酶来催化新基因组RNA (供装配成后代病毒)和mRNA (供翻译成病毒蛋白质)的合成。为了传播病毒，基因组病毒RNA必须包装成病毒颗粒。装配期间发生的后代病毒颗粒装配和蛋白质/蛋白质相互作用的过程在RNA病毒内是相似的。病毒颗粒的形成确保了 RNA基因组自一个宿主细胞高效传播至同一宿主或不同宿主生物体的另一个宿主细胞。含有包膜单链RNA及负链基因组的病毒科被分成非区段化基因组的组(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)和波尔那病病毒(Borna Disease Virus)、披盖病毒科(Togaviridae))和具有区段化基因组的组(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、本扬病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科 (Arenaviridae))。正粘病毒科包括甲型、乙型和丙型流感病毒，以及索哥托(Thogoto)和多理(Dhori)病毒和传染性鲑鱼贫血病毒。流感病毒体由含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋状核壳)和内部以基质蛋白(Ml)衬里的外部脂蛋白包膜组成。甲型流感病毒的区段化基因组由8个分子的线性、负极性、单链RNA组成，它们编码11种多肽(有些甲型流感株是10种)，包括RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；两种自含脂包膜凸出的表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NSl)和核输出蛋白(NEP)。大多数甲型流感株还编码第11种认为具有促凋亡特性的蛋白(PB1-F2)。病毒基因组的转录和复制在核中进行，而装配经质膜上的出芽来进行。病毒在混合感染期间能重配基因。流感病毒经HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酰寡糖。在对病毒体的内吞之后，细胞内体内发生HA分子的构象变化，这促进膜融合，如此触发脱壳。 核壳迁移至核，在那里病毒mRNA转录。病毒mRNA被独特机制转录，其中病毒内切核酸酶自细胞异源mRNA切割带帽的5'-末端，然后充当病毒转录酶转录病毒RNA模板的引物。转录物在距它们模板末端15至22个碱基的位点处终止，其中oligo(U)序列起添加poly(A) 串的信号的作用。在如此生成的八种病毒RNA分子中，六种是单顺反子信息，它们直接翻译成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白PB2、PB1和PA的蛋白质。另两种转录物进行剪接，各自产生两种mRNA，它们翻译成不同读码框以生成M1、M2、NS1和NEP。换言之，八种病毒RNA 区段编码十一种蛋白质九种结构和两种非结构(NSl和最近鉴定的PB1-F2)蛋白。
针对流感病毒(尤其是高致病性禽流感病毒)的现代疫苗的生成依赖于使用反求遗传学，其容许自DNA生成流感病毒。用于构建负链RNA流感病毒的第一种反求遗传学系统涉及转染与体外重建的核糖核蛋白(RNP)复合物混合的单一病毒基因及随后感染流感辅助病毒。RNP复合物通过将合成的RNA转录物与自流感病毒纯化的NP和聚合酶蛋白 (PBU PB2和PA) —起温育来制备，而且使用辅助病毒作为病毒蛋白质和其它vRNA的胞内来源(Luytjes et al.，1989，Cell，59，1107-1113)。Neumann et al.，1994，Virology，202，477-479 实现了自鼠类 RNA聚合酶 I 启动子响应性质粒表达RNA后在流感感染的细胞中病毒模型RNA的RNP形成。Pleschka et al., 1996，J. Virol.，4188-4192记载了一种方法，其中自基于质粒的表达载体重建RNP复合物。 病毒RNA样转录物的表达是自含有截短型人类聚合酶I (poll)启动子和通过自催化切割生成3'末端的核酶序列的质粒实现的。将poll驱动的质粒与表达病毒PB1、PB2、PA和NP蛋白的polll响应性质粒一起共转染入人类293细胞中。然而，转染效率非常低，大约10个转染子病毒颗粒每次转染。另外，这种基于质粒的策略依赖于辅助病毒的帮助。在WO 01/04333中，使用一组12种用于表达基因组VRNA区段和RNP蛋白质的表达质粒构建了区段化负链RNA病毒。WO 01/04333中记载的载体基于公知的pUC19或pUC18 质粒。依照说明书，这种系统需要一组8种表达流感病毒的所有8种区段的质粒以及另一组4种表达核蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶亚基(PB1、PB2、PA和NP)的质粒。WO 00/60050涵盖一组至少2种含有启动子，可操作连接流感病毒区段cDNA(PA、 PBU PB2、HA、ΝΡ、ΝΑ、Μ)和连接转录终止序列的载体，和至少2种含有启动子，可操作连接流感病毒区段DNA(PA、PB1、PB2、NP)的载体。这种系统试图通过使用如下的质粒来克服使用多种不同载体时的困难，其中用于病毒RNA合成的八种RNA聚合酶I转录盒组合在一个质粒上。WO 01/83794披露了包含插入RNA聚合酶II (polll)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号的环状表达质粒。依照本申请，术语载体描述为质粒一般为能接受别的外来DNA且能容易导入合适宿主细胞中的双链DNA的独立分子。WO 2009/00891记载了一种线性表达构建物及其用于表达流感病毒基因区段的用途。Ozawa M. et al，J. Virol，2007，vol. 81，pp. 9556-9559 记载了一种使用腺病毒载体来生成甲型流感病毒的反求遗传学系统。Hoffmann Ε. et al, Virology, 2000, 267, PP. 310-317披露了一种使用双向转录构建物自一个模板生成病毒RNA和mRNA来创建流感病毒的系统。自八种质粒挽救乙型流感病毒也披露于Hoffmann et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.,2002,99,pp.11411-11416。由病毒病引起的流行和大流行仍在夺走人类生命及影响全球经济。流感对全世界数以百万计的工作日损失和拜访医生、数以十万计的住院治疗(Couch 1993,Ann. NY. Acad. Sci 685 ;803)、数以万计的过量死亡(Collins &Lehmann 1953Public Health Monographs 213 1 ；Glezen 1982 Am. J. Public Health 77 :712)和数以十亿欧元计的健康护理花费(Williams et al. 1988, Ann. Intern. Med. 108 616)负有责任。当健康成年人获得免疫时，当前可得的疫苗在70-90%的情况中预防临床疾病。此水平在65岁以上人中降低至30-70%并在居住于老人之家的65岁以上人中进一步下降(Strategic Perspective 2001 :The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59)。病毒频繁的抗原性变化进一步促成大量死亡人数，因为即时每年进行疫苗接种也不能保证获得保护。因此，美国的死亡人数自1976/77年的16，363人上升至1998/99年多达四倍的死亡(Wall Street Journal, Flu-related deaths in US despite vaccine researches. January 7,2003)。尤其在大流行病毒病爆发的情况中，在疾病爆发后立即提供疫苗接种或处理会是极度重要的。鉴于提供对病毒病的有效保护和处理的迫切需要，仍然非常需要开发经济、快速且有效的表达系统来生产病毒，这能克服当前表达技术的缺点和困难及提供病毒表达的替代方法。通过提供本申请的实施方案，实现了该目的。发明概述本发明提供了一种备选技术，其中使用线性表达构建物在辅助病毒存在下表达 RNA病毒。令人惊讶地发现，在辅助病毒存在下使用至少一种不含任何扩增和/或选择序列、包含插入RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号、包含插入poll启动子和poll终止信号之间的HA或NA基因区段的线性表达构建物为快速挽救病毒颗粒提供了一种有效工具。与已知技术使用的方法不同， 不需要细菌细胞中的克隆步骤，而且不需要用病毒基因组的所有区段转染宿主细胞。具体地，只用一种或两种区段即编码HA和/或NA蛋白的基因转染可足以表达完整病毒。因此， 转染和表达足够量的病毒颗粒所需要的时间可大大缩短。例如，PCT/EP2008/058182(通过述及而收入本文)中记载的线性表达构建物可用于在辅助病毒存在下开发包含RNA病毒的疫苗，具体是野生型、突变型或重配株的流感病毒。这为在发生流感流行或大流行的情况中所需要的快速生成任何病毒疫苗提供了一种工具。另外，本发明为清除辅助病毒提供了一种改良方法，并为改良的选择和纯化提供了具有改良切割位点的HA区段。附图
简述图Ia和Ib是示意图，图示了线性双向表达构建物的生成。图Ia显示了通过PCR 扩增分开生成的片段F1、F2和F3。图Ib显示了使用寡核苷酸P4和P6通过交叠PCR生成的片段F4。发明详述本发明涵盖一种用于生成负链区段化RNA病毒的方法，包括下述步骤a)提供不含任何扩增和/或选择序列的线性表达构建物，该构建物包含插入RNA 聚合酶II (POlII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，该构建物进一步包含插入poll启动子和poll终止信号之间的HA和/或NA基因区段，b)用所述线性表达构建物转染宿主细胞，c)用具有辅助病毒HA和/或NA蛋白的辅助病毒感染所述宿主细胞，d)培养所述宿主细胞以扩增病毒颗粒，e)选择如下的病毒颗粒
(i)含有自所述线性表达构建物衍生的HA和/或NA蛋白，但(ii)不含辅助病毒HA和NA蛋白或其区段，其中所述选择是基于HA和/或NA蛋白的表型、基因型或抗原性特性，且任选其中辅助病毒HA和NA蛋白的缺失是通过分析核酸或氨基酸序列来确定的。更具体的，用于生产负链、区段化RNA病毒颗粒的方法可包括下述步骤，提供不含扩增序列、选择序列、或扩增序列和选择序列二者的线性表达构建物，其中所述构建物包含 RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，poll启动子和poll终止信号插入RNA聚合酶 II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间，其中所述线性表达构建物进一步包含插入poll 启动子和poll终止信号之间的HA基因区段、NA基因区段、或HA基因区段和NA基因区段二者；用所述线性表达构建物转染宿主细胞；用辅助病毒感染所述宿主细胞，其中所述辅助病毒包含编码HA蛋白、NA蛋白、或HA蛋白和NA蛋白二者的基因组RNA ；培养所述宿主细胞，由此生成后代病毒颗粒，其中至少一些所述后代病毒颗粒包含自所述线性表达构建物衍生的HA蛋白或NA蛋白；并在所述后代病毒颗粒中选择候选病毒颗粒，其中所述候选病毒颗粒i)包含自所述线性表达构建物衍生的HA蛋白且不含自所述辅助病毒衍生的HA蛋白，如果所述线性表达构建物包含HA基因区段的话；且ii)包含自所述线性表达构建物衍生的NA蛋白且不含自所述辅助病毒衍生的NA 蛋白，如果所述线性表达构建物包含NA基因区段的话。依照本发明，用至少一种包含HA或NA基因区段的线性表达构建物转染宿主细胞。 优选地，用至少两种线性表达构建物转染宿主细胞，其中一种线性构建物包含HA基因区段而另一种线性构建物包含NA基因区段。选择候选病毒颗粒的步骤可进一步包括分析候选病毒颗粒的氨基酸序列以确定候选病毒颗粒不包含辅助病毒的HA氨基酸序列或NA氨基酸序列或分析候选病毒颗粒的核酸分子以确定候选病毒颗粒不包含辅助病毒的HA核苷酸序列或NA核苷酸序列。“线性表达构建物”依照本发明定义为不含任何扩增和/或选择序列，而且包含插入RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I(poll)启动子和 poll终止信号且包含插入poll启动子和poll终止信号之间的基因区段。优选地，线性表达构建物不含在细菌细胞中扩增质粒所需要的任何选择或扩增序列。不需要含有起点(复制起点)序列或抗生素抗性基因或任何其它选择标志。如果需要的话，可使用短接头序列来环化线性表达构建物。依照本发明的一个具体实施方案，线性表达构建物可包含DNA分子以外的分子， 诸如构建物N和/或C端处别的保护序列。例如，这些保护序列可以是肽核酸序列(PNA)， 如TO 00/56914中记载的。这些PNA为核酸类似物，其中整个脱氧核糖-磷酸酯骨架用化学上完全不同但结构上同源的含有2-氨基乙基甘氨酸单元的聚酰胺(肽)骨架置换。PNA “钳”也显示出提高稳定性，其中通过含有三个8-氨基-3，6-二氧心酸单元的柔性发卡接头连接两个相同的PNA序列。当PNA与互补的高嘌呤(homopurine)或高嘧啶 (homopyrimidine) DNA靶序列混合时，可形成极度稳定的PNA-DNA-PNA三元杂合物(Bentin et al. ,1996, Biochemistry,35,8863—8869, Egholm et al. ,1995, Nucleic Acids Res., 23,217-222,Nielsen et al. , Science,1991,254,1497-1500,Demidov et al. ,Proc. Natl.Acad. Sci. , 1995,92, 2637-2641) 它们显示出对核酸酶和蛋白酶消化有抗性(Demidov et al.，Biochem. Pharm.，1994，48，1010-1013)。病毒基因区段可以是所述区段的cDNA拷贝或 RT-PCR扩增产物。具体地，本发明提供了一种用于表达和生产RNA病毒的方法，包括下述步骤a)用包含HA基因区段的线性表达构建物和/或包含NA基因区段的线性表达构建物和任选地包含选自PB1、PB2、PA、NS、M、NP的别的基因区段或至少其部分的线性表达构建物转染宿主细胞，b)用辅助病毒感染所述宿主细胞，c)培养所述经过感染的宿主细胞以扩增病毒，d)选择至少含有自所述线性表达构建物衍生的HA和/或NA蛋白的病毒颗粒。所述选择可基于非辅助病毒起源的HA或NA蛋白的基因型、表型或抗原性特性来实施。可使用任何已知区分包含不同序列、不同表型特征或不同抗原性特征的蛋白质的选择方法。具体地，可使用本发明中描述的选择标准。来自辅助病毒起源和非辅助病毒起源的HA和NA蛋白区别在于核苷酸和氨基酸序列，因此可使用本领域公知的序列比较方法来鉴定包含自线性表达构建物衍生的HA或NA序列的病毒。“衍生自”表达构建物或病毒的核酸分子为那些包含表达构建物或病毒的核苷酸序列或互补序列的，而且一般因用于生产该分子的细胞培养或其它培养基中存在表达构建物或病毒而生成。“衍生自”表达构建物或病毒的蛋白质为那些自表达构建物或病毒的核苷酸序列或互补序列翻译的，而且一般因用于生产蛋白质的细胞培养或其它培养基中存在表达构建物或病毒而生成。在使用至少一种线性表达构建物之外，本领域已知的用于实施反求遗传学技术的质粒可用于表达病毒蛋白和/或病毒基因组的别的区段。这些质粒记载于例如Hoffmann et al.，Vaccine 2002，2(^25- )，3165-3170，通过述及而收入本文。具体地，这些表达质粒包含编码PB1、PB2、PA、NS、ΝΑ、HA、M或NP的区段或其部分。术语“HA蛋白和NA蛋白”依照本发明分别定义为HA或NA蛋白的完整氨基酸序列或所述序列的一部分，其中所述部分足以诱导与野生型HA或NA蛋白产生的应答相似或相等的针对所述HA或NA蛋白的免疫应答。优选地，HA或NA蛋白包含完整蛋白质的HA或NA 氨基酸序的至少70%，优选至少90%，更优选至少95%。免疫原性方面的功能性等同物可例如在动物模型中测试(Lu et al.，J. Virol.，1999，5903-5911 或 Boyd M. R. and Beeson Μ. F. , J. Antimicrobial Chemotherapy,1975. 43-47)。辅助病毒为在生成没有能力自己复制的辅助病毒依赖性病毒载体的拷贝时使用的病毒。辅助病毒用于与病毒载体一起共感染细胞并提供复制病毒载体的基因组所必需的酶。术语“辅助病毒”定义为任何包含至少一种与要生成的病毒相同的基因区段且通过提供生成完整病毒颗粒所需要的至少一种病毒区段和/或至少一种病毒蛋白质能支持病毒生成的病毒。在本发明的方法中一般在用线性表达构建物转染之后将辅助病毒添加至宿主细胞，但依照一种备选方法，可在用包含HA和/或NA基因区段的表达构建物转染宿主细胞之前为了感染将辅助病毒添加至宿主细胞。可通过所述方法来表达的RNA病毒可以是任何包含在功能上等同于这些结构的HA和/或NA基因区段或结构的RNA病毒。术语“在功能上等同的结构”意指具有受体结合和融合活性的病毒蛋白质。RNA病毒可选自下组流感病毒(具体是甲型、乙型或丙型流感病毒)，冠状病毒， 呼吸道合胞病毒，新城病病毒。在依照本发明的方法中可用于培养病毒的细胞可以是任何期望类型的，可以培养且可以被包膜病毒(具体是流感病毒)感染的细胞。具体地，它可以是BSC-I细胞、LLC-MK 细胞、CV-I细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠类细胞、人类细胞、HeLa细胞、293细胞、VERO细胞、 CEK (鸡胚肾)CEF (鸡胚成纤维细胞)、MDBK细胞、MDCK细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、W1-38细胞、MRC-5细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、 SP2/0细胞、NS0, PerC6 (人类视网膜细胞)。依照本发明的方法，可通过已知方法来转染宿主细胞，例如通过电穿孔。可在本领域已知的标准条件下培养宿主细胞培养以复制病毒，特别是直至能检测到最大细胞致病效应或最大量的病毒抗原。或者，可在培养期间的任何时间点收获。用于培养宿主细胞的pH可以例如介于6. 5和7. 5之间。用于培养的pH取决于用于培养的宿主细胞的PH稳定性。这可通过在不同pH条件下测试宿主细胞的存活力来确定。本领域公知，世界卫生组织(WHO)每年推荐为针对流感流行进行的一年一度的疫苗接种制备疫苗株中使用的野生型病毒。然后可以将这些株用于生产重配疫苗株，它们一般组合野生型病毒的NA和/或HA基因与自具有某些期望特征的供体病毒(常常称作主供体病毒或MDV)衍生的其余基因区段。例如，MDV株可以是冷适应的和/或温度敏感的和/ 或减毒的和/或具有高生长速率。依照本发明，病毒颗粒优选包含为季节性疫苗接种目的推荐的病毒株或显示出具有高免疫原性的病毒株(在大流行病毒的情况中)的HA和/或 NA蛋白。对包含所述表面蛋白的病毒的选择可基于使所述蛋白质有别于辅助病毒起源的 HA和NA蛋白的表型、基因型或抗原性特性。辅助病毒起源的HA和NA蛋白使所述蛋白质有别于非辅助病毒起源(像选定病毒)的HA和NA蛋白的表型特性包含例如HA活化的切割位点的差异，或者对低pH的稳定性不同。辅助病毒HA可含有依赖于与活化疫苗病毒的HA的蛋白酶不同的蛋白酶的蛋白水解活化的切割位点。辅助病毒还可展现比疫苗病毒要低的对低PH的稳定性。对含有疫苗病毒的HA和NA的病毒的选择还可基于抗原性特性。通过使用与疫苗病毒(例如H1N1)不同亚型的辅助病毒(例如H3N2)，可通过对辅助病毒亚型(例如H3N2)特异性的抗血清来遏制辅助病毒的生长。可用于选择的基因型特征包括辅助病毒起源的HA和/或NA区段与非辅助病毒起源的HA和NA蛋白之间的核酸或氨基酸序列差异。用于进行序列分析的方法是本领域公知的。基于核苷酸序列差异，可以设计对辅助病毒的HA和/或NA特异性的例如 siRNA或反义寡核苷酸。通过转染这些siRNA或反义寡核苷酸可遏制辅助病毒生长。一个选项可以是通过用不切割辅助病毒起源的HA蛋白但切割并由此活化重配病毒的HA蛋白的蛋白酶处理将包含辅助病毒起源的HA蛋白的病毒颗粒与候选病毒颗粒分开。例如，蛋白酶可选自下组胰蛋白酶，弹性蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。例如，辅助病毒的HA蛋白可修饰成例如通过被蛋白酶切割来活化，其中所述蛋白酶不是胰蛋白酶，而最终的疫苗病毒的HA蛋白被胰蛋白酶切割。由此，提供了一种简单且可行的选择系统。这可通过修饰切割位点来实施。可通过诱变诸如PCR-诱变来改变可用作辅助病毒的病毒株的HA区段以含有受到弹性蛋白酶而非胰蛋白酶蛋白水解活化的切割位点。例如，切割位点周围的氨基酸序列可以是PSIQPI/GLFGA(切割位点以/指示)。为了使不想要的回复事件最小化，如下选择密码子，即优选必须有至少两处核苷酸变化每个密码子以引起回到初始氨基酸的回复。或者，可通过提供低pH条件来将包含辅助病毒起源的HA和NA蛋白的病毒颗粒与包含自线性构建物表达的NA或HA蛋白的候选病毒颗粒分开。由于HA蛋白内的修饰，在细胞培养中(具体地在Vero细胞培养中)培养数代的病毒颗粒显示与来自临床隔离群的包含野生型HA和/或NA蛋白的株相比降低的对低pH的稳定性。如此，在低pH条件(即介于5. 2和6. 2之间的pH)下处理辅助病毒导致辅助病毒的扩增速率降低，并因此导致对包含未修饰HA和/或NA蛋白的候选病毒颗粒的选择。作为本发明的又一个备选实施方案，通过用含有中和或结合辅助病毒起源的HA 和/或NA蛋白的抗体的抗血清处理，将包含所述辅助病毒起源的HA和/或NA蛋白的病毒颗粒与候选病毒颗粒分开。还可依照本发明实施不同方法的组合来清除不想要的HA和NA蛋白。依照本发明的一个具体实施方案，辅助病毒颗粒可包含与野生型病毒的NA蛋白相比活性降低的NA蛋白。在这个实施方案中，辅助病毒可缺少功能性NA蛋白，即使病毒能自宿主细胞释放的NA蛋白，或者可完全缺少NA蛋白。依照又一个备选实施方案，辅助病毒包含丙型流感病毒起源的HEF蛋白。丙型流感病毒只有一种主要表面糖蛋白，即HEF (血凝素酯酶融合物)，其在功能上等同于HA蛋白。HEF蛋白可例如用胰蛋白酶或TPCK胰蛋白酶来活化(Gao et al. , J.Virol. ,2008, 6419-6426，通过述及而收入本文)。或者，本发明具体要求保护如下的经过修饰的流感病毒，其包含可通过引入外来蛋白酶切割位点(例如弹性蛋白酶切割位点)来修饰的病毒糖蛋白。作为本发明的另一种备选实施方案，通过用中和或结合辅助病毒起源的HEF蛋白的抗体处理来清除包含所述HEF蛋白的病毒颗粒。作为另一种备选，辅助病毒可包含冠状病毒的HA蛋白。在生产甲型流感病毒的情况中，或者，可使用来自B型流感起源的HA和/或NA蛋白。用于疫苗生产的病毒以及辅助病毒可具体是流感病毒起源的，更具体地，它可以是减毒型流感病毒。依照一个具体的实施方案，流感病毒是减毒型流感病毒。具体地，流感病毒在抑制宿主细胞的先天性免疫应答的病原性因子内包含删除或修饰。例如，减毒可衍生自冷适应病毒株或由于NSl基因内的删除或修饰(ANSI病毒)，如W099/64571和W099/64068中记载的，通过述及而完整收入本文。“修饰”涉及与野生型NSl序列相比替代或删除一个或多个核酸。NS基因内的修饰可产生在干扰素胜任(competent)细胞中生长缺陷的病毒颗粒。 生长缺陷意味着这些病毒复制缺陷，因为它们在动物的呼吸道中进行中断的复制。或者，病毒可包含PB1-F2基因的删除或修饰。依照本发明的方法可具体用于生成包含功能性NSl 蛋白的删除的流感病毒。
依照本发明，辅助病毒可含有至少4种、优选至少5种、优选6种与待生成的病毒相同的区段。具体地，这些区段是？81、？82、？々、呢、] 、赂。辅助病毒可通过已知的反求遗传学技术或通过替代技术像病毒重配来生成。术语“重配株(reassortant) ”在提及病毒时指示病毒包括自超过一种亲本病毒株或来源衍生的遗传和/或多肽成分。例如，7 1重配株包括7种自第一亲本病毒衍生的病毒基因组区段(或基因区段)和1种来自第二亲本病毒的补充性病毒基因组区段，例如编码血凝素或神经氨酸酶。6 2重配株包括6种来自第一亲本病毒的基因组区段(最常见的是6种内部基因)和2种来自不同亲本病毒的补充性区段(例如血凝素和神经氨酸酶)。Egorov et al.，1998 J. Virol. 1998 Aug ；72 (8) :6437-41 ；Egorov et al. , Vopr. Virusol. ,39 :201-205记载了一种用于生成包含NSl删除的辅助病毒的方法。由此，使用在NS基因内包含温度敏感性突变Hl甲型流感病毒作为基础病毒，进一步修饰以产生只能在干扰素缺陷细胞中生长的完全删除的NS基因。本发明还涵盖包含序列PSIQPIGLFGA(SEQ ID NO. 7)的HA多肽。本发明还涵盖包含下述序列的HA核苷酸序列或其片段AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAAGCAAAACTACTGGTCCTGTTATGTACATTTA CAGCTACATATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCCAACAACTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTTGAG AAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTCAACCTACTTGAGGACAGTCACAATGGAAAACTATGTCTACTAAAAGGAAT AGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATTACTGATTTCCA AGGAATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAATCCTGAGAATGGAACATGTTACCCAGGGTATTTCGCCGACTAT GAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGTTCAGTATCTTCATTTGAGAGATTCGAAATATTCCCCAAAGAAAGCTCATGGCC CAACCACACCGTAACCGGAGTATCAGCATCATGCTCCCATAATGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGC TGACGGGGAAGAATGGTTTGTACCCAAACCTGAGCAAGTCCTATGTAAACAACAAAGAGAAAGAAGTCCTTGTACTA TGGGGTGTTCATCACCCGCCTAACATAGGGAACCAAAGGGCCCTCTATCATACAGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGT GTCTTCACATTATAGCAGAAGATTCACCCCAGAAATAGCCAAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAGGAAGGAAGAATCA ACTACTACTGGACTCTGCTGGAACCTGGGGATACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCGCCATGGTAT GCTTTTGCACTGAGTAGAGGCTTTGGATCAGGAATCATCACCTCAAATGCACCAATGGATGAATGTGATGCGAAGTG TCAAACACCTCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTTCCTTTCCAGAATGTACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGTCCAA AGTATGTCAGGAGTGCAAAATTAAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATCCCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTT GGAGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACTGGAATGGTAGATGGGTGGTATGGTTATCATCATCAGAATGA GCAAGGATCTGGCTATGCTGCAGATCAAAAAAGTACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAATTCTG TAATTGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGCAAAGAATTCAACAAATTGGAAAGAAGGATGGAAAACTTA AATAAAAAAGTTGATGATGGGTTTCTAGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTGGTTCTACTGGAAAATGAAAG GACTTTGGATTTCCATGACTTCAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAG AAATAGGAAACGGGTGTTTTGAATTCTATCACAAGTGTAACAATGAATGCATGGAGAGTGTGAAAAATGGAACTTAT GACTATCCAAAATATTCCGAAGAATCAAAGTTAAACAGGGAGAAAATTGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGAGT CTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCCCTGGTTCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCT GGATGTGTTCCAATGGGTCTTTGCAGTGTAGAATATGCATCTGAGACCAGAATTTCAGAAATATAAGAAAAAACACC CTTGTTTCTACT(SEQ ID NO. 8) 特别地，本发明包括包含下述序列的HA核苷酸序列5' -CCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCC-3 ‘ (SEQ ID NO. 9) 实施例实施例1 生成线性H3N2HA表达构建物使用寡核苷酸Pl和P2PCR扩增Vero细胞培养物衍生的甲型流感H3N2病毒的HA 区段(图Ia中的F1)。随后，通过交叠PCR将两种自pHW2000 (Hoffmann et al. 2000,Proc Natl Acad Sci U S Α. 97 :6108-13)衍生的 DNA 片段(图 1 中的 F2 禾Π F3)融合至 HA PCR 产物(见图lb)。第一种DNA片段(F2)包含CMV启动子和Poll终止子，第二种片段(F3) 包含人类Poll启动子和BGH polyA信号。为了便于生成交叠PCR产物，用于HA扩增的寡核苷酸在它们的5’端延伸，使得Pl含有与Poll终止子互补的序列，而P2含有与Poll启动子互补的序列(见图la)。类似地，用于生成片段Fl和F2的引物P3和P5在它们的5’ 端延伸以含有与HA的5，和3，端互补的序列(见图la)。片段F2和F3含有自pHW2000骨架中描述的序列衍生的保护序列。这些序列不直接涉及mRNA和vRNA的转录但降低外切核酸酶对双向表达盒的降解。使用Qiagen ViralAmp试剂盒自Vero细胞培养物衍生的甲型流感H3N2病毒提取病毒RNA并如先前所述使用Unil2寡核苷酸逆转录(HofTmarm et al. 2001, Arch Virol. 146 :2275-89)。使用Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物用表1所示寡核苷酸扩增HA区段表 1
Ply-CGPJ^GTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAAC-y (SEQ ID No. 1)P25，-GCCGCCGGGTTATX4 GTA GAAA CAA GGGTGTTTTTAATTAATGC-3 ‘ (SEQ ID No. 2)与H3序列对应的核苷酸显示为斜体、粗体字母，与Poll终止子(Pl)和Poll启动子(P》同源的核苷酸显示为标准大写字母。使用Qiaquick PCR 纯化试剂盒 ^jiagen)纯化 HA F4PCR 产物。使用 Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物分别用引物对P3+P4和P5+P6 (见表2和图la)自 PHW2000质粒DNA扩增PCR片段F2和F3。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化 PCR产物F2禾口 F3。表2
P35'-CCrGCJJrr(7CrCCCCCCCAACTTCGGAGGTC-3' (SEQ ID No. 3)P45'-GGGGTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC-3' (SEQ ID No. 4)P55'-CCJr^JrrCJ/4CrAATAACCCGGCGGCCCAAAATGC-3' (SEQ ID
权利要求
1.一种用于生成负链区段化RNA病毒的方法，包括下述步骤a)提供不含任何扩增和/或选择序列的线性表达构建物，该构建物包含插入RNA聚合酶II (polll)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，该构建物进一步包含插入poll启动子和poll终止信号之间的HA和/或NA基因区段，b)用所述线性表达构建物转染宿主细胞，c)用具有辅助病毒HA和/或NA蛋白的辅助病毒感染所述宿主细胞，d)培养所述宿主细胞以扩增病毒颗粒，e)选择如下的病毒颗粒(i)含有自所述线性表达构建物衍生的HA和/或NA蛋白，但( )不含辅助病毒HA和NA蛋白或其区段，其中所述选择是基于HA和/或NA蛋白的表型、基因型或抗原性特性，且任选f)其中辅助病毒HA和NA蛋白的缺失是通过分析核酸或氨基酸序列来确定的。
2.依照权利要求1的方法，其中用编码选自下组的蛋白质的线性构建物转染宿主细胞:PB1, PB2, PA, NS, M，禾口 NP。
3.依照权利要求1或2任一项的方法，其中通过用蛋白酶处理后代病毒颗粒将包含自辅助病毒衍生的HA蛋白的后代病毒颗粒与候选病毒颗粒分开，且其中所述蛋白酶不切割自辅助病毒衍生的HA蛋白但切割候选病毒颗粒的HA蛋白。
4.依照权利要求1至3任一项的方法，其中所述蛋白酶选自下组胰蛋白酶，弹性蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶。
5.依照权利要求1或2的方法，其中辅助病毒的HA蛋白经修饰可被蛋白酶切割，其中所述蛋白酶不是胰蛋白酶。
6.依照权利要求1或3的方法，其中通过提供低PH条件将包含辅助病毒起源的HA和 NA蛋白的后代病毒颗粒与候选病毒颗粒分开。
7.依照权利要求1至6任一项的方法，其中将包含辅助病毒起源的HA和/或NA蛋白的后代病毒颗粒与候选病毒颗粒分开，这是通过使后代病毒与结合所述HA和/或NA蛋白的抗体接触来进行的。
8.依照权利要求1至7任一项的方法，其中所述辅助病毒颗粒包含活性降低的NA蛋白或缺少功能性NA蛋白。
9.依照权利要求1至8任一项的方法，其中所述辅助病毒包含丙型流感病毒的HEF蛋白。
10.依照权利要求9的方法，其中所述辅助病毒的HEF蛋白经修饰可被蛋白酶切割，其中所述蛋白酶不是胰蛋白酶。
11.依照权利要求1至8任一项的方法，其中所述辅助病毒包含冠状病毒的HA蛋白。
12.依照权利要求1至11任一项的方法，其中所述病毒颗粒是流感病毒颗粒。
13.依照权利要求1至12任一项的方法，其中所述病毒颗粒是减毒流感病毒颗粒。
14.依照权利要求1至13任一项的方法，其中所述病毒在NSl基因内包含删除或修饰。
15.依照权利要求1至14任一项的方法，其中所述辅助病毒包含修饰或删除的NS基因且在干扰素胜任细胞中生长缺陷。
16.依照权利要求1至15任一项的方法，其中所述辅助病毒包含至少4个、优选至少5个、优选6个与待生成的病毒相同的区段。
17.一种HA多肽片段，其包含下述序列PSIQPIGLFGA(SEQ ID NO. 7)。
18.一种 HA 核苷酸序列片段，其包含序列 CCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCC(SEQ ID NO. 9)。
全文摘要
本发明提供了一种在辅助病毒存在下使用线性表达构建物生成负链区段化RNA病毒的方法。
文档编号C12N15/09GK102239250SQ200980148635
公开日2011年11月9日 申请日期2009年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者安德里杰·埃戈罗夫, 托马斯·马斯特, 马库斯·沃尔谢克 申请人:阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司