发酵生产含硫精细化学品的方法

专利名称：发酵生产含硫精细化学品的方法
技术领域：
本发明涉及发酵生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸的新方法，该方法利用其中表达编码S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)(E.C.2.5.1.6)突变体的核苷酸序列的细菌；涉及编码这些突变体的核苷酸序列，涉及用其转化的重组微生物，并且涉及具有修饰酶活性的新metK突变体。
背景技术：
在细胞中，通过天然代谢过程产生含硫精细化学品，例如甲硫氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、生物素、硫胺素和硫辛酸，这些含硫精细化学品被应用在多种工业领域中，包括食品、饲料、化妆品和制药工业中。统称为“含硫精细化学品”的这些物质包括有机酸、蛋白原(proteinogenic)和非蛋白原性氨基酸、维生素和辅因子。这些物质最方便地通过培养细菌工业化规模地生产，其中已经培育了用于生产和分泌大量所述期望物质的所述细菌。特别适于该目的的生物体是革兰氏阳性、非致病性棒杆菌。
已知可以通过发酵棒杆菌，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)株系生产氨基酸。由于高度的重要性，这些生产方法被不断改进。关于生产方法的改进可以涉及发酵技术方面，诸如，搅拌和氧供应，或营养培养基的组成，诸如，发酵期间的糖浓度，或者例如通过离子交换层析的下游处理，或者微生物本身的固有性能参数。
株系筛选产生了一系列突变体株系，所述突变体株系选择性地产生这一系列含硫精细化学品中的一组期望化合物。在特定分子生产方面，适用于改进这些微生物性能参数的方法是突变体的诱变、筛选和选择。然而，这种方法是费时并且困难的方法。以该方法，可以获得例如对抗代谢物诸如，甲硫氨酸类似物α-甲基甲硫氨酸、乙硫氨酸、正亮氨酸、N-乙酰正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-氨基-5-庚烯酸、硒甲硫氨酸、甲硫氨酸磺酰亚胺、methoxine或1-氨基环己烷甲酸具有抗性，或者在重要调节性代谢物方面是营养缺陷型，并且产生含硫精细化品诸如，L-甲硫氨酸的株系。
重组DNA技术方法也已经使用一些年用于对生产L氨基酸的棒状杆菌属(Corynebacterium)株系实施株系改进，其中扩增各氨基酸生物合成基因，并且研究对氨基酸产生的作用。
JP-A-06-020809公开了来源于黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MJ-233(一种棒杆菌细菌)基因编码S-腺苷甲硫氨酸的核苷酸序列。相应的氨基酸序列包含412个氨基酸。在大量其它棒杆菌相应酶中是保守的位置24和94中，该蛋白质均为半胱氨酸残基。公开的氨基酸序列在残基137和154之间有特征性序列片段。其中没有描述突变体的产生和它们在含硫精细化学品发酵生产中的用途。
WO-A-01/00843公开了来源于谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的metK基因，其编码具有407个氨基酸的蛋白质，并且有如SEQ ID NO16中所示的序列。
通常，精细化学品发酵生产的改进与改进的物质流动和产量相关。防止或减少对合成中重要的酶的中间体抑制或终产物抑制是重要的。防止或减少碳流朝向不期望的产物或副产物方向分流也同样是有利的。
可以研究代谢物对代谢酶的酶促活性的影响。这种酶的例子可以是微生物代谢中的metA、metB、metC、MetY、metH、metE、metF和其它酶。甲硫氨酸的一种重要代谢物是S-腺苷甲硫氨酸，其由此也是一重要的分流。
然而，S-腺苷甲硫氨酸同时也是甲硫氨酸生物合成的至关重要调节物。例如，已知S-腺苷甲硫氨酸抑制大肠杆菌(E.coli)中L-甲硫氨酸的生物合成。在这个系统中，S-腺苷甲硫氨酸做为阻遏物metJ的辅阻遏物(Weissbach，H.Brot.N.(1991)Mol Microbiol.5(7)，1593-1597)。
同时，S-腺苷甲硫氨酸的合成是对期望目的产物L-甲硫氨酸的一个重要分流。因此，因为下面几种原因，即a)增加形成的L-甲硫氨酸的量；b)减少对甲硫氨酸生物合成基因的抑制，和c)减少对甲硫氨酸生物合成酶的反馈抑制，所以可能期望减少S-腺苷甲硫氨酸的形成量。
metK基因缺失将是防止S-腺苷甲硫氨酸形成的最简单方法。然而，在Wei，Y和Newman，E.B.(2002)Mol Microbiol.43(6)，1651-1656中，metK基因被描述为必需基因，因此对本领域技术人员而言其看起来反而像改进含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸的发酵生产的起点。

发明内容
本发明的目的是提供改进的发酵生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸的新方法，和其所需要的手段。
意外地，已发现通过提供含硫精细化学品的如下发酵生产方法可以达到该目的，该方法包括在棒杆菌中表达metK核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有修饰的活性的S-腺苷甲硫氨酸合酶突变体，优选地与野生型酶比较突变体的活性降低。例如，S-腺苷甲硫氨酸合酶突变体可以来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，并且在谷氨酸棒状杆菌中的测定表明其活性小于野生型酶。
本发明第一主题涉及至少一种含硫精细化学品的发酵生产方法，该方法包括下面的步骤a)发酵产生期望的含硫精细化学品的棒杆菌细菌培养物，该棒杆菌表达至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有修饰的S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)活性的蛋白质；b)在培养基和/或细菌细胞中富集含硫精细化学品，和c)分离含硫精细化学品，优选地，该含硫精细化学品包含L-甲硫氨酸。
根据优选的实施方式，与未突变的野生型比较，该突变的棒杆菌还有改进的metY活性和/或增加的L-甲硫氨酸量(例如，用g/l发酵液表示)。
本发明方法中尤其可以使用的metK编码序列是编码具有降低的metK活性的蛋白质的编码核苷酸序列，其中置换了野生型蛋白质的至少一个半胱氨酸残基。
优选地，metK编码序列是编码具有metK活性的蛋白质的编码核苷酸序列，该蛋白质具有SEQ ID NO23中所示的下面氨基酸子序列G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V其中X1和X2相互独立地表示任何氨基酸；且X3表示除了Cys以外的氨基酸。
特别优选的是这样一种以上定义的方法，即，该方法中metK编码序列编码具有metK活性的蛋白质，该蛋白质包含如SEQ ID NO22中所示从Vall到Ala407的氨基酸序列或与此序列同源并且代表功能性等价蛋白质的氨基酸序列。
优选地，本发明所用的metK编码序列包含如SEQ ID NO21中所示的编码序列或与其同源并且编码具有metK活性的蛋白质的核苷酸序列。
metK编码序列优选地是能在棒杆菌中复制或稳定地整合到染色体中的DNA或RNA。
根据优选的实施方式，通过下面的步骤实施本发明的方法a)利用已经被质粒载体转化的细菌株系，其中该载体带有处于调节序列控制下的至少一个拷贝的metK编码序列，或b)利用metK编码序列已经整合到细菌染色体中的菌株。
特别优选的是上述株系，其中还例如通过野生型酶编码序列的缺失已经移除所有或一些metK野生型酶活性。
而且，可能期望发酵这样一种细菌，即该细菌中还增强了期望的含硫精细化学品生物合成途径的至少一种其它基因和/或至少部分地去除了减少期望的含硫精细化学品形成的至少一种代谢途径。
这就是为什么根据本发明方法的另一个实施方式，发酵同时超表达选自下面基因中至少一种基因的棒杆菌的原因1)基因lysC，其编码天冬氨酸激酶，2)基因asd，其编码天冬氨酸-半醛脱氢酶，3)基因gap，其编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶，4)基因pgk，其编码3-磷酸甘油酸激酶，5)基因pyc，其编码丙酮酸羧化酶，6)基因tpi，其编码磷酸丙糖异构酶，7)基因metA，其编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶，8)基因metB，其编码胱硫醚-γ合酶，9)基因metC，其编码胱硫醚-γ裂合酶，10)基因metH，其编码甲硫氨酸合酶，11)基因glyA，其编码丝氨酸羟甲基转移酶，12)基因metY，其编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，13)基因metF，其编码亚甲基四氢叶酸还原酶，14)基因serC，其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶，15)基因serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶，16)基因cysE，其编码丝氨酸乙酰基转移酶，17)基因cysK，其编码半胱氨酸合酶，18)基因hom，其编码高丝氨酸脱氢酶。
根据本发明方法的另一个实施方式，发酵其中同时突变了选自上述1)到18)的至少一种基因的棒杆菌，这种突变使得相应蛋白质的活性与未突变蛋白质比较受代谢物影响的程度较低，或者不受代谢物影响，并且优选地本发明精细化学品的生产不受到不利的影响，或者这种突变可以增加蛋白质的酶比活性。
根据本发明方法的另一个实施方式，发酵其中特别是通过降低相应基因的表达速率而同时减弱了至少一种选自下述的基因的棒杆菌
19)基因thrB，其编码高丝氨酸激酶；20)基因ilvA，其编码苏氨酸脱水酶；21)基因thrC，其编码苏氨酸合酶；22)基因ddh，其编码内消旋二氨基庚二酸D脱氢酶；23)基因pck，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶；24)基因pgi，其编码葡萄糖-6-磷酸-6异构酶；25)基因poxB，其编码丙酮酸氧化酶；26)基因dapA，其编码二氢吡啶二羧酸合酶；27)基因dapB，其编码二氢吡啶二羧酸还原酶，和28)基因lysA，其编码二氨基吡啶甲酸脱羧酶。
根据本发明方法的另一个实施方式，发酵其中同时突变了上述19)到28)中至少一种基因的棒杆菌，这种突变使得部分或全部降低了相应蛋白质的酶活性。
本发明方法中优选使用的微生物是谷氨酸棒状杆菌物种的微生物。
本发明也涉及从发酵液生产含L-甲硫氨酸的动物饲料添加剂的方法，该方法包括下面的步骤a)在发酵培养基中培养和发酵生产L-甲硫氨酸的微生物，优选地，所述微生物具有上述定义的降低的metK活性；b)从含L-甲硫氨酸的发酵液除去水；c)除去发酵期间形成的0到100％重量的生物量；和d)干燥从b)和/或c)获得的发酵液，以获得期望的粉末或颗粒形式的动物饲料添加剂。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码以上定义的具有降低的metK活性的多肽，并且涉及这些多核苷酸编码的具有降低活性的metK突变体。
而且，本发明涉及表达上述突变metK基因的重组棒杆菌，特别是不再表达metK野生型酶的重组棒杆菌。
与相应的野生型株系比较，优选的重组棒杆菌显示至少一种下面的性状
a)更低的细胞内S-腺苷甲硫氨酸效价；b)更低的细胞内S-腺苷甲硫氨酸合酶浓度，或c)根据S-腺苷甲硫氨酸形成速率测定的更低的S-腺苷甲硫氨酸合酶活性，另外，如果适当的话，还显示至少一种下面的性状d)改进的metY活性或e)增加的L-甲硫氨酸量。
发明内容a)一般术语术语具有“S-腺苷甲硫氨酸合酶”生物活性的蛋白质，也缩写为metK(E.C.2.5.1.6)，指能将L-甲硫氨酸和ATP转化为S-腺苷甲硫氨酸的蛋白质。本领域技术人员熟悉metK蛋白质的其它详细内容。通过酶测定法可以测定metK酶活性，可以在Markham，G.D.等(1983)Methods inEnzymology 94219-222中发现该测定法的方案。
在本发明范围内，术语“含硫精细化学品”包括含有至少一个共价结合的硫原子并可以通过本发明发酵方法获得的任何化学化合物。非限制性的例子是甲硫氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸，半胱氨酸，特别是甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸。
本发明范围内，术语“L-甲硫氨酸”，“甲硫氨酸”，“高半胱氨酸”和“S-腺苷甲硫氨酸”也包括相应的盐，例如盐酸甲硫氨酸或硫酸甲硫氨酸。
“多核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸(RNA)和多聚脱氧核糖核苷酸(DNA)，它们可以呈现未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA形式。
根据本发明，“多肽”应理解为意指包含通过肽键连接的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
术语“代谢物”指在生物体代谢中做为中间体或终产物出现的化学化合物，该化学化合物除了做为化学构件的特性外，其还可能发挥对酶和它们催化活性的调节作用。从文献中已知这种代谢物可以对酶活性具有抑制和刺激作用(Biochemistry，Stryer，Lubert，1995 W.H.Freeman &Company，New York，New York)。文献也描述了在生物体中，可以通过诸如利用UV辐射、电离辐射或诱变物质突变基因组DNA和随后筛选特定表型的方法来产生代谢物的影响作用被改变的酶(Sahm H.，EggelingL.，de Graaf A.A.Biological Chemistry 381(9-10)899-910，2000EikmannsBJ.，Eggeling L.，Sahm H.Antonie van Leeuwenhoek.64145-63，1993-94)。也可以通过靶向方法获得这些修饰的特性。在本发明上下文中，本领域技术人员也知道特异地修饰酶基因中编码蛋白质的DNA的特异性核苷酸，使得由表达的DNA序列产生的蛋白质具有特定的新特征。例如，这可以改变代谢物对未修饰的蛋白质的调节作用。而且，可以影响酶活性，以降低对底物的反应速率或改变底物亲和性。
在本发明上下文中，术语“表达”或“增强”或“超表达”描述了微生物中一种或多种由所述DNA编码的酶的细胞内活性的产生或增加。为此，可以，例如，将基因引入到生物体中，用另一种基因置换存在的基因，增加一种或多种基因的拷贝数，利用强启动子或利用编码具有高活性的所述酶的基因；如果合适，可以联合使用这些措施。
在本发明上下文中，术语“减弱”和“降低”描述了微生物体中由所述DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性的减弱或降低。为此，可以，例如缺失生物体中的基因，用另一种基因置换存在的基因，减少一种或多种基因的转录本拷贝数，利用弱启动子或利用编码具有低活性的相应酶的基因；如果适当，可以联合使用这些措施。
通过与诸如，来源于谷氨酸棒状杆菌野生型ATCC13032的天然S-腺苷甲硫氨酸合酶活性比较，可以测定本发明S-腺苷甲硫氨酸合酶突变体或其功能等价物的“降低的活性”。为此，适宜通过转化将在谷氨酸棒状杆菌中复制并带有S-腺苷甲硫氨酸合酶突变体基因的质粒引入到例如谷氨酸棒状杆菌野生型ATCC13032中。而且此外，将表达野生型酶S-腺苷甲硫氨酸合酶的适宜质粒引入到谷氨酸棒状杆菌野生型ATCC13032中。所获得的谷氨酸棒状杆菌转化体在适宜的培养基中培养并在相同OD600的对数生长期收获。此后，按照已知的方法，从2种转化体的收集细胞制备蛋白质提取物。然后利用Markham，G.D.等(1983)Methods in Enzymology94219-222的方法，在S-腺苷甲硫氨酸合酶试验中使用(蛋白质鉴定后)相同量的这些蛋白质提取物。在闪烁计数仪中测定形成的S-腺苷甲硫氨酸的放射性。考虑放射性L-甲硫氨酸的比活性和所使用的蛋白质量，可以从每单位时间掺入的放射性的增加测定S-腺苷甲硫氨酸形成的速率。它具有单位——μmol S-腺苷甲硫氨酸/min*mg蛋白质。可以比较野生型酶和突变酶之间的该速率。从具有S-腺苷甲硫氨酸合酶活性的其它野生型酶开始，通过相同的原理也可以产生本发明中有用的突变体。
根据本发明，“降低的活性”尤其指突变体的比活性降低到野生型活性的大约1到90％，优选地3到70％，诸如，5到10％的残余活性。
b)本发明的metK蛋白质本发明的多核苷酸序列编码上述具有修饰的，特别是降低的S-腺苷甲硫氨酸合酶活性的蛋白质。
优选地，通过置换革兰氏阳性和/或阴性细菌，或者特别是棒杆菌的metK氨基酸序列中的一个或多个保守性半胱氨酸残基来获得本发明中所用的突变体。利用序列比对可以容易地鉴定保守性半胱氨酸残基。细菌S-腺苷甲硫氨酸合酶中保守性Cys的非限制性例子是在多种细菌中发现的谷氨酸棒状杆菌酶的Cys24和Cys94。
在本发明优选的一组突变体中，用除了Cys以外的氨基酸，优选地丙氨酸置换(根据谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 metK的)Cys24和/或Cys94，由此以上述方式降低酶活性。
本发明范围中具体公开的多肽的“功能性等价物”或类似物是与这些具体公开的多肽不同，但是仍旧保留了期望的生物活性诸如，底物特异性的多肽。
根据本发明，“功能性等价物”可以理解为尤其意指在至少一个上述序列位置中具有不同于具体提到的氨基酸的另一个氨基酸，但同时仍保留至少一种上述生物学活性的突变体。因此，“功能性等价物”包括可以通过一个或多个氨基酸添加，置换，缺失和/或倒位获得的突变体，上述的序列修饰可以发生于任何序列位置，条件是它们产生具有本发明特征模式的突变体。特别地，当突变体和未修饰多肽之间反应性模式在质上一致时，即，例如当以不同速率转化相同的底物时，也存在功能性等价物。
自然地，“功能性等价物”也包括可以从其它生物体获得的多肽和天然出现的变异体。例如，通过序列可以鉴定同源序列区的范围，并且可以依据本发明的特定目的确定等价酶。
同样地，“功能性等价物”包括片段，优选地具有例如期望的生物学功能的本发明多肽的单独结构域或序列基序。
而且，“功能性等价物”也指融合蛋白质，该融合蛋白质具有通过功能性N-或C-末端连接的一个上述多肽序列或来源于其的功能性等价物和至少另一个功能性不同的异源序列(所谓功能性连接即，融合蛋白质的各部分彼此不对对方的功能造成显著不利影响)。这种异源序列的非限制性例子是例如信号肽、酶、免疫球蛋白、表面抗原、受体或受体配体。
本发明中还包括这样的“功能性等价物”，其是具体公开的蛋白质的同系物。这些同系物与一个具体公开的序列具有至少20％，30％，或例如40％，50％，优选地至少约60％，65％，70％或75％，特别是至少85％，诸如90％，95％或99％同源性，其中利用Pearson和Lipman的算法(Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448)计算该同源性。
特别优选的突变体和功能性类似物是含有上述定义的特征性子序列G(F/Y)(D/S)x1x2(S/T)x3(G/A)V的突变体和功能性类似物，其中x3是通过突变引入的除了Cys以外的氨基酸，特别是丙氨酸。x3对应于谷氨酸棒状杆菌metK野生型序列(SEQID NO16)的Cys94。优选地，x2表示Ala、Glu、Asp、Asn或Arg，并且优选地x1表示Gly、Cys、Ser或Ala。
通过诱变，例如通过点突变或蛋白质截短可以产生本发明蛋白质或多肽的同系物。本发明上下文中所用术语“同系物”指可以作为蛋白质活性的激动剂或拮抗剂的蛋白质变异体形式。
通过筛选突变体，例如截短突变体的组合文库可以鉴定本发明蛋白质的同系物。诸如，通过酶促连接合成的寡核苷酸的混合物，通过在核酸水平上的组合诱变可以产生蛋白质变异体的多样化文库。现有多种方法可以用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同系物文库。在DNA合成仪中可以化学合成简并基因序列，然后可以将合成的基因连接到适合的表达载体中。一套简并基因的使用使得可以在一个混合物中提供编码期望的一套潜在蛋白质序列的所有序列。简并寡核苷酸的合成方法是本领域技术人员已知的(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等，(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
蛋白质密码子片段文库也可以用于产生多样性蛋白质片段群以筛选和随后选择本发明蛋白质的同系物。在一个实施方式中，通过在每个分子大约仅发生一次切割的条件下，用核酸酶处理编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，复性DNA从而形成可以包含来自不同切割产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理，从新形成的双链体除去单链片段，并且将由此得到的片段文库连接到表达载体中，从而产生编码序列片段文库。该方法能够产生编码各种大小的本发明蛋白质的N-端，C-端和内部片段的表达文库。
大量的基因诱变技术是本领域已知的Coco，WM等2001，DNA改组方法用于产生高度重组的基因和进化酶，Nature Biotechnol.19354-359DE 19953854；Leung DW等，1989，利用改进的聚合酶链式反应随机诱变规定的DNA片段的方法，Technique 111-15；Stemmer WPC1994，通过随机片段化和重组装进行DNA改组用于分子进化的体外重组，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9110747-10751；和US 5811238。这些方法可以用于产生本发明中使用的突变体。
用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物和从cDNA文库筛选具有选定特征的基因产物的大量技术是本领域已知的。可以适应性修改这些技术以快速筛选通过本发明同系物的组合诱变产生的基因文库。最常使用的适于高流通量分析以筛选大基因文库的技术包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用由此获得的载体文库转化适合的细胞，和在一定条件下表达组合基因，其中在所述条件下期望活性的缺失简化了产物已获得检测的基因的编码载体的分离。增加文库中功能性突变体频率的递归总体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)技术可以与鉴定同系物的筛选测定法联合使用(Arkin和Yourvan(1992)PNAS897811-7815；Delgrave等，(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
c)本发明多核苷酸同样地，本发明涉及编码本发明metK酶的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列诸如，cDNA和mRNA)和其功能性等价物，尤其是，例如可以利用合成的核苷酸类似物获得的功能性等价物。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性片段的分离的核酸分子，涉及例如可以用做杂交探针或引物以鉴定或扩增本发明编码核酸的核酸片段。
而且，本发明的核酸分子可以包含基因编码区的3’-和/或5’-末端非翻译序列。
从核酸分子天然来源中存在的其它核酸分子中分离出的该核酸分子为“分离的”核酸分子，并且，如果通过重组技术制备该核酸分子，该核酸分子还可以不带有其它细胞物质或培养基，或者，如果化学合成该核酸分子，该核酸分子不带有化学前体或其它化学药品。
本发明还包括与具体描述的核苷酸序列或其片段互补的核酸分子。
利用本发明的核苷酸序列可以产生用于鉴定和/或克隆其它细胞类型和生物体中的同源序列的探针和引物。这种探针或引物通常包含在严格条件下与本发明核酸序列的有义链或相应反义链中至少大约12个，优选地至少大约25个，例如大约40，50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区。
本发明的其它核酸序列可以来源于SEQ ID NO21，并且通过单个或几个核苷酸的添加、置换、插入或缺失而与其不同，但仍继续编码具有期望特征模式的多肽。它们可以是与上述序列在至少大约50％，55％，60％，65％，70％，80％或90％，优选地至少大约95％，96％，97％，98％或99％的序列位置相同的多核苷酸。
本发明也包括包含所谓沉默突变的核酸序列，或根据具体的生物体来源或宿主生物体的密码子使用与具体提到的序列比较被修饰的核酸序列，本发明同样包括天然出现的变异体诸如，等位基因变异体。本发明的另一个主题是通过保守性核苷酸置换可以获得的序列(即，用相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸置换所述的氨基酸)。
本发明的另一个主题是由于序列多态性来源于具体公开的核酸的分子。这些遗传多态性可以因天然变异而存在于群体中的个体之间。这些天然变异通常在基因核苷酸序列中产生1到5％的差异。
本发明还包括与上述编码序列杂交或与其互补的核酸序列。当筛选基因组或cDNA文库时可以发现这些多核苷酸，并且如果适当，可以通过PCR方法用适合的引物从中扩增这些多核苷酸，并且随后例如利用适合的探针分离它们。另一种可能方案是用本发明多核苷酸或载体转化适合的微生物，扩增微生物并由此扩增多核苷酸，和随后分离这些多核苷酸。而且，也可以化学合成本发明的多核苷酸。
能与多核苷酸“杂交”的特征应理解为意指在严格条件下，多核苷酸或寡核苷酸结合实质上互补的序列的能力，而在这些条件下，非互补序列之间不会发生非特异性结合。为此，序列应该显示70-100％，优选地90-100％互补性。互补序列能相互特异性结合的特征可以用于例如Northern或Southern印迹技术中，或者用于PCR或RT-PCR中的引物杂交中。通常，利用30个碱基对长度的寡核苷酸。严格条件理解为意指例如，在Northern印迹技术中，在50-70℃，优选地60-65℃的温度，利用洗涤溶液，优选地具有0.1％SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)洗脱非特异性杂交的cDNA探针或寡核苷酸。如上所述，只有显示高度互补性的这些核酸分子才保持相互结合。严格条件的设定是本领域技术人员已知的，并且例如在Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述了严格条件的设定。
d)metK编码基因和其它基因的分离根据本质上已知的方法，可以分离编码酶S-腺苷甲硫氨酸合酶(EC2.5.1.6)的metK基因。
为了分离其它生物体的metK基因或其它基因，第一步是在大肠杆菌(E.coli)中建立这种生物体的基因文库。在通常已知的教科书和参考书中详细描述了基因文库的建立。可以提到的例子是Winnacker的教科书Geneand Klone，Eine Einführung in die Gentechnologie[基因和克隆，遗传工程入门](Verlag Chemie，Weinheim，Germany，1990)，或者Sambrook等的参考书Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。一个熟知的基因文库是大肠杆菌(E.coli)K-12株系W3110的文库，其由Kohara等(Cell 50，495-508(198))在λ载体中建立。
粘粒，诸如粘粒载体SuperCos I(WahI等，(1987)，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 842160-2164)，还有质粒诸如p BR322(Bolivar；Life Sciences，25，807-818(1979))或者pUC9(Vieira等，1982，Gene，19259-268)可以用于在大肠杆菌中建立基因文库。特别适合作为宿主的大肠杆菌株系是限制性缺陷和重组缺陷的大肠杆菌株系。一个例子是株系DH5αmcr，Grant等(Proceedings of the National Academy ofSciences USA，87(1990)4645-4649)已经描述了该株系。在粘粒帮助下克隆的长DNA片段又可以被亚克隆到适于测序的常规载体中，并随后如例如Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，745463-5467，1997)所述进行测序。
然后可以用已知的算法或序列分析程序诸如，Staden(Nucleic AcidsResearch(1986)14，217-232)程序，Marck(Nucleic Acids Research(1988)16，1829-1836)程序或者Butler的GCG程序(Methods of BiochemicalAnalysis(1998)39，74-97)，研究所获的DNA序列。
在特别是Boehringer Mannheim GmbH的参考书“The DIG SystemUsers Guide for Filter Hybridization”(Mannheim，Germany，1993)和Liebl等的参考书(International Journal of Systematic Bacteriology(1991)41255-260)中，本领域技术人员可以找到通过杂交方法鉴定DNA序列的方案。在特别是参考书GaitOligonucleotide synthesisA PracticalApproach(IRL Press，Oxford，UK，1984)中及在Newton和GrahamPRC(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)中，本领域技术人员可以找到利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA序列的方法。
此外，还已知蛋白质的N和/或C末端修饰不会显著影响蛋白质的功能；实际上，它们甚至能起到稳定作用。在特别是Ben-Bassat等(1987)Journal of Bacteriology 169751-757中，在O’Regan等，(1989)Gene77237-251中，在Sahin-Toth等(1994)Protein Sciences 3240-247中，在Hochuli等(1988)Biotechnology 61321-1325中和在已知的遗传和分子生物学教科书中，本领域技术人员可找到关于该主题的信息。
e)本发明所用的宿主细胞优选地，用于本发明方法的宿主细胞是棒杆菌细菌，其中通过至少一种下面的特征可以检测该棒杆菌降低的metK活性。
a)与野生型株系比较，降低的细胞内S-腺苷甲硫氨酸效价；b)降低的细胞内S-腺苷甲硫氨酸合酶浓度(基于总蛋白质的更少的S-腺苷甲硫氨酸合酶)，或c)降低的细胞内S-腺苷甲硫氨酸合酶活性(基于S-腺苷甲硫氨酸合酶蛋白质含量的更少的S-腺苷甲硫氨酸合酶酶活性)。
本领域技术人员用简单的方法，如果适当的话，结合考虑上述描述，可以测定所有这些特征。
特别地，本发明还涉及做为宿主细胞的微生物，特别是含有载体的棒杆菌(所述载体特别是具有至少一个本发明所定义的metK基因的穿梭载体或质粒载体)，或者是表达具有降低活性的本发明metK基因的棒杆菌。
这些微生物能从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇产生含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸。优选地，它们是棒杆菌，特别是棒状杆菌属(Corynebacterium)的棒杆菌。在棒状杆菌属中，必需特别提到物种谷氨酸棒状杆菌，在本专业领域中已知其能产生L-氨基酸。
必需提到的适合的棒杆菌株系实例是棒状杆菌属的棒杆菌，特别是物种谷氨酸棒状杆菌，诸如谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032，醋谷棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806，嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870，Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965，或者短杆菌属(Brevibacterium)的棒杆菌，诸如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和扩展短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020，或者同样产生期望的精细化学品或其前体的来源于上述菌株的株系，诸如谷氨酸棒状杆菌KFCC 10065，谷氨酸棒状杆菌ATCC 21608，(KFCC＝韩国培养物保藏中心联盟(korean Federation of CultureCollection)；ATCC＝美国典型培养物保藏中心)。
f)进行本发明的发酵根据本发明已发现棒杆菌表达本发明metK基因后可以以有利的方式产生含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸。
本领域技术人员可以单独或联合采用各种方法，以降低酶，例如S-腺苷甲硫氨酸合酶metK的活性或数量。通过降低编码本发明蛋白质的基因的转录频率可以降低所述蛋白质的浓度。本领域技术人员通过修饰或置换编码基因的启动子区、调节区或核糖体结合位点可以达到该目的。在编码区的下游，本领域技术人员可以修饰终止子或插入引起转录物稳定性降低的序列。这些减少mRNA寿命的方法可以减少相应蛋白质的表达和由此降低它们的浓度。
在表达的酶的水平，融合序列可能导致增加的分解速率，因此同样引起降低的蛋白质浓度。而且，本领域技术人员通过对编码基因进行定向或非定向诱变，可以修饰活性、底物亲和性和底物特异性。通过在相应基因中的突变使得酶反应的反应速率一定程度地或完全地降低，也可以影响酶活性。这种突变的例子是本领域技术人员已知的(Motoyama H.Yano H.Terasaki Y.Anazawa H.Applied & Enviromental Microbiology.673064-70，2001，Eikmanns BJ.Eggeling L.Sahm H.Antonie vanLeeuwenhoek.64145-63，1993-94)。蛋白质的突变体也可能导致酶复合物的降低或受阻的同源或异源多聚化，由此进一步削弱酶学特性。
用这种方法修饰的基因可以存在于质粒中或者优选地整合到染色体中。而未用这种方法修饰的原始基因仍旧可以存在，但是优选地用修饰的基因将其置换。
为了降低棒杆菌中所测量的酶，例如S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)的活性，表达编码功能性等价物的基因，诸如人工产生的突变体或来源于其它生物体的天然同系物，可能就足够。原始基因也可以存在，但是优选地用修饰的或同源的基因将其置换。
当通过发酵方法在棒杆菌中生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸时，还可能有利的是，不仅表达本发明的metK基因，而且增强参与所述生物合成途径，半胱氨酸代谢途径，天冬氨酸半醛合成，糖酵解，糖回补，磷酸戊糖代谢，柠檬酸循环或氨基酸输出的一种或多种酶。
因此，可以增强一种或多种下面的基因用于生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸-基因lysC，其编码天冬氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.281)，-基因asd，其编码天冬氨酸半醛(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.282)，-基因gap，其编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因pgk，其编码3-磷酸甘油酸激酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因pyc，其编码丙酮酸羧化酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因tpi，其编码磷酸丙糖异构酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因metA，其编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.725)，-基因metB，其编码胱硫醚-γ合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3491)，-基因metC，其编码胱硫醚-γ裂合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3061)，-基因mett，其编码甲硫氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1663)，-基因glyA，其编码丝氨酸羟甲基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.1110)，-基因metY，其编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.726)，-基因metF，其编码亚甲基四氢叶酸还原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2379)，-基因serC，其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.928)，-基因serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.334，DNA-SEQ NO.467，DNA-SEQ NO.2767)，-基因cysE，其编码丝氨酸乙酰基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.2818)，-基因cysK，其编码半胱氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2817)，-基因hom，其编码高丝氨酸脱氢酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1306)。
因此，为了在棒杆菌中生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸，同时突变至少一种下面的基因使得相应的蛋白质与未突变蛋白质比较很少受与它们活性相关的代谢物的影响，或者根本不受影响，或者使得相应蛋白质的比活性增强，这将可能是有利的-基因lysC，其编码天冬氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.281)，-基因pyc，其编码丙酮酸羧化酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因metA，其编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.725)，-基因metB，其编码胱硫醚-γ合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3491)，-基因metC，其编码胱硫醚-γ裂合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3061)，-基因metH，其编码甲硫氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1663)，-基因glyA，其编码丝氨酸羟甲基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.1110)，-基因metY，其编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.726)，-基因metF，其编码亚甲基四氢叶酸还原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2379)，-基因serC，其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.928)，-基因serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.334，DNA-SEQ NO.467，DNA-SEQ NO.2767)，-基因cysE，其编码丝氨酸乙酰基转移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.2818)，-基因cysK，其编码半胱氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2817)，-基因hom，其编码高丝氨酸脱氢酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1306)。
此外，为了生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸，还可能有利的是，除表达本发明的一种metK基因外还减弱一种或多种下面的基因，特别是降低或关闭它们的表达-基因thrB，其编码高丝氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3453)，-基因ilvA，其编码苏氨酸脱水酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2328)，-基因thrC，其编码苏氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3486)，-基因ddh，其编码内消旋二氨基庚二酸D脱氢酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3494)，-基因pck，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3157)，-基因pgi，其编码葡萄糖-6-磷酸-6异构酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.950)，
-基因poxB，其编码丙酮酸氧化酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2873)，-基因dapA，其编码二氢吡啶二羧酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3476)，-基因dapB，其编码二氢吡啶二羧酸还原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3477)，-基因lysA，其编码二氨基吡啶甲酸脱羧酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3451)。
而且，为了生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸，在棒杆菌中除了表达一种本发明的metK基因，同时还突变至少一种下面的基因使得相应蛋白质的酶活性降低到一定程度或完全降低，这可能也是有利的-基因thrB，其编码高丝氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3453)，-基因ilvA，其编码苏氨酸脱水酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2328)，-基因thrC，其编码苏氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3486)，-基因ddh，其编码内消旋二氨基庚二酸D脱氢酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3494)，-基因pck，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3157)，-基因pgi，其编码葡萄糖-6-磷酸-6异构酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.950)，-基因poxB，其编码丙酮酸氧化酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2873)，-基因dapA，其编码二氢吡啶二羧酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3476)，-基因dapB，其编码二氢吡啶二羧酸还原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3477)，-基因lysA，其编码二氨基吡啶甲酸脱羧酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3451)。
此外，为了生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸，也可能有利的是，除了表达本发明metK基因以外还消除不期望的次级反应(Nakayama“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，inOverproductionof Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，Academic Press，London，UK，1982)。
本领域技术人员可以单独或联合采用各种方法以获得超表达。因此，可以增加所述基因的拷贝数，或者可以突变位于结构基因上游的启动子区和调节区或核糖体结合位点。引入到结构基因上游的表达盒可以以相同的方式起作用。此外，诱导型启动子可以增加发酵生产L-甲硫氨酸期间的表达。通过延长mRNA寿命的方法也可以提高表达。
而且，通过防止酶蛋白质的降解也可以增加酶活性。基因或基因构建体可以以不同拷贝数存在于质粒中，或者可以在染色体中整合和扩增。做为可替代的方案，通过修饰培养基组成和发酵方法也可以获得相关基因的超表达。
有关这方面的信息，本领域技术人员可以在特别是Martin等，(Biotechnology 5，137-146(1987))中，Guerrero等，(Gene 138，35-41(1994))中，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1998))中，Eikmanns等，(Gene 102，93-98(1991))中，EP 0472869中，US 4,601,893中，Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991))中，Remscheid等，(Applied andEnviromental Microbiology 60，126-132(1994))中，LaBarre等，(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))中，WO 96/15246中，Malumbres等(Gene134，15-24(1993))中，JP-A-10-229891中，Jensen和Hammer(Biotechnologyand Bioengineering 58，191-195(1998))中，Makrides(MicrobiologicalReviews 60512-538(1996)中和已知的遗传和分子生物学教科书中找到。
因此，本发明也涉及包含处于调节核酸序列遗传控制下编码本发明多肽的核酸序列的表达构建体，并且涉及包含至少一种这样的表达构建体的载体。优选地，本发明的这种构建体包含目的编码序列5’上游的启动子和3’下游的终止序列，和如果适当，其它常规调节元件，在每种情况下，它们都可操作地连接编码序列。“可操作地连接”理解为意指启动子、编码序列、终止子和如果适当，其它调节元件的顺序排列，此排列使得一旦编码序列表达，每个调节元件都能完成它们预期的功能。能够可操作地连接的序列的例子是激活序列和增强子等。其它的调节元件包括选择性标记、扩增信号、复制起点等。例如，在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述了适宜的调节序列。
除了人工调节序列外，天然调节序列仍然可以存在于实际结构基因的上游。如果适当，可以通过基因修饰除去该天然调节，由此可以增加或降低基因表达。然而，基因构建体在结构上也可以更简单，即，在结构基因前不插入其它的调节信号，并且不除去天然启动子及其调节作用。可替代的方案，可以突变天然调节序列，使其不再产生调节作用，由此增加或降低基因表达。在基因构建体中可以存在一个或多个拷贝的目的核酸序列。
有用的启动子的例子是来源于谷氨酸棒状杆菌的启动子ddh，amy，lysC，dapA，lysA，及革兰氏阳性启动子SPO2(参见《枯草芽孢杆菌其近亲》(Bacillus Subtilis and its closest Relatives)，Sonenshein，AbrahamL.，Hoch，James A.，Losick，Richard；ASM Press，District of Columbia，Washington and Patek M.Eikmanns BJ.Patek J.Sahm H.Microbiology.142 1297-309，1996)，或者可以有利地用在革兰氏阴性细菌中的cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，laclq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，I-PR或I-PL启动子。还优选的是使用诱导型启动子诸如，光诱导型，和特别是温度诱导型启动子，诸如PrPI启动子。原则上，可以使用所有天然启动子和它们的调节序列。此外，有利地，可以使用合成的启动子。
上述调节序列旨在允许定向表达核酸序列和蛋白质。根据宿主生物体，这意味着例如，基因仅在诱导后表达或超表达，或者它立即表达和/或超表述。
在本发明上下文中，优选地，调节序列或因子对表达有不利作用，因此降低表达。因此，可以在转录水平通过利用弱转录信号诸如启动子和/或增强子实现表达消减。但是，也可以例如通过降低mRNA的稳定性实现翻译的消减。
在本发明上下文中，优选地，调节序列或因子对表达有积极作用，因此增加或降低表达。因此，可以有利地在转录水平通过利用强转录信号诸如启动子和/或增强子实现调节元件的增强作用。但是，也可以例如通过增加mRNA的稳定性实现翻译的增强。
通过融合适合的启动子、适合的SD(shine-Dalgarno)序列和metK核苷酸序列及适合的终止信号可以产生表达盒。例如，在Current Protocolsin Molecular Biology，1993，John Wiley & Sons，Incorporated，New York，PCR Method，Gelfand，David H.，Innis，Michael A.，Sinsky，John J.1999，Academic Press，Incorporated，California，San Diego，PCR CloningProtocols，Methods in Molecular Biology Ser.，192卷，第二版，HumanaPress，New Jersey，Totowa，T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中，和在T.J.Shihavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)中，和在Ausubel，F.M.等Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc，and Wiley Interscience(1987)中描述的常规重组和克隆技术可以用于该目的。
为了在适合的宿主生物体中表达，有利地，将重组核酸构建体或基因构建体插入到宿主特异性载体中，该宿主特异性载体将使基因在宿主中最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的，并且可以例如在“克隆载体”(Pouwels P.H.等编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。除了质粒外，载体也应理解为意指本领域技术人员熟知的所有其它载体，诸如，噬菌体、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或者随染色体复制。
例如，可以利用游离型质粒，表达本发明的metK基因。适合的质粒是在棒杆菌中复制的质粒。大量已知的质粒载体诸如，pZ1(Menkel等，Applied and Enviromental Microbiology (1989)64549-554)，pEKEx1(Eikmanns等，Gene 10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，Gene 10769-74(1991))是以隐蔽性质粒pHM1519，pBL1或pGA1为基础。同样可以使用其它质粒载体诸如，pCLiK5MSC，SEQ ID NO9，或基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的质粒。
其它适合的质粒载体是借助于其可以通过整合到染色体中实施基因扩增方法的质粒载体，关于此基因扩增方法可以参见，例如Remscheid等(Applied and Enviromental Microbiology 60126-132(1994))所述用于复制或扩增hom-thrB操纵子的方法。在该方法中，将完整基因克隆到能在宿主(通常是大肠杆菌)中复制，但不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的质粒载体中。适合的载体是，例如pSUP301(Sirnon等，Bio/Technology1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schfer等，Gene 145，69-73(1994))，Bernard等，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))，pEM1(Schrumpf等，1991，Journal of Bacteriology 1734510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，Gene 41337-342)。同样可以使用其它质粒载体诸如，pCLiK5MSC integrativ sacB，SEQ ID NO12。
随后，可以通过转化，将含有待扩增基因的质粒载体转移到期望的谷氨酸棒状杆菌株系中。例如，Thierbach等(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS Microbiological Letters123，343-347(1994))描述了转化方法。
通过分批方法，补料分批方法或重复的补料分批方法可以连续或不连续地培养本发明产生的微生物，以生产含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸。在Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Engineering 1.Introduction to Bioprocess Technology](GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科书中或在Storhas(Bioreaktorenand periphere Einrichtungen[生物反应器和外围设备](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))的教科书中可以发现关于已知培养方法的概述。
要使用的培养基必需适宜满足目的株系的需要。在美国细菌学协会的指南“Manual of Methods für General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)中可以找到用于各种微生物的培养基的描述。
本发明可以使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖诸如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源的例子是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可以通过复杂化合物诸如糖蜜或糖精炼的其它副产品向培养基添加糖。添加各种碳源的混合物也可能是有利的。其它可能的碳源是油类和脂肪诸如，大豆油、向日葵油、花生油和椰油，脂肪酸诸如，棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇类诸如，甘油、甲醇或乙醇，和有机酸诸如，醋酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的物质。氮源的例子包括氨气或铵盐诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或复杂氮源诸如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏和其它氮源。可以单独或做为混合物使用这些氮源。
培养基中可以存在的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
无机含硫化合物诸如，硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，及有机硫化合物诸如硫醇和巯基类化合物也可以用做硫源以生产含硫精细化学品，特别是甲硫氨酸。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用做磷源。
螯合剂可以添加到培养基中以将金属离子维持在溶液中。特别适合的螯合剂包括二羟基酚类，诸如儿茶酚或原儿茶酸，或有机酸诸如柠檬酸。
通常地，本发明使用的发酵培养基也包含其它生长因子诸如维生素或生长促进剂，包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐常常从复杂培养基组分诸如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等获得。而且，可以向培养基添加适合的前体。培养基中化合物的确切组成很大程度上取决于具体的实验，并且应根据每种情况单独确定。在教科书“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury编辑，IRL Press(1997)，53-73页，ISBN 019 963577 3)中可以发现关于培养基最优化的信息。也可以从商业来源获得生长培养基，诸如Standard 1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。
通过加热(在121℃，1.5巴下20分钟)或通过过滤灭菌对培养基的所有组分灭菌。所述组分可以一起进行灭菌，或者如果适当可以单独进行灭菌。所有的培养基组分可以在发酵开始时就存在，或者可以按需要连续或分批地添加。
通常地，培养温度是15℃至45℃，优选地25℃到40℃之间，在实验中培养温度可以保持恒定或者可以变化。培养基的pH应该在5到8.5的范围内，优选约7.0。在发酵期间，通过添加碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物诸如磷酸或硫酸可以控制发酵的pH。可以使用消泡剂诸如，脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫形成。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基添加适合的选择性作用物质诸如，抗生素。为了维持需氧条件，可以将氧气或含氧气体混合物，例如周围的空气通入培养物中。通常地，培养温度是20℃到45℃之间，优选地25℃到40℃之间。连续进行发酵直到形成最大量的期望产物。通常地，在10小时到160小时内达到该目的。
以此方式获得的发酵液，尤其是含有L-甲硫氨酸的发酵液通常含有7.5-25％重量的干生物量。
此外，有利的是至少在发酵末期，但特别是在发酵期的至少30％后在糖限制条件下进行发酵。这意味着在该时间期间，发酵培养基中可利用的糖的浓度维持在或降低到≥0到3g/l。
然后进一步处理发酵液。根据需要，可以通过分离方法诸如，离心、过滤、倾析或这些方法的联合，从发酵液中除去所有或一些生物量，或者将该生物量完全留在所述发酵液中。
随后，可以利用已知的方法，诸如，利用旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器，通过反渗透，或通过纳米过滤稠化或浓缩该发酵液。然后，可以通过冷冻干燥，喷雾干燥、喷雾制粒或通过其它方法后处理该浓缩的发酵液。
然而，还可以进一步纯化该含硫精细化学品，特别是L-甲硫氨酸。为此，除去生物量后，利用适合的树脂，对含有产物的发酵液进行层析，在层析树脂上将留下所有或部分期望的产物或杂质。如果必要，可以利用相同或其它的层析树脂重复这些层析步骤。本领域技术人员熟悉适宜的层析树脂的选择和它们最有效的用途。可以通过过滤或超过滤浓缩纯化的产物，并且在产物最稳定的温度下进行贮藏。
可以通过现有技术测定分离的化合物的身份和纯度。这些技术包括高效液相层析法(HPLC)、光谱法、染色法、薄层层析法、NIRS、酶测定法或微生物学测定法。在Patek等，(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等，(1996)Biotekhnologiya 11 27-32；和Schmidt等，(1998)Bioprocess Engineer.1967-70；Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry(1996)A27卷，VCHWeinheim，89-90页，521-540页，540-547页，559-566页，575-581页，581-587页；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等，(1987)Applications of HPLC in Biochemistry，《LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology》，17卷中概述了这些分析方法。
以下非限制性实施例更详细地描述了本发明。


图1显示分别利用野生型酶和C94A突变体进行放射性metK测定的结果。
实施例实施例1pCLiK5MCS的构建首先，通过聚合酶链式反应(PCR)使用寡核苷酸引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2扩增载体pBR322的氨苄青霉素抗性和复制起点。
SEQ ID NO15’-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3’SEQ ID NO25’-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3’除了与pBR322互补的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO1还以5’-3’方向含有限制性核酸酶SmaI、BamHI、NheI和AscI的切割位点，寡核苷酸引物SEQ ID NO2以5’-3’方向含有限制性内切核酸酶XbaI、XhoI、NotI和DraI的切割位点。根据标准方法如Innis等的方法(PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagen，La Jolla，USA)进行PCR反应。使用GFXTMPCR、DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化所得大小约为2.1kb的DNA片段。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书将DNA片段的钝端相互连接，并根据标准方法，如在Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stragagen，La Jolla，USA)中。通过涂含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂选择携带质粒的细胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
各单克隆的质粒DNA使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书进行分离并通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒被称为pCLik1。
从用作PCR反应的模板的质粒pWLT1(Liebl等，1992)开始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4扩增卡那霉素抗性盒。
SEQ ID NO35’-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3’SEQ ID NO45’-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’除了与pWLT1互补的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO3还以5’-3’方向含有限制性内切核酸酶XbaI、SmaI、BamHI、NheI的切割位点，寡核苷酸引物SEQ ID NO4以5’-3’方向含有限制性内切核酸酶AscI和NheI的切割位点。根据标准方法如Innis等的方法(PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications，Academic Press(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)进行PCR反应。使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化所得大小约为1.3kb的DNA片段。DNA片段用限制性内切核酸酶XbaI和AscI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割，之后再次使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。载体pCLiK1同样用限制性核酸内切酶XbaI和AscI切割并使用碱性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书去磷酸化。在浓度0.8％的琼脂糖凝胶中电泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离线性化载体(约2.1kb)。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书将切割的PCR片段连接到载体片段上，并根据标准方法，如在Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中，通过涂含有氨苄青霉素(50μg/ml)和卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂选择携带质粒的细胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
各单克隆的质粒DNA使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书进行分离并通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒被称为pCLik2。
载体pCLiK2用限制性内切核酸酶DraI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割。在浓度0.8％的琼脂糖凝胶中电泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离到约2.3kb载体片段。该载体片段使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书重新连接，并根据标准方法，如在Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中，通过涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂选择携带质粒的细胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
各单克隆的质粒DNA使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书进行分离并通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒被称为pCLik3。
从用作PCR反应的模板的质粒pWLQ2(Liebl等，1992)开始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6扩增pHM1519的复制起点。
SEQ ID NO55’-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’SEQ ID NO65’-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’除了与pWLQ2互补的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO5和SEQ IDNO6还含有限制性内切核酸酶NotI的切割位点。根据标准方法如Innis等的方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)进行PCR反应。使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化所得大小约为2.7kb的DNA片段。DNA片段用限制性内切核酸酶NotI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割，之后再次使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。载体pCLiK3同样用限制性核酸内切酶NotI切割并使用碱性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书进行去磷酸化。在浓度0.8％的琼脂糖凝胶中电泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离线性化载体(约2.3kb)。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书将切割的PCR片段连接到此载体片段上，并根据标准方法，如在Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中，通过涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂选择携带质粒的细胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
单克隆的质粒DNA使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书进行分离并通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒被称为pCLik5。
通过混合两条合成的基本互补的含有限制性内切核酸酶SwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaI和SmaI的切割位点的寡核苷酸SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，通过将它们一起加热到95℃然后缓慢冷却得到双链DNA片段，从而用多克隆位点(MCS)延伸pCLik5。
SEQ ID NO75’-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3’
SEQ ID NO85’-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3’载体pCLiK5用限制性核酸内切酶XhoI和BamHI(New EnglandBiolabs，Beverly，USA)切割并使用碱性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书进行去磷酸化。在浓度0.8％的琼脂糖凝胶中电泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离线性化载体(约5.0kb)。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书将合成的双链DNA片段连接到此载体片段上，并根据标准方法，如在Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，LaJolla，USA)中，通过涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂选择携带质粒的细胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
单克隆的质粒DNA使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书进行分离并通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒被称为pCLik5MCS。
根据Sanger等(1977)Proceedings of the National Acedemy of SciencesUSA 745463-5467进行测序反应。将测序反应物通过ABI Prism 377(PEApplied Biosystems，Weiterstadt)分级分离并分析。
所得质粒pCLiK5MCS被列为SEQ ID NO9。
实施例2pCLik5MCS integrativ sacB的构建从作为PCR反应模板的质粒pK19mob(Schfer等，Gene 145，69-73(1994))开始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO10和SEQ ID NO11扩增枯草芽孢杆菌sacB基因。
SEQ ID NO105’-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3’
SEQ ID NO115’-AGGAGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3’除了与pK19mobsac互补的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO10和SEQ ID NO11还含有限制性核酸内切酶NotI的切割位点。根据标准方法如Innis等的方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)进行PCR反应。使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(AmershamPharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化所得大小约为1.9kb的DNA片段。DNA片段用限制性内切核酸酶NotI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割，之后再次使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书纯化。
载体pCLiK5MCS同样用限制性核酸内切酶NotI切割并使用碱性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书进行去磷酸化。在浓度0.8％的琼脂糖凝胶中电泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)根据生产商的使用说明书分离大小约2.4kb的载体片段。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics，Mannheim)根据生产商的使用说明书将切割的PCR片段连接到此载体片段上，并根据标准方法，如在Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港，(1989))中描述的方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratgagene，La Jolla，USA)中，通过涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂选择携带质粒的细胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
单克隆的质粒DNA使用Qiaprep spin miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden)根据生产商的使用说明书进行分离并通过限制性消化检查。以这种方法得到的质粒被称为pCLik5MCS integrativ sacB。
根据Sanger等(1977)Proceedings of the National Acedemy of ScienceSUSA 745463-5467进行测序反应。将测序反应物通过ABI Prism 377(PEApplied Biosystems，Weiterstadt)分级分离并分析。
所得质粒pCLik5MCS integrativ sacB被列为SEQ ID NO12。
实施例3从谷氨酸棒状杆菌分离和克隆metK基因利用Tauch等，(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等，(1994)Microbiology 1401817-1828的方法，制备谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032染色体DNA。从Groβmann等(2000)FEMS Microbiology Letters 19399-103的metK序列开始合成下面的寡核苷酸引物SEQ ID NO135’-GAGAGCCCGGGAAGAAGGGCTGCGACCTCCTCAT-3’和SEQ ID NO145’-CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGTAACCCCA-3’利用如Innis等，(1990)PCR Protocols.A Guide to Method andApplications，Academic Press所述的标准方法，利用上述寡核苷酸引物和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)从谷氨酸棒状杆菌基因组DNA扩增1640碱基对DNA片段。
用限制酶MluI和SmaI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割该片段(该片段中通过PCR寡核苷酸引物已经引入了所述的MIuI和SmaI)，并且通过凝胶电泳分离。随后，利用GFXTMPCR，DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)，从琼脂糖分离DNA片段。
用限制酶SmaI和MluI同样地切割载体pCLiK5MCS，即SEQ IDNO9，并且用碱性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根据制造商的说明书去磷酸化。用T4 DNA连接酶连接载体和DNA片段(AmershamPharmacia，Freiburg)，并且根据Sambrook等，(1989)Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor中所描述的标准方法将连接混合物转化到大肠杆菌XL-1 Blue(Stratagene)中。
用来源于Quiagen的方法和材料制备质粒DNA。根据Sanger等，(1997)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 745463-5467进行测序反应。通过ABI Prism 377装置(PE Applied Biosystem，Weiterstadt)分离和评估测序反应物。
由此得到的质粒pCLiK5MCS/metKwt列为SEQ ID NO15。
实施例4谷氨酸棒状杆菌metK基因的诱变利用QuickChange试剂盒(Stratagene)，根据制造商的说明书进行谷氨酸棒状杆菌metK基因的定向诱变。在质粒pCLiK5MCS/metKwt，即SEQ ID NO15中进行该诱变。合成下面的寡核苷酸引物以将SEQ IDNO16中的半胱氨酸94置换为丙氨酸94SEQ ID NO175’-GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3’和SEQ ID NO185’-GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3’这些寡核苷酸引物的使用在SEQ ID NO15位置1056(G置换C)和1057(C置换A)中产生了核苷酸的置换。转化和质粒制备后，通过测序反应证实metK基因中所得到的氨基酸置换Cys94Ala。质粒命名为pCLiK5MCS/metKC94A，并且列为SEQ ID NO19。
实施例5SAM合酶(metK)试验在30℃，在BHI/葡萄糖培养基(37g/l制备的脑心浸液培养基，Difco，10mM(NH4)2SO4，4％葡萄糖)中培养已经用质粒pCLiK5MCS/metKwt(SEQ ID NO15)或用质粒pCLiK5MCS/metKC94A(SEQ ID NO19)转化的谷氨酸棒状杆菌株系直到20的OD600。在4℃，离心沉淀细胞，用冷的生理盐水冲洗沉淀。再次离心后，在4℃，在1ml裂解缓冲液(50mMTris pH7.5，10mM MgCl2，50mM KCl，1mM DTT)中重悬浮0.25g湿细胞沉淀。在旋转设定值是6.0下，在Hybaid的Ribolyser中在Hybaid的蓝色Ribolyser管中裂解细菌悬浮液3次，每次30秒。通过以13 000rpm，在Eppendorf离心机中离心45分钟澄清该裂解液，用水以1∶10稀释该上清液。通过Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72248-254方法测定蛋白质含量。
用具有下面改变的Markham，G.D.等，(1983)Methods in Enzymology94219-222方法测定SAM合酶的酶活性对于100μg所述蛋白质裂解液，制备100μl反应混合物，该反应混合物包含100mM Tris pH8.0，100mM KCl，20mM MgCl2，1.2mM L-甲硫氨酸，10mM ATP，1μl35S-L-甲硫氨酸(相当于15.15μCi)(AmershamSJ204，比活性1Ci/μmol)，添加水到100μl，之后在37℃温育。0，5，10，20，30和60分钟后，移出10μl等份的反应混合物，在冰上用20μl 50mM EDTA终止反应。
将30μl终止的反应物置放在磷酸纤维素滤器(Pierce，No.29520)上，并且在Eppendorf离心机上以6000rpm旋转离心1分钟。用500μl 75mM磷酸洗滤器2次，然后将其放到含有闪烁液的计数管中。在闪烁计数仪(Beckman)中测定形成的S-腺苷甲硫氨酸的放射性。
数据显示在所附图1中。
考虑到放射性L-甲硫氨酸的比活性和所使用的蛋白质量，可以从每单位时间掺入的放射性的增加测定S-腺苷甲硫氨酸形成的速率。它的单位是μmol S-腺苷甲硫氨酸/mim*mg蛋白质。可以比较野生型酶和突变酶之间的该速率。
实施例6
谷氨酸棒状杆菌中细胞内S-腺苷甲硫氨酸效价的测定为了测定已经用pCLiK5MCS/metKwt(SEQ ID NO15)或用质粒pCLiK5MCS/metKC94A(SEQ ID NO19)转化的谷氨酸棒状杆菌株系中细胞内S-腺苷甲硫氨酸的效价，利用下面的方法。在三氯醋酸中重悬浮用冰冷生理盐水冲洗过的如实施例5中所述获得的细胞沉淀(200μl TCA/0.1g湿沉淀)。放置在冰上5分钟后，在4℃和13 000rpm，在Eppendorf离心机上澄清该悬浮液5分钟。通过HPLC方法(lonospher 5C阳离子交换柱，注射体积10μl，流动相70％体积/体积0.2M甲酸铵pH 0.4，30％体积/体积的甲醇；UV测定260nm；40℃；保留时间8.5分钟)测定上清液中S-腺苷甲硫氨酸含量。
表1S-腺苷甲硫氨酸效价

实施例7用metK C94A置换谷氨酸棒状杆菌中metKwt基因为了用突变体metK C94A进行谷氨酸棒状杆菌KFCC10065中metK野生型基因的等位基因置换，首先将SEQ ID NO19的metK C94A序列克隆到pCLiK5MCS integrativ sacB(SEQ ID NO12)中。为此，用限制内切核酸酶BglII和XhoI(NEB，Schwalbach)切割质粒pCLiK5MCS/metKC94A(SEQ ID NO19)。如实施例3中所述纯化由此得到的1962bp碱基对片段。用BglII和XhoI同样地切割载体pCLiK5MCSintegrativ sacB，并且如实施例3中所述纯化。如实施例3所述，连接载体和片段，并且转化到大肠杆菌XL-1 Blue中。纯化质粒，并且测序后证实该质粒。由此得到的质粒pCLiK5MCS integrativ sacB/metK C94A列为SEQ ID NO20。
如Liebl等(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303所述，通过电穿孔将质粒pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A转化到谷氨酸棒状杆菌KFCC10065中。在DE 10046870中描述了该方法的修改。通过Sambrook等(1989)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor所述的Southern印迹和杂交的标准方法证实各转化体的metK基因座的染色体安排。由此确保转化体是通过同源重组在metK基因座整合了转化的质粒的转化体。在无抗生素的培养基上过夜培养这种菌落后，将这些转化体涂到蔗糖CM琼脂培养基平板上(10％蔗糖)，并且在30℃温育24小时。
因为存在于载体pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A中的sacB基因将蔗糖转化为有毒产物，所以只有通过在野生型metK基因和突变的metKC94A基因之间进行二次同源重组缺失sacB基因的那些菌落才能生长。当发生同源重组时，野生型基因或突变的基因可以与sacB基因一起缺失。如果sacB基因与野生型基因一起被移除，那么就产生了突变转化体。
挑取生长的菌落，制备它们的基因组DNA，通过2种方法分析metK基因。首先，利用实施例4中所述2个核苷酸的置换。利用在其3’末端能区分两个等位基因的特异性PCR寡核苷酸引物和第二个metK特异性寡核苷酸引物，产生诊断性PCR片段。其次，用结合突变上游或下游的PCR寡核苷酸引物PCR扩增后，测序约100个转化体的metK基因座。获得几个突变的metK克隆。一个这样的克隆被命名为KFCC10065metKC94A。突变体C94A的氨基酸序列对应于SEQ ID NO22。
实施例8利用株系KFCC10065metKC94A生产甲硫氨酸在30℃，在含有BHI培养基(Difco)的琼脂平板上培养实施例6中产生的株系KFCC10065metKC94A两天。在盐水中悬浮生长于琼脂平板的细胞，并且以1.5 OD 600nm转移到培养基II。培养基II的组分如下
培养基IIA0.6g/lKH2PO40.4g//l MgSO4·7H2O25g/l (NH4)2SO440g/l 粗糖60g/l 糖蜜用NH4OH将制备的培养基的pH调节到7.8，并且在120℃灭菌30分钟。
培养基IIB0.3mg/l 硫胺素·HCl1mg/l 生物素2mg/l FeSO42mg/l MnSO40.1mg/l 维生素B12单独制备培养基IIB，过滤灭菌，并且添加到培养基IIA中。两个组分IIA和IIB一起形成了培养基II。
在含有0.5g无菌CaCO3的100ml锥形瓶中，用上述株系的细胞接种10ml培养基II(＝IIA+B)，并且在30℃，以200rpm，在定轨摇床上温育72小时。
利用来源于Agilent的氨基酸测定方法，在Agilent 1100 Series LCSystem HPLC上测定培养液中形成的甲硫氨酸。用邻苯二醛在上柱前衍生化以允许定量形成的氨基酸，而在Hypersil AA柱(Agilent)上分离氨基酸混合物。
序列表<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>发酵生产含硫精细化学品的方法<130>M/43138<160>23<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52<210>2<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg 53<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga47<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4gagaggcgcg ccgctagcgt gggcgaagaa ctccagca 38
<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa 34<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc 34<210>7<211>140<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位点<400>7tcgaatttaa atctcgagag gcctgacgtc gggcccggta ccacgcgtca tatgactagt 60tcggacctag ggatatcgtc gacatcgatg ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc 120tctagacccg ggatttaaat 140<210>8<211>140<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位点<400>8gatcatttaa atcccgggtc tagaggatcc caattgttaa ttaacgcaga agagcatcga 60tgtcgacgat atccctaggt ccgaactagt catatgacgc gtggtaccgg gcccgacgtc 120aggcctctcg agatttaaat 140<210>9<211>5091<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>质粒<400>9tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60cggacctagg gatatcgtcg acatcgatgc tcttctgcgt taattaacaa ttgggatcct 120ctagacccgg gatttaaatc gctagcgggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc 180agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg 240gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta 300gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt 360aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg 420cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 480gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 540gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 600ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 660gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 720actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 780tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 840acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 900cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 960ctcgcgccag ccgaaccgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc1020gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct1080ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct1140acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac1200ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc1260tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag1320atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg1380ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc cacgctagcg1440gcgcgccggc cggcccggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc1500aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga1560gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca1620ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg1680ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt1740
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aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct3180ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca3240gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct3300cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc3360gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggcat ctcagttcgg tgtaggtcgt3420tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc3480cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc3540cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg3600gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc3660agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag3720cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga3780tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat3840tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg3900ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaaaatttt cgtgccgcgt gattttccgc caaaaacttt3960aacgaacgtt cgttataatg gtgtcatgac cttcacgacg aagtactaaa attggcccga4020atcatcagct atggatctct ctgatgtcgc gctggagtcc gacgcgctcg atgctgccgt4080cgatttaaaa acggtgatcg gatttttccg agctctcgat acgacggacg cgccagcatc4140acgagactgg gccagtgccg cgagcgacct agaaactctc gtggcggatc ttgaggagct4200ggctgacgag ctgcgtgctc ggccagcgcc aggaggacgc acagtagtgg aggatgcaat4260cagttgcgcc tactgcggtg gcctgattcc tccccggcct gacccgcgag gacggcgcgc4320aaaatattgc tcagatgcgt gtcgtgccgc agccagccgc gagcgcgcca acaaacgcca4380cgccgaggag ctggaggcgg ctaggtcgca aatggcgctg gaagtgcgtc ccccgagcga4440aattttggcc atggtcgtca cagagctgga agcggcagcg agaattatcg cgatcgtggc4500ggtgcccgca ggcatgacaa acatcgtaaa tgccgcgttt cgtgtgccgt ggccgcccag4560gacgtgtcag cgccgccacc acctgcaccg aatcggcagc agcgtcgcgc gtcgaaaaag4620cgcacaggcg gcaagaagcg ataagctgca cgaatacctg aaaaatgttg aacgccccgt4680gagcggtaac tcacagggcg tcggctaacc cccagtccaa acctgggaga aagcgctcaa4740aaatgactct agcggattca cgagacattg acacaccggc ctggaaattt tccgctgatc4800tgttcgacac ccatcccgag ctcgcgctgc gatcacgtgg ctggacgagc gaagaccgcc4860gcgaattcct cgctcacctg ggcagagaaa atttccaggg cagcaagacc cgcgacttcg4920ccagcgcttg gatcaaagac ccggacacgg agaaacacag ccgaagttat accgagttgg4980
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<400>16Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Cys Gly Val85 90 95Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105110Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Set145 150 155 160Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu195 200 205Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240
Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg370 375 380Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala405<210>17<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>质粒<220>
<221>CDS<222>(1)..(1224)<223>
<400>21gtg gct cag cca acc gcc gtc cgt ttg ttc acc agt gaa tct gta act 48Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15gag gga cat cca gac aaa ata tgt gat gct att tcc gat acc att ttg 96Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30gac gcg ctg ctc gaa aaa gat ccg cag tcg cgc gtc gca gtg gaa act144Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45gtg gtc acc acc gga atc gtc cat gtt gtt ggc gag gtc cgt acc agc192Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60gct tac gta gag atc cct caa tta gtc cgc aac aag ctc atc gaa atc240Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80gga ttc aac tcc tct gag gtt gga ttc gac gga cgc acc gct ggc gtc288Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Ala Gly Val85 90 95tca gta tcc atc ggt gag cag tcc cag gaa atc gct gac ggc gtg gat336Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110aac tcc gac gaa gcc cgc acc aac ggc gac gtt gaa gaa gac gac cgc384Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125
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370 375 380act gat ttg gac ctt cct tgg gag gct atc gac cgc gtt gat gaa ctt1200Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400cgc gca gcc ctc aag ttg gcc taa1224Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala405<210>22<211>407<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>质粒<400>22Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Ala Gly Val85 90 95Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser145 150 155 160
Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu195 200 205Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270Gly Met Ala Arg His G1y Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg370 375 380Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala405
<210>23<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>可变部分序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa＝Phe或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa＝Asp或Ser<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa＝任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa＝任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>Xaa＝除Cys外的任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa＝Ser或Thr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Xaa＝Gly或Ala<400>23Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val1 权利要求
1.发酵生产至少一种含硫精细化学品的方法，该方法包括下面的步骤a)发酵产生期望含硫精细化学品的棒杆菌细菌培养物，该棒杆菌表达至少一种编码具有修饰的S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)活性的蛋白质的核苷酸序列；b)在培养基和/或细菌细胞中富集含硫精细化学品，和c)分离含硫精细化学品。
2.如权利要求1所述的方法，其中该含硫精细化学品包括L-甲硫氨酸。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中使用与未突变的野生型比较，其metK活性降低的突变的棒杆菌细菌。
4.如前述任一权利要求所述的方法，其中突变的棒杆菌与未突变的野生型比较还具有改进的metY活性和/或增加的L-甲硫氨酸量。
5.如前述任一权利要求所述的方法，其中metK编码序列是编码具有降低的metK活性的蛋白质的编码核苷酸序列，其中该蛋白质中置换了野生型蛋白质的至少一个半胱氨酸残基。
6.如权利要求5所述的方法，其中metK编码序列是编码具有metK活性的蛋白质的编码核苷酸序列，其中该蛋白质具有下面的氨基酸子序列G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V其中X1和X2相互独立地表示任何氨基酸；且X3表示除了Cys以外的氨基酸。
7.如前述任一权利要求所述的方法，其中metK编码序列编码具有metK活性的蛋白质，该蛋白质包含如SEQ ID NO22中所示从Val1到Ala407的氨基酸序列或与之同源并且代表功能性等价蛋白质的氨基酸序列。
8.如前述任一权利要求所述的方法，其中metK编码序列是能在棒杆菌细菌中复制或稳定地整合到染色体中的DNA，或RNA。
9.如前述任一权利要求所述的方法，其中a)利用已经被质粒载体转化的细菌株系，其中该载体带有处于调节序列控制下的至少一个拷贝的突变metK序列，或b)利用突变的metK序列已经整合到细菌染色体中的株系。
10.如前述任一权利要求所述的方法，其中发酵所述细菌，在该细菌中此外还增强了期望的含硫精细化学品的生物合成途径中的至少另一种基因。
11.如前述任一权利要求所述的方法，其中发酵所述细菌，在该细菌中至少一种减少期望的含硫精细化学品形成的代谢途径被至少部分地关闭。
12.如前述任一权利要求所述的方法，其中发酵棒杆菌，在该棒杆菌中同时超表达至少一种选自下面的基因a)编码天冬氨酸激酶的基因lysC，b)编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的基因asd，c)编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因gap，d)编码3-磷酸甘油酸激酶的基因pgk，e)编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，f)编码磷酸丙糖异构酶的基因tpi，g)编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的基因metA，h)编码胱硫醚-γ合酶的基因metB，i)编码胱硫醚-γ裂合酶的基因metC，j)编码甲硫氨酸合酶的基因metH，k)编码丝氨酸羟甲基转移酶的基因glyA，l)编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因metY，m)编码亚甲基四氢叶酸还原酶的基因metF，n)编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的基因serC，o)编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因serB，p)编码丝氨酸乙酰基转移酶的基因cysE，q)编码半胱氨酸合酶的基因cysK，r)编码高丝氨酸脱氢酶的基因hom；和/或同时突变上述基因中的至少一种基因，这种突变使得相应蛋白质的活性与未突变蛋白质比较受代谢物影响的程度较低或者不受代谢物的影响，或者这种突变增加蛋白质的比活性。
13.如前述任一权利要求所述的方法，其中发酵棒杆菌细菌，在该棒杆菌中同时减弱至少一种选自下面的基因a)编码高丝氨酸激酶的基因thrB；b)编码苏氨酸脱水酶的基因ilvA；c)编码苏氨酸合酶的基因thrC；d)编码内消旋二氨基庚二酸D脱氢酶的基因ddh；e)编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的基因pck；f)编码葡萄糖-6-磷酸-6异构酶的基因pgi；g)编码丙酮酸氧化酶的基因poxB；h)编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因dapA；i)编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因dapB，和j)编码二氨基吡啶甲酸脱羧酶的基因lysA；和/或在该棒杆菌中同时突变这些基因中的至少一种基因使得部分或全部地降低相应蛋白质的酶活性。
14.如前述任一权利要求所述的方法，其中使用谷氨酸棒状杆菌微生物物种。
15.从发酵液生产含L-甲硫氨酸的动物饲料添加剂的方法，该方法包括下面的步骤a)在发酵培养基中培养和发酵前述任一权利要求所述的生产L-甲硫氨酸的微生物，b)从含L-甲硫氨酸的发酵液除去水；c)除去发酵期间形成的0到100％重量的生物量；和d)干燥从b)和/或c)获得的发酵液，以获得期望的粉末或颗粒形式的动物饲料添加剂。
16.如权利要求5到7任一所述的编码具有降低的metK活性的多肽的分离的多核苷酸。
17.由权利要求16所述的多核苷酸编码的具有降低活性的metK突变体。
18.表达突变的metK基因的重组棒杆菌细菌，其中该突变的metK基因包含如权利要求5到7任一所述的多核苷酸序列。
19.如权利要求18所述的重组棒杆菌细菌，其不再表达metK野生型酶。
20.如权利要求19所述的重组棒杆菌细菌，与相应的野生型株系比较，其具有至少一种下面的性状a)更低的细胞内S-腺苷甲硫氨酸效价；b)更低的细胞内S-腺苷甲硫氨酸合酶浓度，或c)根据S-腺苷甲硫氨酸形成速率测定的更低的S-腺苷甲硫氨酸合酶活性，并且，如果适当的话，其还具有至少一种下面的性状d)改进的metY活性或e)增加的L-甲硫氨酸的量。
21.表达构建体，其含有在调节核苷酸序列控制下的权利要求5到7任一所述的metK突变体编码序列。
全文摘要
本发明涉及利用细菌，通过发酵生产含硫精细化学品，特别是L－甲硫氨酸的方法，在该细菌中表达编码S－腺苷甲硫氨酸合酶(metK)基因的核苷酸序列。
文档编号C12P13/12GK1656229SQ03811767
公开日2005年8月17日 申请日期2003年5月23日 优先权日2002年5月23日
发明者H·施罗德, B·克勒格尔, O·策尔德尔, C·克洛普罗格, S·哈夫纳 申请人:巴斯福股份公司