专利名称：预测强直性脊柱炎患者对于抗TNFα抗体的临床反应的血清标记物的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用血清生物标记物来预测诊断为强直性脊柱炎的患者对用抗TNF α 生物治疗剂治疗的反应的方法和过程。
背景技术：
有关用生物制剂治疗强直性脊柱炎(AS)的决策面临诸多挑战，这些生物制剂是目前可获得的或者正处于开发阶段，例如戈利木单抗(golimumab)或阿达木单抗 (adalimumab)(均为人抗TNF α抗体)、或英夫利昔单抗(infliximab)( 一种鼠-人嵌合抗 TNFa抗体)、或依那西普(enterac印t)( 一种TNFR构建体)。其中一个挑战是预测哪些受试者会对治疗有反应以及哪些受试者会在治疗后失去反应。生物标记物被定义为“可客观测量和评价的特征，其作为一种指示物，可指示正常的生物过程、致病过程或对治疗干预的药理反应”(Biomarker Working Group, 2001. Clin. Pharm. and Therap. 69 :89-95 (生物标记物工作组，2001年，《临床药理学与治疗学》，第69 卷，第89-95页))。最近，生物标记物还被定义为这样的蛋白质其表达的改变可与疾病或疾病发展的风险增加相关，或可预测对给定治疗的反应。通过向体外或体内系统中加入抗TNF α抗体来中和TNFa，可使炎性细胞因子和许多其他血清蛋白以及非蛋白组分的表达发生改变。向培养的滑膜成纤维细胞中加入抗TNFa 抗体减少了细胞因子 IL-1、IL-6、IL-8 禾口 GM-CSF 的表达(Feldmann & Maini (2001)Annu Rev Immunol 19 163-196 (Feldmann 和 Maini，2001 年，《免疫学年评》，第 19 卷，第 163-196 页))。类风湿性关节炎(RA)患者经英夫利昔单抗治疗后，降低了 TNFR1、TNFR2、IL-1R拮抗剂、IL-6、血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白和纤维蛋白原的血清水平(Charles 1999 J Immunol 163 :1521-1528 (Charles，1999年，《免疫学杂志》，第163卷，第1521-15 页))。其他研究表明，RA患者经英夫利昔单抗治疗后，降低了可溶性(s) ICAM-3和可溶性sP选择素的血清水平(Gonzalez-Gay, 2006 Clin Exp Rheumatol 24 :373-379 (Gonzalez-Gay, 2006 年，《临床与实验风湿病学》，第M卷，第373-379页))，并降低了细胞因子IL-18的水平(Pittoni， 2002 Ann Rheum Dis 61 :723-725 (Pittoni，2002 年，《风湿病年鉴》，第 61 卷，第 723-725 页)；van 0osterhout,2005 Ann Rheum Dis 64 :537-543 (van Oosterhout，2005 年，《风湿病年鉴》，第64卷，第537-543页))。在患有各种免疫介导的炎性疾病的患者体内观察到高水平的C-反应蛋白(CRP)。 这些观察结果表明，CRP可能具有用作抗TNi^a治疗标记物的潜在价值。文献(St Clair, 2004 Arthritis Rheum 50 :3432-3443 (St Clair，2004 年，《关节炎和风湿病》，第 50 卷，第3432-3443页))显示，英夫利昔单抗使早期RA患者体内的CRP恢复到正常水平。对于难治性银屑病关节炎(Feletar，2004 Ann Rheum Dis 63 156-161 (Feletar，2004 年，《风湿病年鉴》，第63卷，第156-161页))，用英夫利昔单抗治疗也使CRP恢复到正常水平。研究还表明，CRP水平与仅用甲氨蝶呤治疗的早期RA患者的关节损伤进程相关(Smolen，2006 Arthritis Rheum 54 :702-710 (Smolen, 2006 年，《关节炎和风湿病》，第 54 卷，第 702-710 页))。当英夫利昔单抗治疗配合甲氨蝶呤治疗时，CRP水平不再与关节损伤进程相关。在对患有RA的患者进行治疗的过程中，Charles (1999)和Strunk(2006 Rheumatol Int. 26 :252-256 (2006年，《国际风湿病学》，第洸卷，第252-256页))证实了英夫利昔单抗可降低炎症相关细胞因子例如IL-6的表达，以及血管生成相关细胞因子例如 VEGF(血管内皮生长因子)的表达。Ulfgren (2000 Arthritis Rheum 43:2391-2396(2000 年，《关节炎和风湿病》，第43卷，第2391-2396页))表明，英夫利昔单抗治疗在治疗两周内降低了滑膜中 TNT、IL-I α 和 IL-I β 的合成。Mastroianni (2005 Br J Dermatol 153 531-536(2005年，《英国皮肤病学杂志》，第153卷，第531-536页))表明，VEGF, FGF和 MMP-2的减少对用英夫利昔单抗治疗后银屑病的范围和严重程度具有显著的改善作用。 Visvanathan (Ann Rheum Dis 2008 ;67 ;511_517 ；(《风湿病年鉴》，2008 年，第 67 卷，第 511-517页))表明，英夫利昔单抗治疗减少了 AS患者血清中IL-6、VEGF和CRP的水平，并且这些减少与改善的疾病活动度有关系。用英夫利昔单抗治疗AS患者引起IL-6减少，其与改善的临床指标有关 (Visvanathan,2006 Arthritis Rheum 54 (Suppl) :S792 (Visvanathan，2006 年，《关节炎和风湿病》)，第讨卷(增刊)，第S792页))。在英夫利昔单抗治疗的患者中，治疗后IL-6和 CRP的早期减少与疾病活动评分的改善相关。治疗前血清标记物浓度也与对于抗TM^a治疗的反应相关。已发现难治性RA 患者中IL-2R的低基线血清水平与英夫利昔单抗的临床反应相关(Kuuliala 2006)。 Visvanathan (2007a)表明，用英夫利昔单抗与MTX联合治疗RA患者引起炎症相关标记物 (包括MMPD数量减少。该研究表明在基线处MMP-3的水平与治疗后一年的临床改善情况的指标显著相关。因此，虽然已证实很多炎症和全身性疾病的血清蛋白和非蛋白标记物在抗TNFa 治疗期间数量发生改变，但是到目前为止，还未发现一组独特的标记物和预测算法。
发明内容
本发明涉及使用多种生物标记物来预测患者对用抗TNF α治疗的反应，更具体地讲，确定患者是否会有反应。此外，本发明可用来确定患者是否对治疗有反应以及反应是否会持续。在一个方面，本发明包括采用对患者血清样本进行的多组分筛选来预测AS患者对用TNFa中和单克隆抗体治疗有反应以及无反应。在一个实施例中，在开始进行抗TNF α治疗前，从AS患者的数据集中识别出与实际临床反应评价相关的特定标记物组，用来预测AS患者在用抗TNF α疗法治疗前的临床反应。在一个具体的实施例中，标记物组为选自以下的两种或更多种标记物瘦素、TIMP-U CD40配体、6义5 、]\03-1、骨钙素、？4 、补体成分3、VEGF、胰岛素、铁蛋白和ICAM-I。在另一个实施例中，在开始进行抗TNFa治疗之前和之后，从AS患者的数据集中识别出与实际临床反应评价相关的特定标记物组，用来预测AS患者在用抗TNFa疗法治疗前的临床反应。在一个具体的实施例中，标记物组为选自以下的两种或更多种标记物 瘦素、TIMP-I、CD40配体、G-CSF, MCP-I、骨钙素、PAP、补体成分3、VEGF、胰岛素、铁蛋白和 ICAM-I。本发明还提供基于计算机的系统，用来预测AS患者对于抗TNFa治疗的反应，其中计算机使用来自患者数据集的值来与预测算法例如决策树比较，其中数据集包括一种或多种标记物的血清浓度，所述标记物选自瘦素、TIMP-I、⑶40配体、G-CSF, MCP-I、骨钙素、 PAP、补体成分3、VEGF、胰岛素、铁蛋白和ICAM-1。在一个实施例中，基于计算机的系统为经训练的神经网络，用来处理患者数据集并产生输出，其中数据集包括一种或多种血清标记物的浓度，所述血清标记物选自瘦素、TIMP-I、⑶40配体、G-CSF, MCP-I、骨钙素、PAP、胰岛素、补体成分3、VEGF和ICAM-I。本发明还提供能够处理和检测取自AS患者的样本或样品中血清标记物的装置， 其中血清标记物选自瘦素、TIMP-U⑶40配体、G-CSF, MCP-1、骨钙素、PAP、补体成分3、 VEGF、胰岛素、铁蛋白和ICAM-I。本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括能够处理和检测取自AS患者的样本或样品中血清标记物的装置，其中血清标记物选自瘦素、TIMP-I、⑶40配体、G-CSF, MCP-I、骨钙素、PAP、补体成分3、VEGF、胰岛素、铁蛋白和ICAM-I。
图1-6为以决策树的形式表示的AS反应预测模型，这些模型基于血清标记物的使用并且与用ASAS20或BASDAI评价的患者临床反应相关。无反应者或“否”节点意味着该模型将此节点中的所有受试者预测为无反应者，而“是”节点意味着该模型将此节点中的所有受试者预测为反应者。节点内示出此节点的实际无反应者数目/实际反应者数目。图1为由基线(0周)标记物数据建立的预测模型，这些标记物数据得自接受戈利木单抗的研究患者并经过多重方法分析，并且在第14周时用ASAS20来评价反应，其中反应者的初始分类器基于瘦素(截断值< 3. 804，对数尺度)并且反应者的二次分类器基于 ⑶40配体(截断值>=1.05，对数尺度)。图2为由基线(0周)标记物数据建立的预测模型，这些标记物数据得自接受戈利木单抗的研究患者并经过多重方法分析，并且在第14周时用BASDAI的变化来评价反应， 其中反应者的初始分类器标准为TIMP-K截断值>=7.033)并且反应者的二次分类器为 G-CSF(截断值< 3.953)；当TIMP-I低于截断值时，前列腺酸性磷酸酶为反应者的分类器 (截断值>=-1.观7，对数值)；当TIMP-I和PAP都低于其相应截断值时，MCP-I为反应者的分类器(<7. 417，对数尺度)。图3为由基线(0周)处的血清标记物值建立的AS反应预测模型，这些血清标记物值得自接受戈利木单抗的研究患者并通过多重方法和单个EIA定量，并且在第14周时用 ASAS20来评价反应，其中骨钙素为反应者的初始分类器(截断值>=3. 878，对数尺度)， 并且当骨钙素低于其相应截断值时，PAP用作反应者的分类器(截断值>=-1.359，对数尺度)。图4为由基线(0周)处的血清标记物值建立的AS反应预测模型，这些血清标记物值得自接受戈利木单抗的研究患者并通过多重方法和单个EIA定量，并且在第14周时用 BASDAI变化评价反应，其中骨钙素为反应者的初始分类器(截断值>=3. 977，对数尺度)， 并且当骨钙素低于截断值时，PAP为反应者的分类器(截断值>=-1.415)，并且当骨钙素和PAP都低于其相应截断值时，胰岛素用作反应者的分类器(截断值< 2. 711，对数尺度)。图5为由基线以及在开始进行抗TNF治疗后从基线(0周)至第4周的血清标记物值变化建立的AS反应预测模型，这些血清标记物值得自接受戈利木单抗的研究患者并通过多重方法定量，并且在第14周时用ASAS20来评价反应，其中基线瘦素为反应者的初始分类器(截断值< 3. 804，对数尺度)，并且当瘦素低于其截断值时，补体3从基线至第4周的变化用作反应者的分类器(截断值<-0. 224)，并且当瘦素和补体3都等于或高于其相应截断值时，基线VEGF用作反应者的分类器(截断值>=8. 724)。图6为由基线以及在开始进行抗TNF治疗后从基线(0周)至第4周的血清标记物值变化建立的AS反应预测模型，这些血清标记物值得自接受戈利木单抗的研究患者并通过多重方法定量，并且在第14周时用BASDAI变化评价反应，其中初次反应者标准为补体成分3从基线至第4周的变化(截断值< -0. 233，对数尺度)，并且当补体3的变化等于或高于截断值时，基线铁蛋白用作分类器(截断值>=7. 774，对数尺度)，并且当补体3的变化等于或高于截断值并且基线铁蛋白低于其相应截断值时，ICAM-I的变化用作反应者的分类器(截断值> =-0. 2204,对数尺度)。
具体实施例方式缩写
ASAS 强直性脊柱炎评价
BASDAI:Bath强直性脊柱炎疾病活动指数
BASMI:Bath强直性脊柱炎计量指数
BASFI:Bath强直性脊柱炎功能指数
CART分类和回归树模型
EIA酶免疫分析
ELISA酶联免疫分析G-CSF粒细胞集落刺激因子
MAP多分析物特征图
PAP前列腺酸性磷酸酶
SELDI表面增强激光解吸和电离
SA血清淀粉样蛋白P成分，这不是血清淀粉样蛋白P的常见缩写
TNFa/TNFa肿瘤坏死因子α
TNFR肿瘤坏死因子受体
IL白介素
IL-IRIL-I 受体 “生物标记物”被定义为‘ [a]可客观测量和评价的特征，其作为一种客观指示物， 可指示正常的生物过程、致病过程或对治疗干预的药理反应’，该定义由生物标记物定义工作组给出(Atkinson et al. 2001 Clin Pharm Therap 69(3) :89-95 (Atkinson 等人，2001 年，《临床药理学与治疗学》，第69卷第3期，第89-95页))。因此，解剖学或生理学过程也可如同蛋白质、基因表达(mRNA)、小分子、代谢物或矿物质水平那样作为生物标记物，例如活动范围，前提条件是该生物标记物与相关的生理、毒理、药理和临床结局之间存在经验证的联系。所谓标记物的“血清水平”是指通常在体外用一种或多种方法(例如免疫测定法) 对从样本(例如血液)制备的样品进行测定所得到的标记物的浓度。免疫测定法使用每个标记物的免疫特异性试剂(通常为抗体)，并且此测定可以多种形式(包括酶偶联反应，例如EIA、ELISA、RIA，或其他直接或间接探针)进行。也可以有对样品中标记物进行定量的其他方法，例如电化学检测、荧光探针相关检测。该测定也可以是“多重的”，其中多种标记物在单个样品分析时被检测和定量。观察研究通常将其结果报告为比值比(OR)或相对风险。两者均为暴露(例如抽烟、使用药物)与疾病或死亡之间关联大小的量度。相对风险1.0表示该暴露不会改变疾病的风险。相对风险1. 75表示患者暴露时发展该疾病的机会是原来的1. 75倍或罹患该疾病的风险高出75%。小于1的相对风险表示该暴露降低了风险。当相对风险不能具体计算时，比值比为病例对照研究中估计相对风险的一种方法。虽然当疾病较罕见时它是准确的， 但当疾病较普遍时却不能同样准确地进行估算。预测值有助于解释临床环境下测试的结果。过程的诊断价值通过其灵敏度、特异性、预测值和有效性来定义。任何测试方法会产生真阳性(TP)、假阴性(FN)、假阳性(FP) 和真阴性(TN)。测试的“灵敏度”为所有存在有疾病、或确有反应、或测试呈阳性的患者的百分比或者(TP/TP+FN)X100%。测试的“特异性”为所有无疾病、或无反应、或测试呈阴性的患者的百分比或者(TN/FP+TN)X100%o测试的“预测值”即“PV”是值(阳性或阴性) 为真值的次数的测量值(％ )，即所有呈真阳性的阳性测试的百分比为阳性预测值(PV+)或 (TP/TP+FP)X100%。“阴性预测值”(PV-)为测试呈阴性并且不会有反应的患者的百分比或(TN/FN+TN) X100%。测试的“准确性”或“有效性”为与测试的总数目相比测试给出正确答案的次数的百分比或(TP+TN/TP+TN+FP+FN)X100(%。“误差率”为预测患者会有反应却无反应以及预测患者无反应却有反应的情况所占百分比或(FP+FN/TP+TN+FP+FN) X 100%。 整体测试“特异性”是准确性的量度，与某个测试的灵敏度与特异性不随群体中疾病的整体可能性发生改变即预测值改变而改变的程度有关。随着医师对给定患者进行疾病存在与否或临床反应存在与否的临床评价，PV也发生改变。生物标记物“减少的水平”或“更低水平”是指相对于称为“截断值”的预定值而言数量更小和高于定量限(LOQ)的水平，其中“截断值”是患者抽样和治疗条件相关的算法和参数所特定的。生物标记物“更高的水平”或“高水平”是指相对于称为“截断值”的预定值而言数量更高的水平，其中“截断值”是患者抽样和治疗条件相关的算法和参数所特定的。如本文所用，术语“人TNF α，，(本文缩写为hTNF α、hTNFa或简写为TNF)意在指以17kD分泌形式和^kD膜相关形式存在的人细胞因子，其生物活性形式由非共价结合的 17kD分子的三聚体构成。术语“人TNF α ”意在包括重组人TNF α (rhTNF α )，其可通过标准重组表达方法制备或商购获得(R&D Systems，目录号210-TA，Minneapolis，Minn.)。所谓“抗1顺3”、“抗1顺(1 ”、抗TNFa或简写的“抗TNF”疗法或治疗是指向患者施用能否阻断、抑制、中和、预防受体结合或防止TNF α激活TNFR的生物分子(生物药剂)。此类生物药剂的例子为针对TNF α的中和Mab，包括但不限于那些以通用名为英夫利昔单抗和阿达木单抗销售的抗体，以及处于临床开发阶段的抗体例如戈利木单抗；也包括能够结合TNFa的非抗体构建体例如称为依那西普的TNFR-免疫球蛋白嵌合体。该术语涵盖本文描述的抗TNF α人抗体和抗体部分以及美国专利No. 6，090，382,6, 258，562,6, 509，015 和美国专利申请No. 09/801185和10/302356中描述的那些。在一个实施例中，用于本发明的TNF α抑制剂为抗TNFa抗体或其片段，包括英夫利昔单抗(Remicade ，Johnson and Johnson ；描述于美国专利No. 5，656，272中，其以引用方式并入本文中)、CDP571 (人源化单克隆抗TNFa IgG4抗体)、⑶P 870 (人源化单克隆抗TNF α抗体片段)、抗TNF dAb (Peptech)、CNTO 148 (戈利木单抗；以及Centocor，参见WO 02/12502)和阿达木单抗 (Humira Abbott Laboratories，人抗TNF mAb，在美国专利 No. 6，090, 382 中描述为 D2E7)。 其他可用于本发明的TNF抗体描述于美国专利No. 6，593，458,6, 498，237,6, 451，983和 6，448，380，各所述专利均以引用方式并入本文中。在另一个实施例中，TNFa抑制剂为 TNF融合蛋白，例如依那西普(Enbrel ，Amgen ；描述于WO 91/0；3553和WO 09/406476，所述专利以引用方式并入本文中)。在另一个实施例中，TNFa抑制剂为重组TNF结合蛋白 (r-TBP-I)(Serono)。所谓“样品”或“患者的样品”是指这样的样本，其为从疑似患有或表现出与TNFa 相关疾病有关的症状的患者中提取、制备、采集、或以其他方式获得的细胞、组织或其流体或部分。MM近期在技术(例如蛋白质组学)上的进展向病理学家提出了挑战，要求将用高通量方法产生的新信息与基于临床病理学相关性并通常涵盖组织病理学发现的当前诊断模型整合在一起。医疗信息学和生物信息学领域的并行发展为以合理方式解决这些问题提供了技术和数学方法，从而向从业者和病理学家或其他医学专家提供了多变量多学科诊断预后模型形式的新工具，进而有希望提供更加准确的、个性化的基于患者的信息。循证医学 (EBM)和医疗决策分析(MDA)属于这些相对新的学科，其用定量方法评价信息的价值并将所谓的最佳证据整合到多变量模型中以评价预后、对治疗的反应和选择能影响个别患者护理的实验室测试。本发明包括如下几个方面1.使用血清来识别与AS患者对于抗TNF (例如戈利木单抗)治疗有反应或无反应相关的生物标记物。2.在开始进行抗TNF治疗前，使用存在于诊断为AS患者的血清中的生物标记物来预测对于抗TNF α Mab (例如戈利木单抗)治疗有反应或无反应的能力。3.用以预测AS患者在抗TNF治疗后的结局的算法。a.在开始进行抗TNF治疗前，可使用存在于诊断为AS患者的血清中的生物标记物，在评价时间(0周)预测AS患者在第14周时对于抗TNF α的临床反应或无反应。b.可使用在开始进行治疗前(0周)和在开始进行治疗后第4周获得的生物标记物偏离基线值的变化，来预测AS患者在第14周时对于抗TNFa治疗的临床反应或无反应。c.可使用在开始进行治疗前(0周)获得的生物标记物偏离基线值的变化以及在开始进行治疗后第4周时生物标记物的变化，来预测AS患者在第14周时对于抗TNFa治疗的临床反应或无反应。4.含有使用本发明的标记物来预测AS患者对于抗TNFa治疗有反应或无反应的方法的装置、系统和试剂盒。为了判定可用于建立基于标记物浓度的预测算法的标记物，从用戈利木单抗治疗的患者获得血清。可在治疗的基线(0周)、第4周和第14周或其他中间的或更久的时间点获得血清。对血清样品中的许多生物标记物作了分析，并对基线浓度以及治疗后生物标记物浓度的变化作了测定。然后使用生物标记物表达的基线和变化来确定生物标记物表达是否与开始进行治疗后第14周或其他指定时间点的治疗结局相关，如通过ASAS20或其他临床反应指标进行评价。在一个实施例中，使用逐步分析方法来判定与AS患者对于抗TNF α 治疗的临床反应相关的标记物，并建立涉及那些标记物的血清浓度的、预测有反应或无反应的算法，其中初始相关性通过逻辑回归分析完成，其将每个患者在0周、第4周和第14 周的每个生物标记物的值与该患者在第14周和第M周的临床评价相关联，一旦标记物在多个临床终点与对治疗有反应显著相关的能力被确定，用如本文所述或本领域所知的CART 或其他合适的分析方法来建立基于所判定的标记物或标记物组的血清值的独特算法。除了本文所公开的其他标记物，数据集标记物可选自一个或多个临床指标，例如年龄、性别、血压、身高和体重、身体质量指数、CRP浓度、吸烟、心率、空腹胰岛素浓度、空腹葡萄糖浓度、糖尿病状态、使用其他药物以及特定的功能或行为评价，和/或放射性或其他基于图像的评价，其中数值被用于各个测量或产生总体的数值评分。临床变量通常会被评价，并且将所得的数据在算法中与上文描述的标记物结合。在被输入到分析过程之前，通常以三份或多重三份测量各标记物的值，从而收集每个数据集中的数据。可对数据进行操作，例如原始数据可使用标准曲线变换，并且用三份测量值的平均值来计算每个患者的平均值和标准偏差。这些值可在用于模型前进行变换， 例如对数变换、Box-Cox 变换(参见 Box and Cox (1964) J. Royal Stat. Soc, Series B, 26 211— ；246 (Box和Cox, 1964年，《皇家统计学会杂志，B辑》，第26卷，第211-246页)) 等。然后可将该数据输入到具有确定参数的分析过程中。这样获得的定量数据与蛋白质标记物相关，然后使用学习算法将其他数据集组件用于具有以前确定的参数的分析过程中，即按照本文所提供的实例(实例1-3)中所述的方法输入到预测模型中。分析过程的参数可以是本文所公开的那些或者使用本文所述的指导得出的那些。将学习算法例如线性判别分析、递归特征排除法、芯片预测分析、逻辑回归、 CART、FlexTree, LART、随机森林、MART或另一种机器学习算法用于合适的参考或训练数据来确定适用于AS反应或无反应分类的分析过程的参数。该分析过程可设定用来确定样品属于给定类别的概率的阈值。概率优选地为至少 50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或更高。在其他实施例中，该分析过程确定所得数据集和参考数据集之间的比较是否产生统计学上显著的差异。如果是这样，那么该数据集所源自的样品被归类为不属于参考数据集类。相反地，如果该比较与参考数据集没有统计学上显著的差异，那么该数据集所源自的样品被归类为属于参考数据集类。一般来讲，该分析过程在形式上为通过统计学分析方法例如线性算法、二次算法、 多项式算法、决策树算法、投票算法产生的模型。
/ i川练細馳石角紗紐寸禾采用合适的参考或训练数据集通过任何合适的学习算法来确定用于分类(即建立预测模型)的分析过程的参数。要使用的参考或训练数据集将取决于要测定的所需AS分类，例如反应者或无反应者。数据集可包括来自两个、三个、四个或更多个类别的数据。例如，为了使用监督学习算法来确定用于分析过程(用来预测对于抗TNFa治疗的反应)的参数，使用包含对照样品和疾病样品的数据集作为训练集。作为另外一种选择， 使用监督学习算法来建立用于AS疾病治疗的预测模型。统计分析以下为统计分析方法的类型的例子，这些方法可供本领域的技术人员使用，以帮助实施本发明所公开的方法。统计分析可被应用于两个任务中的一者或两者。首先，可使用这些和其他统计学方法来识别标记物和其他指标的优选子集，这些优选子集将形成优选数据集。此外，可使用这些和其他统计学方法来生成分析过程，其应用于数据集以得到结果。本文介绍的或以其他方式在本领域获得的统计学方法中的若干方法可同时完成这两个任务，并且产生适合用作分析过程的模型以实施本文所公开的方法。在一个具体实施例中，生物标记物和其对应的特征(例如表达水平或血清水平) 用于建立一种分析过程或多种分析过程以区分不同类别的患者，例如对于抗TNFa治疗的反应者和无反应者。一旦使用这些示例性数据分析算法或本领域已知的其他技术建立了分析过程，该分析过程可用于将测试受试者分类到两个或多个表型类别之一(例如预测对于抗TNF α治疗有反应的患者或不会有反应的患者)。这通过将分析过程应用于从测试受试者获得的标记物特征图来实现。因此，此类分析过程具有巨大的诊断指示价值。在一个方面，本发明所公开的方法用于针对得自训练群体的标记物特征图来评价得自测试受试者的标记物特征图。在一些实施例中，得自训练群体的受试者以及测试受试者的每种标记物特征图包括多种不同标记物各自的特征。在一些实施例中，此比较通过如下方式实现(i)使用得自训练群体的标记物特征图来建立分析过程以及(ii)将该分析过程应用于得自测试受试者的标记物特征图。如此，本文所公开的方法的一些实施例中应用的分析方法用来确定测试AS患者是否被预测为对于抗TNF α治疗有反应或不会有反应的因此，在一些实施例中，上述二元决策情形中的结果具有4个可能的结局(i)真反应者，其中分析过程表明受试者会是抗TNF α治疗的反应者而受试者实际上在一定时间段内对于抗TNFa治疗作出反应(真阳性，TP) ； (ii)假反应者，其中分析过程表明受试者会是抗TNFa治疗的反应者而受试者在一定时间段内未对于抗TNF α治疗作出反应(假阳性，FP) ； (iii)真无反应者，其中分析过程表明受试者不会是抗TNF α治疗的反应者而受试者在一定时间段内未对于抗TNF α治疗作出反应(真阴性，TN)；或(iv)假无反应者，其中分析过程表明患者不会是对于抗TNF α治疗的反应者而受试者实际上在一定时间段内对于抗TNF α治疗作出反应(假阴性，FN)。用于建立分析方法的相关数据分析算法包括但不限于判别分析，包括线性、逻辑以及更灵活的判别技术(参见例如 Gnanadesikan，1977，Methods for Statistical Data Analysis of Multivariate Observations, New York :Wiley 1977 (Gnanadesikan,1977年，《多元观测值的统计数据分析方法》，New York, Wiley, 1977)，所述文献据此全文以引用方式并入本文)；树形算法，例如分类和回归树(CART)及其变型(参见例如Breiman，1984， Classification and Regression Trees, Belmont, Calif. :ffadsworth International Group (Breiman, 1984 年，《分类禾口回归树》，Wadsworth International Group, Belmont, Calif.)，所述文献据此全文以引用方式并入本文)；广义相加模型(参见例如Tibshirani， 1990, Generalized Additive Models, London Chapman and Hall(Tibshirani, 1990 年， 《广义相加模型》，Chapman and Hall, London)，所述文献据此全文以引用方式并入本文)； 以及神经网络(参见例如 Neal，1996，Bayesian Learning for Neural Networks, New York =Springer-Verlag(Neal, 1996 年，《神经网络的贝叶斯学习》，Springer-Verlag, New York)；以及 Insua, 1998, Feedforward neural networks for nonparametric regression In :Practical Nonparametric and Semiparametric Bayesian Statistics, pp.181-194, New ^rk =Springeransua, 1998年，基于前馈神经网络的非参数回归，《实用非参数和半参数贝叶斯统计学》，第181-194页，SpringenNew ^rk)，所述文献据此全文以引用方式并入本文)。在一个具体的实施例中，本发明的数据分析算法包括分类和回归树(CART)、多重累计回归树(MART)、芯片预测分析(PAM)或随机森林分析。此类算法对得自生物材料(例如血样)的复杂谱图进行分类，以区分正常的受试者或具有表征特定疾病状态的生物标记物表达水平的受试者。在其他实施例中，本发明的数据分析算法包括ANOVA和非参数等同物、线性判别分析、逻辑回归分析、最近邻分类分析、神经网络、主成分分析、二次判别分析、 回归分类器、支持向量机。虽然此类算法可用来生成分析过程和/或增加分析方法应用的速度和效率以及避免研究者偏倚，然而本领域普通技术人员会体会到无需基于计算机的装置来实施使用本发明的预测模型的方法。CART分析的结果在本发明的一个方面，诊断为AS的患者体内的血清标记物的分析的关注点在于生物标记物基线值与对于抗TNFa治疗的反应之间的显著关系。在本发明的另一个方面，从基线(抗TNF α治疗之前)至治疗后第4周对诊断为AS的患者体内的血清标记物变化进行分析，该分析与稍后时间(14周)患者的临床反应或无反应相关。在本发明的具体实施例中，已发现瘦素的基线浓度可为初始分类器；以便通过 ASAS20评价来预测第14周时用戈利木单抗治疗的患者的结局。在替代实施例中，基线骨钙素可为初始分类器；以便通过ASAS20或BASDAI评价来预测第14周时用戈利木单抗治疗的患者的结局。医师可利用该信息来确定谁会受益于戈利木单抗治疗，以及同样重要的，来识别那些不能受益于此类治疗的患者。作为另外一种选择，BASDAI用作模型的临床结局组件。并且基线处的TIMP-1、基线处的骨钙素、或补体成分3的改变为用于分类的初始标记物。当TIMP-I值提高时，分类的初始标记物还包括G-CSF的改变，以及当TIMP-I值低于截断值并且MCP-I值低于截断值时用前列腺酸性磷酸酶预测第14周时的结局。基线生物标记物预测对于抗TNFa治疗的反应当构建预测算法的数据集仅包括基线生物标记物血清浓度值，并且该数据集与通过不止一种评价临床反应的方法(例如ASAS20和BASDAI)得出的、用抗TNF α治疗剂治疗的AS患者的临床反应相关时，标记物包括瘦素、TIMP-I、⑶40配体、G-CSF、MCP-I、骨钙素、 PAP和胰岛素。如本文所示，当对得自AS患者的血清中基线(0周，治疗前)处的生物标记物进行分析，并通过多重分析定量时，最佳CART模型包括瘦素作为初始分类器瘦素高于3. 8 (对数尺度)的受试者预测为无反应者；瘦素低于3. 8的受试者则基于CD40配体的二次预测进行分类(CD40配体高于1. 05预测为反应者，CD40配体低于1. 05预测为无反应者)(图1)。 模型灵敏度为86%，模型特异性为88%。当临床指标为BASDAI从基线至第14周的变化并且基线生物标记物数据通过多重分析定量时，不同生物标记物成为分类器TIMP-1、前列腺酸性磷酸酶、GCSF和MCP-I (图幻，但是BASDAI模型的总体准确度类似于ASAS20模型。当对得自AS患者的血清中基线(0周，治疗前)处的生物标记物进行分析，并通过多重分析和单个EIA两者定量时，最佳CART模型包括初始分类器骨钙素骨钙素高于 3. 878的受试者(对数尺度)预测为反应者；骨钙素低于3. 878的受试者则再基于前列腺酸性磷酸酶进行分类(图幻。模型的灵敏度为90%，模型的特异性为84%。因此，通过使用得自多重分析以及单个EIA分析的数据并将该结果与BASDAI或ASAS20相关联，从而得到两种模型，两者均包括骨钙素和前列腺酸性磷酸酶作为分类器。基于BASDAI的模型包括胰岛素作为另一分类器。该模型预测BASDAI临床反应的准确度为61/76(80% )(图4)。这些结果表明，医师可在治疗前测量生物标记物的基线水平，以识别哪些用戈利木单抗治疗的患者会对治疗有反应或无反应。生物标记物变化作为结局的早期预测器已发现在第4周时AS患者的生物标记物偏离基线血清水平的变化与临床反应相关，该相关性通过不止一种评价临床反应的方法(例如ASAS20和BASDAI)得出，生物标记物包括瘦素、VEGF、补体3、ICAM-I和铁蛋白。当对得自AS患者的血清中基线处和第4周时的生物标记物进行分析并仅通过多重方法定量时，生物标记物模型使用瘦素作为初始分类器瘦素高于3. 8 (对数尺度)的受试者预测为无反应者；瘦素低于3. 8的受试者则基于另外两个分类器i)补体3的变化，和 ii) VEGF来分类(图5)。模型灵敏度为92%，模型特异性为81%。当临床指标为BASDAI 从基线至第14周的变化时，总体准确度类似于ASAS20模型，补体成分3的变化为初始分类器，接着依次使用基线铁蛋白和ICAM-I变化进行两次子分类(图6)。本文所述的产生一种可用于预测AS患者对于抗TNF α治疗有反应或无反应的算法的具体实例表明，多种标记物与AS过程相关并且每种特定生物标记物在诊断或预测对治疗的反应的定量解释迄今尚未确立。申请人已证实算法可利用对基于具体限定标记物的患者数据的抽样产生。在使用本发明标记物的一种方法中，可使用计算机辅助装置来获取患者数据并进行必要的分析。在另一方面，计算机辅助装置或系统可使用本文提供的数据作为“训练数据集”以产生为应用预测分析而需要的分类器信息。用于进行分析的仪器、试剂和试剂盒用于预测诊断为AS患者对于抗TNF治疗的反应的血清标记物的测量，可以在临床或研究实验室或者医院或医院外地点的中央实验室使用本文所述的标准免疫化学和生物物理方法进行。标记物的定量可与例如其他标准测量如WBC计数、血小板和ESR同时进行。该分析可使用商购试剂盒或使用多重分析在单个患者样品上单独或分批进行。在本发明的一个方面，在一个或多个步骤中使用单个和成组试剂来确定患者样品中生物标记物或生物标记物组的相对量或绝对量。可用试剂来捕获生物标记物，例如对生物标记物具有免疫特异性的抗体，该抗体形成配体生物标记物对，可通过间接测定例如酶联免疫特异性分析来测定。可进行单个分析物EIA或多重分析。多重分析为这样的技术， 通过该技术可使用单个血清样品进行多个同时的基于EIA的分析。可用于在非常小的样品体积中定量大量生物标记物的平台是Rules Based Medicine (Austin, Texas) (Luminex Corporation所有)采用的xMAP, 技术，该技术将光学分类方案、生化检测、流式细胞仪和先进的数字信号处理硬件和软件整合在一起，实现了在单个反应容器中运行多达100路的基于微球的分析。在该技术中，多路复用通过为每个分析物特异的分析指定一个带有独特荧光标记的微球组来完成。多重分析在流式装置中分析，该装置在每个微球通过红色和绿色激光时对每个微球进行单独询问。作为另外一种选择，可使用方法和试剂来处理样品，以便检测以及使用直接的物理测量(例如质量、电荷或组合，例如通过SELDI测量)进行可能的定量。也已经开发了定量质谱多反应监测分析，例如NextGen Sciences (Ann Arbor,MI) 提供的那些。因此，根据本发明的一个方面，用来评价AS状态的生物标记物的检测需要使来自受试者的样品与基底(例如探针，其上带有捕获试剂)在允许生物标记物和试剂间结合的条件下接触，然后通过合适的方法检测结合到吸附剂的生物标记物。检测标记物的一个方法是气相离子谱，例如质谱。其他可用于此目的的检测模式包括光学方法、电化学方法(伏安法、电流分析法或电致化学发光技术)、原子力显微镜和射频方法，例如，多极共振谱。除了显微镜法(共焦和非共焦)外，示例性的光学方法还为测定荧光、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射比和双折射率或折射率的方法(例如表面等离子体共振、椭圆光度法、共振镜法、波导光栅耦合器法或干涉测量法)以及酶偶联比色法或荧光法。在将检测方法应用于处理过的样本或样品之前可能需要对来自患者的样本进行处理，例如但不限于浓缩、纯化标记物或将标记物与样本的其他组分分离。例如，在进行检测分析物浓度的方法之前，通常用抗凝剂处理血样并去除其中的细胞组分和血小板。作为另外一种选择，检测可通过连续处理系统来完成，该系统可以加入材料或试剂来完成这样的浓缩、分离或纯化步骤。在一个实施例中，处理系统包括使用捕获试剂。一种捕获试剂为“色谱吸附剂”，其为通常用于色谱法的材料。色谱吸附剂包括，例如离子交换材料、金属螯合剂、固定化金属螯合物、疏水作用吸附剂、亲水作用吸附剂、染料、简单的生物分子(例如核苷酸、氨基酸、单糖和脂肪酸)、混合模式吸附剂(例如疏水引力/静电斥力吸附剂)。 “生物特异性”捕获试剂是生物分子类型的捕获试剂，例如核苷酸、核酸分子、氨基酸、多肽、 多糖、脂质、类固醇或这些物质的缀合物(例如，糖蛋白、脂蛋白、糖脂)。在某些情况下，生物特异性吸附剂可以是大分子结构，例如多蛋白复合体、生物膜或病毒。示例性生物特异性吸附剂为抗体、受体蛋白和核酸。生物特异性吸附剂与色谱吸附剂相比通常具有对目标分析物更高的特异性。因此，根据本发明，生物标记物的检测和定量可通过使用特定的选择性条件(例如吸附剂或洗涤溶液)来增强。洗涤溶液是指这样的试剂(通常为溶液)，其用来影响或改变吸附剂表面对分析物的吸附性和/或从表面去除未结合的材料。洗涤溶液的洗脱特性取决于例如PH、离子强度、疏水性、离液序列度、洗涤剂强度和温度。在本发明的一个方面，样品以多重方式分析，意味着来自患者样品的标记物的处理基本上同时进行。在一个方面，用含有多种捕获试剂(代表独特的特异性)的基底接触样品。捕获试剂通常为免疫特异性的抗体或其片段。基底可为单个元件例如“生物芯片”， 该术语表示这样的固体基底，其具有大致平坦的表面，其上附着捕获试剂；或者捕获试剂分隔于多个基底之间，例如结合于单个球形基底(微珠)。通常，生物芯片的表面包括多个可寻址位点，每个位点上都结合有捕获试剂。生物芯片可适于与探针接口接合，因此在气相离子谱(优选地为质谱)中用作探针。作为另外一种选择，本发明的生物芯片可安装于另一个基底上来形成探针，其可插入到光谱仪中。就微珠而言，单个微珠可在暴露于待测样品后分隔或分类。根据本发明，多种生物芯片可用于生物标记物的捕获和检测，这些生物芯片可购自例如 Ciphergen Biosystems(Fremont, CA)、Perkin Elmer(Packard BioScience Company(Meriden CT) > Zyomyx (Hayward, CA)以及 Phylos (Lexington, MA)、GE Healthcare, Corp. (Sunnyvale, CA)的商业来源。这些生物芯片的示例为描述于美国专利 No. 6, 225, 047 (见上)和 No. 6, 329, 209 (Wagner 等人)和 WO 99/51773 (Kuimelis 和 Wagner)、WO 00/56934 (Englert等人)的那些生物芯片，特别是使用电化学和电致化学发光方法检测样品中分析物标记物的存在或含量的那些生物芯片，例如Wohlstadter等人的 W098/12539和美国专利No. 6066448教导的那些多特异性、多阵列的生物芯片。将具有生物特异性捕获和/或检测试剂的基底与样品(含有例如血清)接触一段足够的时间以允许存在的生物标记物与试剂结合。在本发明的一个实施例中，将不止一种类型的其上具有生物特异性捕获或检测试剂的基底与生物样品接触。孵育一段时间后，洗涤基底以去除未结合的材料。可使用任何合适的洗涤溶液，优选地使用水溶液。结合到基底上的生物标记物在解吸后直接通过使用气相离子谱仪(例如飞行时间质谱仪)进行检测。生物标记物通过离子源(例如激光)离子化，产生的离子通过离子光学组件收集，然后质量分析器分散并分析通过的离子。然后检测器将检测到的离子的信息转换成质荷比。生物标记物的检测通常会涉及到信号强度的检测。因此，生物标记物的数量和质量均可测定。此类方法可用于发现生物标记物以及在某些情况下用于生物标记物的定量。在另一个实施例中，本发明的方法是能够进行微型化液体样品处理的微流体装置和用于液相分析的分析装置，例如US5571410和USRE36350提出的那些，这些装置可用于检测和分析液相中小分子和/或大分子溶质，可任选地采用色谱分离方法、电泳分离方法、电色谱分离方法或它们的组合来进行。微流体装置或“微装置”可包括多个按一定方式布置的通道，以使得分析物流体可以被分离，并且使得生物标记物可被捕获并可任选地在装置内的可寻址位点被检测到(US5637469、US6046056和US6576478)。由生物标记物检测产生的数据可用可编程数字计算机进行分析。计算机程序对数据进行分析以指示检测到的标记物的数量和信号的强度。数据分析包括测定生物标记物的信号强度以及去除偏离预定统计分布的数据的步骤。例如，数据可相对于某个基准归一化。 计算机可将所得的数据转化成各种格式，以用于显示(如果需要)或用于进一步的分析。人工神经网络
在一些实施例中，使用神经网络。可针对所选定的标记物组来构造神经网络。神经网络为两步回归或分类模型。神经网络具有层状结构，其包括通过权重层与输出单元层连接的输入单元(和偏置)层。对于回归，输出单元层通常只包括一个输出单元。然而，神经网络可以无缝方式处理多个定量反应。在多层神经网络中，有输入单元(输入层)、隐单元(隐藏层)和输出单元(输出层)。此外，还有单个的偏置单元，其连接到除输入单元外的每个单元。神经网络描述于Duda et al. ,2001,Pattern Classification,Second Edition,John Wiley & amp ；Sons,Inc., New York (Duda 等人，2001 年，《模式分类》，第二版，John Wiley & SonsJnc.，New York)； 禾口 Hastie et al. ,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer-Verlag,New York (Hastie 等人，2001 年，《统计学习原理》，Springer-Verlag, New York)。使用神经网络的基本方法是从未训练的网络开始，向输入层提供一种训练模式， 例如训练数据集中来自患者的标记物特征图，并将信号通过网络，然后在输出层决定输出， 例如训练数据集中患者的预后。然后，将这些输出与目标值(例如训练数据集中患者的实际结局)比较；差异对应误差。该误差或准则函数为权重的某种标量函数，当网络输出与所需输出匹配时该误差被最小化。因此，调整权重以减少这种误差的量。对于回归，此误差可为误差平方和。对于分类，此误差可为平方误差或交叉熵(偏差)。参见例如Hastie et al. ,2001,The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York(Hastie 等人，2001年，《统计学习原理》，Springer-Verlag, New York)。三种常用的训练方案为随机、分批和在线。在随机训练中，从训练集中随机选择模式并且对各模式表示更新网络权重。经梯度下降法(例如随机反向传播)训练的多层非线性网络在用网络拓扑定义的模型中进行权重值的极大似然估计。在批训练中，所有模式在学习开始前提供给网络。通常，在批训练中，通过训练数据完成几次通过。在线训练中，各模式被提供给网络一次且仅为一次。在一些实施例中，考虑了权重的起始值。如果权重接近零，那么常用于神经网络隐藏层的S型函数的操作部分(参见Hastie et al.，2001，The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York (Hastie ·入，2001 $，《Miff ；^ HC 理》，Springer-Verlag，New York))大致呈线形，因此神经网络坍缩成近似线性的模型。在一些实施例中，权重的起始值选择为接近零的随机值。因此，模型开始时几乎呈线性，并随着权重的增加变为非线性。各个单元局限于各处，并在需要的地方引入非线性。使用精确零权重可导致零导数和完美的对称，并且算法不会变动。作为另外一种选择，从较大权重开始常常得到劣解。由于输入量的缩放决定了底层中权重的有效缩放，这可对最终解的质量有重大影响。因此，在一些实施例中，在开始时将所有表达式数值标准化成平均值为0并且标准偏差为1。这使得所有输入在规则化过程中被同等处理，并允许为随机起始权重选择有意义的范围。就标准化输入而言，通常选取范围为-0. 7至+0. 7的随机均勻权重。在使用具有隐藏层的网络时经常发生的问题是在网络中使用的隐单元的最优数。 网络的输入和输出数由待求解问题确定。对于本文公开的方法，给定神经网络的输入数可为所选标记物组中的标记物数。神经网络的输出数通常仅为一个是或否。然而，在一些实施例中，使用不止一个输出，以便网络可定义不止两个状态。用来分析数据的软件可包括将算法应用于信号分析的代码，以确定信号是否代表对应于根据本发明的生物标记物的信号峰值。该软件也可将与观察到的生物标记物信号有关的数据用于分类树或ANN分析，以确定是否存在指示患者疾病的诊断或状态的生物标记物或生物标记物组合的信号。因此，该过程可分成学习阶段和分类阶段。在学习阶段，学习算法应用于包括要进行分类的不同类别的成员的数据集，例如来自诊断为AS并且对于抗TNFa治疗有反应的患者的多个样品的数据以及来自结果为阴性的患者(即，对于抗TM^a治疗无反应的AS患者) 的多个样品的数据。用来分析数据的方法包括但不限于人工神经网络、支持向量机、遗传算法和自组织映射以及分类和回归树分析。这些方法描述于例如2001年5月3日提交的 W001/31579 (Barnhill 等人)；2002 年 1 月 24 日提交的 W002/06^9 (Hitt 等人)和 2002 年5月30日提交的W002/42733(PaUlse等人)。学习算法产生针对特定数据元素的分类算法，这些数据元素例如特定的标记物和特定的标记物浓度(通常结合在一起)，能够将未知的样品分类为两个类别中的一种，例如反应者或无反应者。分类算法最终用于预测测试。软件(不管是免费软件还是专有软件)可极为有效地分析数据模式并按任何预定的成功标准设计另外的模式。试剂盒在另一方面，本发明提供用于确定哪些AS患者对用抗TNFa试剂(例如戈利木单抗)治疗有反应或无反应的试剂盒，这些试剂盒用于检测根据本发明的血清标记物。试剂盒筛选血清标记物和标记物组合的存在，在AS患者中这些血清标记物和标记物组合含量存在差异。在一个方面，试剂盒包括用于采集样品的装置，例如造成皮肤“戳孔”的柳叶刀或穿刺工具。试剂盒也可任选地包括用来从戳孔采集血液的探针，例如毛细管。在一个实施例中，试剂盒包括具有一种或多种生物特异性捕获试剂的基片，这些生物特异性捕获试剂用来结合根据本发明的标记物。试剂盒可包括多于一种类型的生物特异性捕获试剂，每种试剂存在于相同或不同的基片上。在另一个实施例中，此种试剂盒可包括标签或单独插页形式的有关合适操作参数的说明书。例如，说明书可告知消费者如何采集样品或者如何清空或洗涤探针。在另一个实施例中，试剂盒可包括一个或多个含有生物标记物样品的容器，这些生物标记物样品用作校准的标准品。在使用本发明的算法来预测AS患者对于抗TNF治疗有反应的方法中，在抗TNF治疗前并在开始进行治疗后的特定时间段从患者体内采集血液或其他流体。可对血液进行处理以提取血清组分或者采用全血。血液或血清样品可被稀释成例如1 2、1 5、1 10、 1 20,1 50或1 100，或不稀释直接使用。在一种格式中，将血清或血液样品涂敷在预制的测试条或棒上，并在室温下温育特定时间，例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、1小时或更长的时间。在规定的分析时间后，样品和结果可直接从测试条上读出。例如，结果显示为不同色调的彩色或灰色带，表示一种或多种标记物的浓度范围。测试条试剂盒会提供说明，解释基于一种或多种标记物的相对浓度得出的结果。作为另外一种选择，可提供能够检测测试条上标记物检测系统的色彩饱和度的装置，所述装置可任选地提供基于标记物系列的合适诊断算法得出的测试解释的结果。使用本发明的方法本发明提供通过分析诊断为AS的患者体内检测到的生物标记物，来预测对用抗 TNFa制剂(例如戈利木单抗)治疗的反应性的方法。在本发明的方法中，先由富有经验的专家用主观和客观标准诊断患者患有AS。AS发病原因的现行调查着重识别起始因子、下游事件、炎症介质和过程的调节因子。据估计形成AS的风险大约90%是可遗传的。最强的遗传风险因子与HLA-B27分子相关。考虑到HLA-B27对风险的重要作用，已经提出了几种可能的机制。然而，尽管业界对此兴趣浓厚并且研究活跃，但还是没有就HLA-B27如何造成疾病易感性达成共识。环境因素的作用仍然令人困惑，同样难以理解的是，AS往往牵涉韧带和肌腱与骨的结合部(附着点) 或骶髂关节。AS主要的临床特征包括骶髂关节炎引起的炎性背痛、中轴骨骼中其他位点的炎症、外周关节炎、附着点炎和前葡萄膜炎。结构的变化主要是由于骨质增生而不是骨破坏造成的。韧带骨赘和关节强直是这种疾病最突出的特征。AS的特征症状为下背部疼痛、臀部疼痛、脊柱活动受限、髋关节疼痛、肩膀疼痛、外周关节炎和附着点炎。神经系统症状可伴随脊髓或脊神经压迫，由该疾病的几种并发症引起。椎体骨折可在具有强直脊柱的患者中发生，但很少或没有造成创伤。最普遍的骨折位点在C5-6间隙。临床上显著的寰枢椎半脱位可在高达21%的AS患者中发生并导致脊髓压迫。马尾综合征是长期AS的罕见并发症；其发病机制知之甚少并包括炎症、蛛网膜炎、机械拉伸、神经根压迫、脱髓鞘和局部缺血。临床评价方法根据临床特征和通过某种成像方法获得的骶髂关节炎证据的组合作出AS的诊断，该成像方法由1984年修正的纽约标准(van der Linden S, Valkenburg HA, Cats A Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis. A proposal for modification of the New York criteria. Arthritis Rheum 27 :361-368,1984(van der Linden S、Valkenburg HA、Cats A，“对强直性脊柱炎诊断标准的评价一纽约标准修正建议”，《关节炎和风湿病》，第27卷，第361-368页，1984年))定义。研究已表明，疾病的实验室标记物(例如红细胞沉降率(ESR)和C-反应蛋白O^RP)水平)对于评价疾病活动性或监测对治疗的反应没有帮助(Spooorenberg A et al. 1999 J Rheumatol 26: 980-4 (Spooorenberg A等人，1999年，《风湿病学杂志》，第洸卷，第980-984页))。临床标准为1)持续时间超过3个月的下背部疼痛和僵硬，其随着运动而改善但不能通过休息缓解；2)腰椎在矢状面和额状(冠状)面的活动受限；以及幻相对于根据年龄和性别矫正的正常值，胸部扩张受限。X线标准为双侧骶髂关节炎2级或更高，或者单侧 3级或更高。关节炎的X线分级评分由5级组成0级是正常的脊柱；1级表示疑似变形；2 级表示硬化并带有一些侵蚀；3级表示严重的侵蚀、关节间隙的假性扩张和不全强直；4级表示完全强直。当1个X线标准与至少1个临床标准相关时，存在确定的AS。如果有三个临床标准存在或者X线标准存在但没有病征或症状来满足临床标准时，考虑可能是AS。临床等级可用作部分数据集来产生对治疗有反应的预测算法。一旦AS的诊断确立了，医师通常纵向监测临床结局以便识别处于疾病恶化风险的患者。强直性脊柱炎评价研究组(ASAQ已经定义了很多用于管理疾病的核心参数。AS患者的疼痛通常限于背部，但是轴外位点为对具有外周疾病临床表现的患者进行缓解疼痛治疗的主要关注点。使用单个IOOmm的水平视觉模拟评分(VAS)来测量夜间和一般脊柱疼痛。在用抗TNF疗法治疗的AS患者中，ASAS已建立反应标准。这些标准中的几个在下文概述或可通过联系美国风湿病学家学会(American Society of Rhuematologists)获得。ASAS20反映了对用来产生“评分”的几个标准的改善程度达20% (Anderson JJ et al. 2001 Arthritis Rheum 44 1876-1886 (Anderson JJ 等人，2001 年，《关节炎和风湿病》，第44卷，第1876-1886页))。ASAS改善标准把对治疗的阳性反应定义成首先具有20% 的相对改善，其次在4个领域(炎症、功能、患者的痛觉和患者总体健康，在第四领域没有恶化)中的3个领域有10个单位的绝对改善。BASDAI (Bath强直性脊柱炎疾病活动指数)定义了 AS患者的炎症活动性。炎症可通过评价患者经历的不适和晨僵程度作出临床评价。BASDAI是自评指数，每个问题限定在100mm VAS (范围0-100，其中0=没有僵硬和100=非常严重的僵硬)。已显示评分对治疗引起的变化较敏感。BASMI (Bath强直性脊柱炎计量指数)是定量的、医师评价的、对AS患者经历的脊柱活动受限的量度。BASMI是经验证的指数，其由5个临床测量指标组成，包括颈椎旋转度、 耳屏至墙距离、脊柱侧屈度、腰椎屈曲度和踝间距，其反映了轴节段受累。研究表明，BASMI 表现出良好的观察者间信度；然而BASMI不能区分身体受限是由急性炎症造成还是由慢性疾病损伤造成。没有公布的纵向研究表明BASMI可在患者的寿命期有进展，但人们认为患者的BASMI评分会随着AS患者发展进程性疾病的时间逐步增加。BASMI与脊柱照片的相关性在某些情况下表明与放射损伤有显著的关联。BASFI (Bath强直性脊柱炎功能指数)使用身体机能测量指标来评价患者执行日常任务能力的受限程度。身体机能用BASFI和Dougados功能指数(DFI)测量。然而，BASFI 是在临床实践和临床试验中最为广泛地使用的测量指标。应当认识到本文所述的临床指标为患者数据集的一部分并且可指定一个数字评分。以往治疗的失效ASAS制订了关于需要对AS进行抗TNF治疗的共识声明(Braun et al 2003 Annals Rheumatic Diseases 62 :817-824 (Braun 等人，2003 年，《风湿病年鉴》，第 62 卷，第 817-8M页))。对于AS的所有三种表现，即中轴疾病、外周关节炎和附着点炎，治疗失效定义为进行至少3个月标准NSAID治疗的试验。在开始抗TNF治疗前，患者必须按照最大推荐或耐受的抗炎剂量接受使用至少两种NSAID的充分治疗试验，除非这些药物为禁忌的。所有如下三种表现要求中断NSAID治疗中轴疾病、外周关节炎和附着点炎对于中轴疾病症状，要求在开始进行抗TNF治疗前不进行其他治疗。对于外周关节炎症状，通常要求中断对寡关节炎进行关节内皮质类固醇治疗(至少两次注射)。除非是禁忌的或不能耐受的，否则应以多达3g/天的最大耐受剂量的柳氮磺吡啶进行4个月标准DMARD治疗。对于附着点炎症状，通常要求进行至少两次局部类固醇类注射的充分的治疗试验，只要这些注射不是禁忌的。TNFa治疗的适用性
抗TNFa制剂可商购获得，例如英夫利昔单抗，并已用来治疗AS很多年。抗TNF α 制剂已显示极大地改善了强直性脊柱炎，缓解了疾病的不同症状并改善了生活质量。可以根据除了临床评价外的其他标准以及任选地对替代疗法例如NSAID和物理疗法、柳氮磺胺吡啶或甲氨蝶呤或双膦酸盐的反应的失效，将AS患者视为抗TNFa治疗的候选者。患者管理在本发明预测或评价对于抗TNF治疗的早期反应性的方法中，在开始进行抗TNF 治疗前，从要用抗TNF疗法治疗的患者获取在“基线随访”、基线或“0周”的样品。样品可为任何这样组织，其可用来评价与本发明的方法相关的生物标记物。在一个实施例中，样品是选自血液、血清、尿液、精液和粪便的流体。在一个具体的实施例中，样品是得自患者血液的血清样品，患者血液通过直接静脉穿刺的标准方法或通过静脉内导管吸取。此外，在基线随访时，将有关患者的人口统计学数据和AS病史的信息记录在标准表格上或病例报告表上。诸如从患者诊断起算的时间、既往病史、合并用药、C-反应蛋白 (CRP)水平和疾病活动的评价(即BASDAI、BASMI)之类的数据将被记录。患者在基线随访时或M-48小时内接受首次剂量的抗TNF治疗。在基线随访时， 安排对患者进行第4周随访。在第4周随访时，即在初始施用抗TNFa治疗后大约观天，获取第二个患者样品， 优选地使用与基线样品相同的方案和途径进行。对患者进行检查并且可按照健康护理专家规定的方法或按照所示出的研究设计采集或监测其他指标、影像或信息。安排对患者进行后续的随访，例如第8周、第12周、第14周、第观周等进行随访，目的是使用如ASAS和 BASDAI所示出的此类标准进行疾病的评价以及获取患者样品用于生物标记物的评价。在治疗前、期间或随后的任何时间或上述时间，可对从患者获得的样品或其他流体或组织样品进行其他参数和标记物的评价。这些参数和标记物包括标准血液学参数， 例如血红蛋白含量、血细胞比容、红细胞容积、平均红细胞直径、红细胞沉降率(ESR)等等。其他标记物(已确定可用于评价AS的存在)可在一些或全部患者的样品中定量，例如 CRP (Spoorenberg A et al. 1999. J Rheumatol 26 :980-984 (Spoorenberg A等人，1999年， 《风湿病学杂志》，第26卷，第980-984页))和IL-6，以及软骨退变的标记物例如血清1型 N-端肽(NTX)、尿II型胶原C-端肽(尿型CTX-II)和血清基质金属蛋白酶3 (MMP3，基质溶素 1)(参见 US20070172897)。可用于评价对治疗的反应的另外炎症相关标记物可为炎性细胞因子，例如IL-8 或IL-I ；炎性趋化因子，例如ENA-78/CXCL5、RANTES, MIP-I β ；血管生成相关蛋白(EGF、 VEGF)；另外的蛋白酶，例如MMP-9、TIMP-I ；作用于细胞免疫系统(TH-I)的分子，例如 IFNy、IL-12p40、IP-10 ；以及作用于体液免疫系统(TH-2)的分子，包括IL-4和IL-13 ； 生长因子，例如碱性FGF ；—般的炎症标记物，包括绿过氧物酶；以及粘附相关分子，例如 ICAM-I。医疗专家对反应的临床判断不应被测试结果所否定。然而，测试可有助于作出中止继续用戈利木单抗治疗的决定。在预测模型(算法)具有90%的灵敏度以及60%的特异性的一个测试中，其中50%的患者显示临床反应并且50%未显示符合临床反应的评价分数或评价。这将意味着反应者中，45%会准确地识别为反应者(5%会报告为可能的无反应者)以及30%的无反应者会准确地识别为无反应者(20%会归类为可能的反应者)。因此，总体效果是60%的所有真无反应者可免于不必要的治疗或者在早期时间点(第4周) 中止治疗。5%假阴性的“反应者”(识别为可能的无反应者)会被治疗，以及对于所有患者而言，其反应在第14周或更后时间决定继续或中止治疗前会经临床判断。20%的假阴性 “无反应者”(识别为可能的反应者)必须进行临床判断，并且会用通常的时间来作出中止治疗的决定。实例1 样本采集和分析从参与多中心、随机、双盲、安慰剂对照的3组研究Centocor Protocol C0524T09 的患者获得血清样品并进行评价。这3个组由安慰剂组和戈利木单抗IOOmg或戈利木单抗 50mg这两种剂量水平的抗TNFa Mab处理组构成；每4周皮下注射患有活动期强直性脊柱炎的患者。在第14周和第M周作了初步功效评价。在基线(O周)、第4周和第14周从100 名患者采集了血清样品用于生物标记物研究。采用商购的检测分析法对血清进行生物标记物分析，这些检测分析法或者采用 Rules Based Medicine (Austin, TX)进行的多重分析或者采用单个分析物ELISA。所有样品被保存于-80°C直至测试。这些样品在室温下融化、涡旋并以13，OOOXg自旋5分钟来澄清，并且将150 μ L移入主微孔板用于抗原分析。使用自动移液，将每个样品的等分试样注入分析物的捕获微球多路通道之一中。将这些样品和捕获微球的混合物彻底混合并在室温下温育1个小时。对各路通道使用生物素化的记者抗体的多重混合物并使用链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白进行检测。用Luminex 100仪器进行分析，并且用由Rules-Based Medicine 开发并授权给Qiagen Instrument的专有数据分析软件解释所得的数据流。对于各路通道， 均采用校准物和对照物。首先确定各路通道的高、中和低对照物的测试结果，以确保适当的分析性能。使用包括于数据分析包中的4和5参数的、加权和非加权的曲线拟合算法，确定定位于某路具体通道中的每个分析物的未知值。在每个时间点，对总共92个蛋白生物标记物作了分析(表1)。表1.
权利要求
1.一种用于预测诊断为强直性脊柱炎的患者对于抗TNF α治疗的反应的方法，所述方法包括a)测定至少一种血清标记物的浓度，所述至少一种血清标记物选自瘦素、⑶40配体、 TIMP-1、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、G-CSF、MCP-1、补体成分3、VEGF、骨钙素、铁蛋白、和 ICAM-I ；以及b)将所述测定浓度与截断值进行比较，所述截断值通过分析一组诊断为AS的患者的所述标记物的血清浓度值而确定，所述患者接受了抗TNFa治疗并且根据一个或多个临床终点归类为反应者或无反应者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中附加的标记物浓度在血清中测定，所述附加的标记物选自所述患者的血液或血清样品中的触珠蛋白、血清淀粉样蛋白、CRP、α -1抗胰蛋白酶、冯威勒布兰特因子以及胰岛素。
3.一种用于预测诊断为强直性脊柱炎的患者对于抗TNF α治疗的反应的方法，所述方法包括a)测定瘦素和CD40配体在所述患者的血液或血清样品中的浓度；以及b)将瘦素在所述AS样品中的所述浓度与瘦素截断值进行比较，其中如果所述浓度测定为大于或等于所述截断值，则所述患者预测为抗TNF α治疗的无反应者，并且如果瘦素的所述血清值低于所述截断值，则c)将CD40配体在所述患者样品中的所述浓度与CD40配体截断值进行比较，其中高于或等于所述CD40配体截断值的CD40浓度是所述患者对TNF α治疗剂有反应的表征，并且低于所述CD40配体值的值和低于所述瘦素截断值的瘦素作为对TNF α中和治疗剂的无反应者的预测。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品为血清。
5.根据权利要求4所述的方法，其中瘦素在血清中的所述浓度是经对数变换的并且所述瘦素截断值为3. 804。
6.根据权利要求3所述的方法，其中CD40在血清中的浓度是经对数变换的并且所述 CD40截断值为1.05。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述测定步骤同时进行。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述测定步骤由计算机辅助装置执行。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述患者用非TNF中和治疗剂治疗。
10.一种用于预测诊断为强直性脊柱炎的患者对于抗TNF α治疗的反应的方法，所述方法包括a)测定骨钙素、前列腺酸性磷酸酶和胰岛素在所述患者的血液或血清样品中的所述浓度；以及b)将骨钙素在所述AS样品中的所述浓度与骨钙素截断值进行比较，其中如果所述浓度测定为大于或等于所述截断值，则所述患者预测为对于抗TNF α治疗的无反应者，并且如果骨钙素的所述血清值低于所述截断值，则c)将前列腺酸性磷酸酶在所述患者样品中的所述浓度与前列腺酸性磷酸酶截断值进行比较，其中前列腺酸性磷酸酶的浓度高于或等于所述前列腺酸性磷酸酶截断值时，所述患者预测为TNF α治疗剂的反应者，并且值低于所述前列腺酸性磷酸酶截断值时，则任选地，d)根据ASAS20评价的所述临床结局将所述患者归类到预测为无反应者，或通过将胰岛素在所述患者血清中的所述浓度与胰岛素截断值比较来进一步对所述患者分类，其中胰岛素值低于所述胰岛素截断值时，则将所述患者归类到预测为反应者，并且胰岛素值大于或等于截断值时，则将所述患者归类到预测为TNF α中和治疗剂的无反应者，如BASDAI所评价。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述样品为血清。
12.根据权利要求11所述的方法，其中骨钙素在血清中的所述浓度是经对数变换的并且所述骨钙素截断值为3.9。
13.根据权利要求10所述的方法，其中前列腺酸性磷酸酶在血清中的浓度是经对数变换的，并且所述前列腺酸性磷酸酶截断值为1.4。
14.根据权利要求10所述的方法，其中胰岛素在血清中的浓度是经对数变换的并且所述胰岛素截断值为2.711。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述测定步骤同时进行。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述测定步骤由计算机辅助装置执行。
17.一种用于预测诊断为强直性脊柱炎的患者对于抗TNF α治疗的反应的方法，所述方法包括a)测定骨钙素和前列腺酸性磷酸酶在所述患者的血液或血清样品中的所述浓度；以及b)将骨钙素在所述AS样品中的所述浓度与骨钙素截断值进行比较，其中如果所述浓度测定为大于或等于所述截断值，则所述患者预测为对于抗TNF α治疗的无反应者，并且如果骨钙素的所述血清值低于所述截断值，则c)将前列腺酸性磷酸酶在所述患者样品中的所述浓度与前列腺酸性磷酸酶截断值进行比较，其中前列腺酸性磷酸酶的浓度高于或等于所述前列腺酸性磷酸酶截断值时，所述患者预测为TNF α治疗剂的反应者，并且值低于所述前列腺酸性磷酸酶截断值时，则d)根据评价的临床结局将所述患者归类到预测为无反应者。
18.一种用于预测诊断为强直性脊柱炎的患者对于抗TNFa治疗的反应的方法，所述方法包括a)测定TIMP-I和前列腺酸性磷酸酶、GCSF和MCP-I在所述患者的血液或血清样品中的所述浓度；以及b)将TIMP-I在所述AS样品中的所述浓度与TIMP-I截断值进行比较，其中如果所述浓度测定为大于或等于所述TIMP-I截断值，则所述患者将被进一步分类，并且如果TIMP-I 的所述血清值低于所述截断值，则c)将前列腺酸性磷酸酶在所述患者样品中的所述浓度与前列腺酸性磷酸酶截断值进行比较，其中前列腺酸性磷酸酶的浓度低于所述前列腺酸性磷酸酶截断值时，所述患者预测为TNFa治疗剂的反应者，并且值大于或等于所述前列腺酸性磷酸酶截断值时，则要求对所述患者进一步分类，d)将MCP-I在所述患者血清中的所述浓度与MCP-I截断值进行比较，其中MCP-I值低于所述MCP-I截断值时，将所述患者归类到预测为反应者，并且MCP-I值大于或等于截断值时，则将所述患者归类到预测为TNF α中和治疗剂的无反应者，如BASDAI所评价。
19.根据权利要求18所述的方法，其中当所述患者的血清具有大于或等于所述TIMP-I 截断值的TIMP-I水平的时候，将G-CSF在所述患者血清中的所述水平与G-CSF截断值进行比较，其中如果所述患者血清中的所述G-CSF水平低于G-CSF截断值，则所述患者归类到预测为对于抗TNF治疗的反应者，如BASDAI所评价，并且如果所述G-CSF值大于或等于所述 G-CSF截断值，则所述患者归类到预测为对于抗TNF治疗的无反应者，如BASDAI所评价。
20.根据权利要求18和19所述的方法，其中所述TIMP-I截断值为7.03。
21.一种用于预测诊断为强直性脊柱炎的患者对于抗TNFa治疗的反应的方法，所述方法包括a)测定基线样品和第4周样品的补体成分3(C;3)浓度以及在基线的铁蛋白浓度的所述变化，以及基线和第4周ICAM-I在所述患者的血液或血清样品中标记物浓度的所述变化； 以及b)将开始进行抗TNF治疗前采集的所述AS患者血清样品中C3的所述浓度至在开始进行抗TNF治疗后第4周采集的所述AS患者血清样品中C3的所述浓度的所述变化与C3截断值进行比较，其中如果所述浓度变化确定为小于所述C3截断值，则所述患者归类到预测为对于抗TNF治疗的反应者，如果所述患者C3的血清浓度变化大于或等于所述C3截断值， 则使用所述患者样品中铁蛋白的所述基线值与铁蛋白截断值比较对患者进行分类，其中大于或等于所述截断值的值将使所述患者归类到预测为抗TNF α治疗的反应者，并且如果铁蛋白水平的所述血清值低于所述截断值，则c)将在开始进行抗TNF治疗前采集的所述AS患者血清样品中ICAM-I的所述浓度至在开始进行抗TNF治疗后第4周采集的所述AS患者血清样品中ICAM-I的所述浓度的所述变化与ICAM-I截断值进行比较，其中如果ICAM-I浓度的所述变化确定为大于或等于所述 ICAM-I截断值，则所述患者归类到预测为抗TNF治疗的反应者，并且如果ICAM-I浓度的所述变化确定为小于所述ICAM-I截断值，则所述患者归类到预测为无反应者。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述C3变化截断值为-0.233。
23.一种基于计算机的系统，所述系统将预测算法应用于一组数据，所述数据得自诊断为强直性脊柱炎的患者，所述患者用抗TNF α治疗剂治疗并且治疗后使用一种或多种临床终点评价，所述系统包括接收并处理计算机可读格式的患者数据集的计算站，所述计算站包括用于处理所述患者数据集的经训练的神经网络，并且产生输出分类，其中所述经训练的神经网络用预处理患者数据集的方法训练，所述方法包括a)选择与AS相关的患者生物标记物，b)以统计和/或计算方式测试所述选择的患者生物标记物单独在线性和/或非线性组合中的辨别能力，用于根据临床终点指示患者的反应或无反应，c)将统计学方法应用于推导向所述神经网络的二次输入，所述二次输入是所述原来或转换的生物标记物的线性或非线性组合，d)只选择那些表现出辨别能力的患者生物标记物或推导的二次输入；以及e)使用所述预处理患者生物标记物或推导的二次输入训练所述基于计算机的神经网
24.根据权利要求23所述的基于计算机的系统，其中所述输出分类为所述患者会对抗TNF α治疗有反应或无反应，并且所述临床终点为ASA20或BASDAI，并且所述生物标记物为患者性别、瘦素、CD40配体、TIMP-I、MCP-I、G-CSF、PAP、骨钙素、胰岛素、VEGF、铁蛋白、补体成分3、ICAM-I或所述生物标记物的任何组合。
25.一种装置，所述装置用于预测诊断为强直性脊柱炎并且用抗TNF α治疗剂治疗的患者是否对治疗有反应，所述反应通过所述一种或多种临床终点评价，所述装置包括a)测试条，所述测试条包含对标记物具有特异性的抗体，所述标记物与AS患者对于抗 TNFa治疗有反应或无反应相关，所述标记物选自瘦素、⑶40配体、TIMP-I、MCP-U G-CSF, PAP、骨钙素、胰岛素、VEGF、铁蛋白、补体成分3、或ICAM-I，并且所述测试条包含带有可检测标签的二抗；b)使用能够处理所述信号的读出器检测所述标签产生的所述信号；以及c)将所述数据处理成结果，所述数据得自所述信号的处理，所述结果为所述标记物在所述样品中的预定浓度的表征。
26.根据权利要求25所述的装置，其中所述读出器是人。
27.根据权利要求25所述的装置，其中所述读出器是反射计。
28.一种预后测试试剂盒，所述试剂盒用于预测诊断为强直性脊柱炎并且用抗TNFa 治疗剂治疗的患者是否对治疗有反应，所述反应通过所述一个或多个临床终点评价，所述试剂盒包括能够定量一种或多种标记物在患者样品中存在的预制备底物，所述标记物选自瘦素、CD40配体、TIMP-1、MCP-1、G-CSF、PAP、骨钙素、胰岛素、VEGF、铁蛋白、补体成分3、 ICAM-I或它们的任何组合。
全文摘要
本发明提供在开始进行抗TNFα制剂治疗前对诊断为强直性脊柱炎的患者进行管理的工具。所述工具为特定的标记物和算法，所述标记物和算法可通过使用血清标记物浓度基于标准临床主要和次要终点对治疗的反应进行预测。在一个实施例中，瘦素或骨钙素的基线水平用于预测开始进行治疗后第14周的反应。在另一个实施例中，使用治疗4周后血清蛋白生物标记物的变化，例如补体成分3。
文档编号C12Q1/68GK102272326SQ200980153744
公开日2011年12月7日 申请日期2009年12月9日 优先权日2008年12月30日
发明者C·沃纳, S·维斯瓦纳桑 申请人:森托科尔奥索生物科技公司