无细胞生产化学品的方法

专利名称：无细胞生产化学品的方法
技术领域：
本发明描述用于从碳源生产化学品的酶促法。根据一个方面，具体公开了通过无细胞的酶系统从碳源生产目标有机化合物的方法。
背景技术：
本发明涉及通过酶促法，优选在没有生产性活细胞的条件下，将碳源，优选为碳水化合物或另一种含碳化合物生物转化成目标有机化合物的方法。所述目标有机化合物优选为疏水性的、亲水性的或中间的化合物。根据本发明的疏水性化学物包括但不限于C4醇类，如正丁醇、2- 丁醇和异丁醇， 以及其它具有有限的水混溶性的化学品。有限的混溶性指在室温下不超过20% (w/w)可与水混合没有相分离。根据本发明的亲水性的和中间的化学品包括但不限于乙醇和其它化学
P
ΡΠ O正丁醇是无色、具有中等挥发性和在水中有限混溶性(室温下约7-8% )的中性液体。正丁醇在化学品生产中用作中间体，在配方产品如化妆品中用作溶剂和用作原料。正丁醇用于丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯、乙二醇醚、乙酸正丁酯、氨基树脂和正丁胺的合成。正丁醇因低蒸气压、高能量含量以及能与汽油高浓度混合，还可用作内燃机的燃料。2-丁醇是无色、具有中等挥发性和在水中有限混溶性(室温下约12% )的中性液体。2-丁醇用作油漆和涂料以及食品配料的溶剂或用于1-丁烯生产。异丁醇是无色、具有中等挥发性和在水中有限混溶性(室温下约9-10% )的中性液体。异丁醇用作溶剂或增塑剂。它还用于生产MTBE或ETBE生产用的前体异丁烯。正丁醇可用产溶剂性梭菌(solventogenic Clostridia)，如丙酮丁醇梭菌 (C. acetobuylicum)或拜氏梭菌(C. beijerinckii)生产，通常产出正丁醇、丙酮和乙醇的混合物。用产溶剂性梭菌生产丁醇有几个缺点(i)从稀水溶液中分离产物非常昂贵，因其要么复杂(如采用膜法)要么耗能(如采用蒸馏)。(ii)产量低，因为大部分的底物参与副产物如丙酮、乙醇、氢气和生物量的形成。(iii)因有限的细胞滴度，丁醇生产的产率低。 (iv)复杂的代谢限制了更高产率和产量的代谢工程。(ν)有限的方法稳定性常常导致生产损失且难以维持无菌。(vi)梭菌生长的两相性质限制了方法的灵活性和产率。有多种方法来克服传统的丁醇发酵生产的局限性。例如，W02008/052596描述了梭菌的重组改良以提高产量。例如，WO 2008/006038描述了筛选或设计较高的丁醇抗性的突变体。早在1897年，Eduard Buchner采用酵母细胞的裂解液将葡萄糖转化为乙醇时，已呈现无细胞生产化学品。之后Welch和kopes于1985年证实乙醇的无细胞生产，但该方法在技术上无用。该系统缺乏特异性(酶的副反应、裂解液中不需要的活性)，且最高获得 9%的乙醇。已描述了许多用分离的酶来生产化学品的技术方法。例如，将醇脱氢酶用于从酮生产手性醇。这些方法需要辅因子(NAD)再生，其可通过例如添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶实现。已设计这些方法来生产高价值的化学品，但不提供含有多个酶反应的酶系统，该酶反应以高能量和碳效率将碳水化合物转化为化学品。张等人于2008年描述了将葡萄糖无细胞转化为正丁醇的构想。该构思包括最少 18种酶，几种不同的辅因子和辅酶(如々1 、々0 、織0!1、織0、铁氧还蛋白和辅酶4)。此外， 该假定的方法引起ATP的净产生(net-production)从而另外需要三磷酸腺苷酶(ATPase) 除去ATP。在实际条件下控制三磷酸腺苷酶添加的同时维持平衡的ATP水平很难实现。总而言之，所述的方法昂贵、技术上不稳定且仅提供低丁醇产量。概言之，需要有成本效益的方法用于从可再生资源生产化学品，特别是乙醇和C4 醇类如正丁醇和它的异构体。根据一个方面，本发明通过无细胞的酶系统，仅用有限数量的酶和有限组的辅因子应对这个需求。具体地，根据一个优选方面，发明的方法不会引起ATP净产生，并/或不使用磷酸化酶反应，并/或仅使用耐受所生产的化学品的失活性存在的酶。疏水性化学品是仅部分溶于水且在大气压和温度下以固体或液体状态存在的化学品。疏水性化学品具有不高于20% (w/w)的有限的水混溶性，且无相分离。根据本发明的疏水性化学品的具体实例包括正丁醇、2-丁二醇和异丁醇。碳源可以是能为微生物生长或生产化学品所利用的任意物质。这些包括碳水化合物及其衍生物聚糖如纤维素、半纤维素、淀粉；二糖如蔗糖、麦芽糖、乳糖；己糖如葡萄糖、 甘露糖、半乳糖；戊糖如木糖、阿拉伯糖；糖醛酸、葡糖胺等；多元醇如山梨糖醇、甘油；脂类及其衍生物、木质素及其衍生物。特别优选的碳源为葡萄糖、含葡萄糖的低聚物或聚合物、 非葡萄糖的单体己糖、或聚合的糖衍生物、或其混合物。

发明内容
本发明涉及用于从碳源生物技术生产化学品的无细胞方法，该化学品具体为疏水性化学品如C4醇类，包括正丁醇、异丁醇或2- 丁醇，以及亲水性和中间的化学品如乙醇。根据一个优选的方面，本发明公开并要求保护通过无细胞的酶系统从碳源生产目标有机化合物的方法，其包括葡萄糖到作为中间产物的丙酮酸的转化，其中不发生ATP净产生。优选在葡萄糖到作为中间产物的丙酮酸的转化中没有ATP净产生发生。更优选在碳源到目标有机化合物的总体转化中没有ATP净产生发生。根据一个优选的方面，所述碳源化合物为葡萄糖、含葡萄糖的低聚物或聚合物、非葡萄糖的单体己糖或聚合的糖衍生物。根据又一个优选的方面，所述目标有机化合物为乙醇、四碳单醇，特别是正丁醇、 异丁醇、2-丁醇，或别的可从丙酮酸，优选通过酶催化途径衍生的有机化合物。根据本发明的一个优选的实施方式，葡萄糖到作为中间产物的丙酮酸的转化在完全没有ATP和/或ADP作为辅因子的条件下进行。更优选从碳源到目标有机化合物的总体转化(反应途径)在完全没有ATP和/或ADP作为辅因子的条件下进行。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，所述生产方法在包括两分离相的液态系统中进行，且所述目标有机化合物主要存在于或形成分离相之一，且所述目标有机化合物从分离相中收集。
根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，添加有机溶剂以建立两个分离的相。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，工艺中连续添加所述碳源化合物并不断移出目标有机化合物。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，所述酶系统包括以下的酶或酶活性，优选用于葡萄糖到丙酮酸的转化·葡萄糖脱氢酶(EC 1. 1. 1. 47)，·葡糖酸内酯酶(EC 3. 1. 1. 17)，·葡糖酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 39)，· 2-酮-3-脱氧葡糖酸醛缩酶(EC 4. 1. 2. 14)，·醛脱氢酶(EC 1.2. 1.3),·甘油酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 29)或羟基丙酮酸还原酶(EC 1. 1. 1. 81)，·丝氨酸-丙酮酸转氨酶(EC 2. 6. 1. 51)，· L-丝氨酸解氨酶(EC 4. 3. 1. 17)禾口·丙氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 1)。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，所述酶系统包括以下的酶或酶活性，优选用于葡萄糖到丙酮酸的转化·葡萄糖脱氢酶(EC 1. 1. 1. 47)，·葡糖酸内酯酶(EC 3. 1. 1. 17)，·葡糖酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 39)，· 2-酮-3-脱氧葡糖酸醛缩酶(EC 4. 1. 2. 14)，·醛脱氢酶(EC 1.2. 1. 3)和·甘油酸脱水酶(EC 4. 2. 1.)。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，通过含有11、10、9、 8、7或更少的酶的酶系统从葡萄糖生产乙醇。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，通过含有17、16、15 或更少的酶的酶系统从葡萄糖生产正丁醇。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，通过含有14、13或更少的酶的酶系统生产异丁醇。根据本发明的另一个优选的实施方式以及如文中进一步说明，通过含有13或更少的酶的酶系统生产2- 丁醇。根据一个优选的方面，发明的生产方法包括以下4步I.用微生物细胞生产用于将碳源转化为化学品(文中也称为“目标化学品”或“目标有机化合物”)的酶(“目标酶”)；II.从步骤I所用的微生物细胞释放目标酶，优选与辅因子的释放和另外的非目标酶活性的失活相结合；III.在适合将碳源转化为目标化学品的条件下使步骤II的目标酶与碳源接触。IV.从反应混合物中分离目标化学品。


图1进一步图示了根据一个优选实施方式的发明构思的可能实施。
具体实施例方式步骤I 步骤I中用微生物细胞生产目标酶。在本发明的一个实施方式中，酶生产在两个或更多的不同微生物细胞系中完成， 以使整个生产路线或它的主要部分不在一种微生物中重组。这样避免了不需要的底物向化学品转化的起始并导致更有效的酶生产。酶生产可以是细胞内或细胞外的，重组体或非重组体。如果酶生产是重组体，其可以是同源或异源的。在本发明的另一个实施方式中，目标酶对于某一底物和某一反应是选择性的。优选目标酶具有至少10倍于任意其它天然存在的物质的底物选择性(kcat/kM)和至少90% 的反应选择性。更优选目标酶具有至少20倍的底物选择性和至少95%的反应选择性。甚至更优选目标酶具有至少100倍的底物选择性和至少99%的反应选择性。在本发明的另一个实施方式中，目标酶表现出不受多步反应的底物或产物或其它中间体的抑制作用或抑制作用低(无或低反馈抑制)。优选多步反应的任意底物、产物或中间体的抑制常数(Ki)为至少10倍高于各酶和底物的Km值。更优选该抑制常数100倍高于各KM。在另一个特别优选的实施方式中，目标酶在多步反应的任意底物、中间体或产物的浓度为IOOmM或更高的条件下仍具有其最大活性的50%。优选目标酶具有适应于酶促路线的多步性质的K。at和Km值。根据本发明的方法的一个实施方式，所述目标酶耐受水平提高的目标化学品，并任选地耐受任选添加以促进目标化学品分离到分离相中的其它有机溶剂。优选所述目标酶耐受目标化学品的浓度高于2wt%，更优选高于6wt%，且最优选高于12wt%。在一个特别优选的实施方式中，所述目标酶耐受目标化学品的浓度高达其在水中的最大溶解度。在本发明的一个优选实施方式中，所述目标酶耐受水平提高的离液序列高的 (chaotropic)物质和增高的温度。目标酶优选耐受盐酸胍的浓度高于1M，更优选高于3M， 且最优选高于6M。可选择地或者结合地，所述目标酶优选耐受高于50°C的温度，更优选高于70°C，且最优选高于90°C。在这个优选实施方式中，目标酶生产在宿主生物体中完成， 所述宿主生物体的内源酶活性在提高水平的离液序列高的物质和/或增高的温度条件下大部分失活。目标酶生产优选使用以下微生物种类进行大肠杆菌(Escherichia coli)； 焚光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)乳酸克鲁维斯酵母(Klyuveromyces lactis)；里氏木霉 (Trichoderma reesei)；黑曲霉(Aspergillus niger)。更优选使用大肠杆菌作为宿主生物体进行目标酶生产。在本发明的另一个优选的实施方式中，所述目标酶耐受提高水平的氧。目标酶优选耐受氧气浓度高于lppm，更优选高于7ppm。最优选目标酶在需氧条件下有活性并且稳定。优选多步反应不需要氧且不受氧气抑制。从而不需要采取特殊预防措施排除氧气，以对生产环境和/或设备的更少精力使工艺更稳定。
优选将酶生产和细胞生长分成不同的阶段。由此，没有底物用于总代谢活动。步骤II:在步骤二中从细胞中释放出目标酶。在一个优选的实施方式中，目标酶耐受高温和离液序列高的条件，而来源于生产微生物的背景酶不耐受这些条件。根据此实施方式，目标酶在微生物细胞的胞内生产，用高温和/或离液序列高的条件裂解细胞，从而释放出活性状态的目标酶，任选地与辅因子一起，而不需要的背景酶活性则失活。在另一个优选的实施方式中，酶生产是胞外的，目标酶耐受高温和离液序列高的条件，且背景酶活性(非目标酶)不耐受这些条件。根据此实施方式，在例如高温和/或离液序列高的条件下处理来源于胞外生产的上清。此处理导致不需要的背景酶活性(非目标酶)失活而目标酶保持活性。在本发明的一个实施方式中，多个酶促转化步骤中的一个或多个需要辅因子。在本发明的一个方面，将这些辅因子添加到酶混合物中。在该实施方式的另一个特别优选的方面，微生物细胞在胞内也产生这些辅因子并经过与释放目标酶相同的处理而释放。在本发明的另一个优选的实施方式中，设计微生物细胞以优化生产的辅因子水平。优选微生物细胞在步骤II中失活。由此，工艺中将细胞生长和酶活性分开，且没有碳源被不需要的细胞生长消耗。步骤III:步骤III中碳源在多步酶促反应中被酶的混合物转化成目标化学品。根据本发明的方法，所述酶在目标化学品的变性作用下具有活性。优选步骤I所用的微生物细胞是失活的并/或在步骤III的反应条件下失活。优选在工艺条件下将目标酶混合物中各酶的浓度调整至最适水平。在一个特别优选的实施方式中，将一种或多种酶的浓度提高到通常的细胞内浓度以上，以提高该方法的产量(不为传统方法中微生物的最大密度所限)。在另一个特别优选的实施方式中，设计一种或多种酶以达最大催化效率(相比传统方法，导致更低的反应器规模和运行成本)。在另一个优选的实施方式中，在步骤III中将目标化学品加到反应混合物中至略高于能在工艺条件下与水混合成单一相的最大水平的浓度。根据此实施方式，工艺中将目标化学品不断分离到第二相中。在此实施方式的一个具体变型中，将水溶性物质加到反应混合物中，引起目标化学品在与没有该添加物质时的相分离浓度相比更低的相分离浓度下相分离。这些物质的实例为盐并为本领域的技术人员公知。在该实施方式的一个特别优选的变型中，加入氯化钠以降低目标化学品在水相中的溶解度。在另一个优选的实施方式中，向工艺中加入额外的有机溶剂形成其自身的相并从水相中提取出生产的疏水性化学品。此额外的溶剂的优选实例包括正己烷、环己烷、辛醇、 乙酸乙酯、甲基丁基酮或其组合。在另一个优选的实施方式中，由于通过采用对所需反应特异的目标酶，副产物的形成降低，产量提高。在另一个优选的实施方式中，可催化副反应的宿主酶在步骤II中失活并/或在步骤III的反应条件下失活。在本发明的又一优选的实施方式中，通过调节步骤III中对典型的微生物污染物有毒的反应条件避免工艺被微生物污染。这些条件包括升高的温度、极端PH、添加有机化学品。在本发明的特别优选的实施方式中，目标化学品自身在工艺中达到的浓度条件下是有毒的(更稳定的工艺，对生产环境和/或设备用更少的精力)。根据本发明的另一个优选的实施方式，除步骤I所用的微生物所生产的以及步骤 II所产生的细胞裂解物中所含的辅因子外，无额外的辅因子添加到反应混合物中。此辅因子的实例为NAD/NADH、NADP/NADPH、ATP/ADP。根据此实施方式，所需的辅因子为步骤I中的微生物细胞所生产，并在工艺中再生(NADH到NAD及反之；NADPH到NADP及反之；ADP到ATP 及反之)。在本发明的一个实施方式中，过量的还原当量(NADH、NADPH)或能量当量(ATP) 通过额外的酶再生(NADH氧化酶对NADH ；NADPH氧化酶对NADPH ；三磷酸腺苷酶对ATP)。在本发明的一个特别优选的实施方式中，在多步反应方法的至少大部分中，均不含有ATP和ADP作辅因子。多步反应途径的大部分优选包括至少20%的酶活性，并更优选至少50%的酶活性。最优选目标酶混合物(步骤I产生的酶混合物)中的酶活性均不含有磷酸化步骤(非磷酸化的反应途径)。在本发明的一个特别优选的实施方式中，反应途径包括从葡萄糖到丙酮酸的转化且此转化中包含的目标酶均不包括磷酸化步骤(无磷酸化的丙酮酸生产)。步骤IV 步骤IV中，从反应混合物中分离出一种或多种目标化学品。在本发明的一个优选实施方式中，一种或多种目标化学品是疏水性的并形成分离相，其优选包含所生产的化学品的至少大部分。在一个特别优选的实施方式中，一种或多种目标化学品连续不断地从反应混合物中移出。在本发明的另一个优选的实施方式中，向待转化成目标化学品的反应混合物中连续添加碳源。同样地，目标化学品优选以分离相连续不断地排出并通过本领域已知的方法进一步纯化。由此，由于产物在可进一步纯化的分离相中收集，产物分离简化。由此，产量提高且产物纯化简化。所述的无细胞酶促方法(张等人，2008 Jelch和kopes，1985)的主要问题是ATP 积累。在所述的方法中，通过添加三磷酸腺苷酶防止此问题。但难于找到合适的三磷酸腺苷酶浓度，因为其取决于底物和不同的中间体的浓度以及酶的活性。过多或过少的三磷酸腺苷酶均使该转化完全终止(Welch和义叩⑶，198 。相反，根据一个特别优选的方面，本发明的无细胞方法将碳源如葡萄糖及其聚合物转化为目标化学品例如乙醇、丁醇和/或异丁醇而无ATP净产生且不使用三磷酸腺苷酶。在另一个优选的实施方式中，本发明的方法不需要ADP或ATP作为辅因子。其它方法(Welch 和 kopes，1985 ；Algar 和 kopes，1985)需要辅因子如 ADP/ATP 和 NAD+/NADH。 假定的葡萄糖到丁醇的转化(张等人，2008)需要辅因子ADP/ATP、NAD+/NADH、铁氧还蛋白和辅酶A。本文所用的术语“酶”还包括术语“酶活性”并可互换使用。以下描述关于正丁醇、异丁醇、乙醇和2-丁二醇生产的一些优选实施方式。生产ιΗ丁醇在本发明的一个实施方式中，目标化学品是正丁醇且生产正丁醇的目标酶混合物包括少于19种不同的酶活性。优选目标酶混合物包括17种或更少的不同的酶活性，更优选16种或更少的酶活性，甚至更优选15种或更少的酶活性，且最优选仅12种不同的酶活性。因为酶生产是方法中的主要成本因素，其提供相对于其它方法的主要优势。在一个特别优选的实施方式中，从葡萄糖通过中间体丙酮酸和乙酰CoA生产正丁醇。从葡萄糖生产正丁醇可任意细分成三步(A)将一分子葡萄糖转化为两分子丙酮酸。 (B)将两分子丙酮酸转化为两分子乙酰CoA。(C)将两分子乙酰CoA转化为一分子正丁醇。步骤(A)葡萄糖至丙酮酸的转化。该步骤在大多数如果不是所有的微生物中普遍，尽管存在不同的代谢途径(如 Embden-Meyerhof-I^arnas 途径、Entner-DoudorofT-途径)。步骤(A)的一个具体变型利用 Embden-Meyerhof-Parnas途径的酶，包括表1所列出的10种酶活性(酶组合Α. 1)。由该酶组合催化的反应途径包括磷酸化酶且导致净ATP生产(每分子葡萄糖产出2分子ATP)。
权利要求
1.一种通过无细胞的酶系统从碳源生产目标有机化合物的方法，包括葡萄糖到作为中间产物的丙酮酸的转化，其中无ATP的净产生发生。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源化合物为葡萄糖、含葡萄糖的低聚物或聚合物、非葡萄糖单体己糖或聚合的糖衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目标有机化合物为乙醇，四碳单醇，具体为正丁醇、异丁醇、2-丁醇，或优选通过酶促途径可从丙酮酸获得的其它有机化合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中反应途径在完全没有ATP和/或ADP 作辅因子的条件下运转。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生产方法在包括两个分离相的液态系统中进行，且所述目标有机化合物主要存在于或形成所述分离相之一，且所述目标有机化合物从所述分离相中收集。
6.根据权利要求5所述的方法，其中添加有机溶剂以建立所述的两个分离相。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在所述方法中连续添加所述碳源化合物并不断移出所述目标有机化合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述酶系统包括以下酶，优选用于从葡萄糖到丙酮酸的转化 葡萄糖脱氢酶(EC 1. 1. 1. 47)、 葡糖酸内酯酶(EC 3. 1. 1. 17)、 葡糖酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 39)、 2-酮-3-脱氧葡糖酸醛缩酶(EC 4. 1. 2. 14)、 醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 3)、 甘油酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 29)或羟基丙酮酸还原酶(EC 1. 1. 1. 81)、 丝氨酸-丙酮酸转氨酶(EC 2. 6. 1. 51)、 L-丝氨酸解氨酶(EC 4. 3. 1. 17)和 丙氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 1)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述酶系统包括以下酶活性，优选用于从葡萄糖到丙酮酸的转化 葡萄糖脱氢酶(EC 1. 1. 1. 47)、 葡糖酸内酯酶(EC 3. 1. 1. 17)、 葡糖酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 39)、 2-酮-3-脱氧葡糖酸醛缩酶(EC 4. 1. 2. 14)、 醛脱氢酶(EC 1.2. 1. 3)和 甘油酸脱水酶(EC 4. 2. 1.)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中通过包括11、10、9、8、7种或更少的酶的酶系统从葡萄糖生产乙醇。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过包括17、16、15种或更少的酶的酶系统从葡萄糖生产正丁醇。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中通过包括14、13种或更少的酶的酶系统生产异丁醇。
13.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中通过包括13种或更少的酶的酶系统生产2-丁醇。
全文摘要
本发明描述用于从碳源生产化学品的酶促法。根据一个方面，具体公开了通过无细胞的酶系统从碳源生产目标有机化合物的方法。
文档编号C12P7/06GK102272314SQ200980153487
公开日2011年12月7日 申请日期2009年12月28日 优先权日2008年12月30日
发明者A·科尔特曼, U·克特林, V·西贝尔 申请人:南方化学公司