通过连续发酵生产化学品的方法

专利名称:通过连续发酵生产化学品的方法
技术领域：
本发明涉及通过连续发酵生产化学品的方法。
背景技术：
涉及培养微生物或培养细胞的用于生产物质的发酵方法可以大致分成(I)分批发酵方法和补料分批或半分批发酵方法、和(2)连续发酵方法。分批、补料分批或半分批发酵方法采用纯微生物培养技术，在生产发酵中具有优势，诸如使用简单设施、短时间内完成培养、和被培养微生物之外的不想要微生物污染的可能性低。然而，培养物中的产物浓度会随着时间过去而增加，从而由于产物对发酵的抑制作用或渗透压增加的影响，而导致生产力和产率的降低。相应地，难以长时间稳定地维持高产率和高生产力。
另一方面，连续发酵方法可以通过防止目的物质在发酵罐中的累积，比上述分批、补料分批或半分批发酵方法，更长时间地保持高产率和高生产力。常规的连续培养是，通过向发酵罐补料新鲜介质同时从发酵罐中排出相同量的培养物以使发酵罐中的液体量保持恒定的一种培养方法。在分批培养中，当初始底物的浓度由于消耗而降至零时，培养被终止；而在连续培养中，在理论上培养可以无限地继续下去。
在常规连续培养中，另一方面，微生物连同培养基一起从发酵罐中排出，使得发酵罐中的微生物很难保持高浓度。如果发酵罐中的微生物可以保持高浓度，则可以导致发酵生产效率/发酵体积的改善。为了这个目的，微生物应保留在发酵罐中或回流入发酵罐。
在发酵罐中保留或回流微生物的方法的例子包括，通过离心分离对排出的培养物进行固-液分离且将沉淀的微生物送回发酵罐的方法、和过滤排出的培养物以分离固体形式的微生物而仅从发酵罐中排出培养物的上清液的方法。然而，由于高动力成本，使用离心分离的方法是不实际的。使用过滤的方法要求高压力用于如上所述的过滤，这使得该方法主要在实验室水平上进行 了检查。
因此，已提出用于保持培养物中的高微生物或培养细胞浓度的连续发酵方法。该方法包括通过分离性膜分离微生物或培养细胞、将由此分离的微生物或培养细胞保留或回流至培养物中，同时从滤液中回收产物。例如，已公开了涉及在连续发酵装置中使用陶瓷膜的膜分离型连续发酵的技术(专利文献I至3)。
另一方面，近来已提出通过使用连续培养装置、使用有机聚合物分离膜进行连续培养的技术(参考专利文献4和5)。根据该提议，通过使用配备有用于培养微生物或培养细胞的罐和用于在目的发酵产物和微生物或培养细胞之间进行膜分离的罐的连续培养装置，与分批、补料分批或半分批培养方法相比，可以以更高的生产率生产多种化学品。
在使用分离膜的此类连续发酵技术中，已通过使用具有良好透水性的分离膜来减少膜的面积并由此减少装置尺寸，从降低成本的角度，尝试了对设备成本、膜更换成本和安装面积的降低。从此成本角度，相对于其体积具有宽的过滤面积的中空纤维膜是具有吸引力的。
然而，由于在过滤操作过程中附着至膜表面的SS (悬浮固体)或吸附物，此类分离膜，包括空心纤维膜，有时具有变差的过滤能力，从而使得不能确保必需的滤过量。关于防止膜被微生物或培养细胞堵塞的方法，已有几个提议，涉及清洁多孔分离膜或设定过滤条件的技术。
作为清洁多孔分离膜的方法，已公开了例如，用温水回洗(backwash)多孔分离膜的方法(专利文献7)、用过滤的透过物回洗多孔分离膜的方法(专利文献8)等。
此外，可以使用擦洗方法，其在供应气体的同时进行清洁。擦洗清洁已经用于水处理。例如，专利文献9已提出了在组件中引入气体且同时将气体或液体引至膜的滤液侧，从而清洁膜的方法。
另一方面，有例子，在使用高浓度微生物、用于水处理的膜生物反应器(MBR)中使用气体清洁方法。例如，公开了这样的方法，其中由在组件的下部提供的原水供应进口，供应含气原水(专利文献10)。
背景技术文件
专利文献
专利文献I JP-A-5-95778
专利文献2 JP-A-62-138184
专利文献3 JP-A-10-174594
专利文献4:W007/097260
专利文献5 JP-A-2008-212138·[0020]专利文献7 JP-A-2000-317273
专利文献8:日本专利特许公开号Hei JP-A-11-215980
专利文献9:日本专利号3948593
专利文献10 JP-A-2005-88008
发明概述
发明待解决的技术问题
在专利文献7和8中所述的清洁分离膜的方法是:对在发酵完成后从培养物中过滤和回收发酵产物时使用的多孔分离膜，进行清洁的方法。如果将此类清洁方法用于连续发酵方法以在过滤处理后将微生物或培养细胞保留在培养物中，那么因为培养物被稀释，将难以使发酵生产力保持在高水平。
专利文献9中提出的技术是:处理具有0.1-5浊度的用作目的原水的河流表面流动水的方法。引起堵塞的物质不同于在培养物过滤过程中引起堵塞的物质，因此，对于在连续发酵中防止堵塞和过滤能力的恶化，这种方法不能完全显示出其作用。
根据专利文献10，气体的供应仅旨在满足膜表面的清洁作用，并不考虑过度供应的气体对发酵结果以及对产物的过滤分离的影响。这意味着专利文献10的技术不能就此被应用于化学品的生产。
在现有技术中，对于使用膜分离技术、用于连续发酵操作的合适擦洗清洁方法，尚未有研究。因此，需要增强化学品的发酵生产力同时进行膜表面清洁以保持分离膜的可滤性的方法。
本发明的目的是:提供通过连续发酵生产化学品的方法，所述方法仅需要简单容易的操作，但长时间稳定地保持高生产力。[0031]用于解决技术问题的技术方案
本发明人已进行了大量的研究，着眼于克服上述技术问题。结果发现，通过从膜组件的下部或从连接发酵罐与膜组件的管道、以0.15cm/s-70cm/s的线速度供应气体，可以减少膜的堵塞，从而长时间稳定地进行膜操作，且同时改善发酵性能。这使得能够长时间稳定生产化学品。本发明已基于上述发现而完成，并提供了下述方法。
(I)通过连续发酵生产化学品的方法，该方法包括:
(a)在发酵罐中培养培养物中的细胞，以发酵原料而产生化学品；
(b)通过使用分离膜组件进行培养物的过滤；
(c)从培养物中分离含化学品的透过物，同时将未透过的液体保留在发酵罐中，和
(d)从分离膜组件的下部和连接发酵罐与分离膜组件的管道的至少之一，供应气体，以将分离膜组件中的气体线速度(linear velocity)调整至0.15cm/s-70cm/s,同时向分离膜组件供应液体。
(2)根据(I)的用于生产化学品的方法，其中在步骤(d)中，气体含有氧。
(3)根据(2)的用于生产化学品的方法，除了步骤(d)外，进一步包括向发酵罐供应气体的步骤(e)，其中:
在步骤(d)中间歇地供应气体，并且
在步骤(d)中不供应气体时，与步骤(d)中供应气体时相比，步骤(e)中的气体供应速率增加。
(4)根据(I)至(3)之任一项的用于生产化学品的方法，其中步骤(d)中的过滤间歇地进行。
(5)根据(I)至(4)之任一项的用于生产化学品的方法，其中细胞是微生物。
(6)根据权利要求
5的用于生产化学品的方法，其中微生物是属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、普罗威登斯菌属(Provideneia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)和沙雷氏菌属(Serratia)之任一的微生物。
(7)根据(6)的用于生产化学品的方法，其中微生物是大肠杆菌(Escherichiacoli)、雷氏普威登斯菌(Providencia rettgeri)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)之任一。
(8)根据(I)至(4)之任一项的用于生产化学品的方法，其中细胞是酵母。
(9)根据(I)至(8)之任一项的用于生产化学品的方法，其中化学品是氨基酸。
(10)根据(9)的用于生产化学品的方法，其中氨基酸是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸或L-亮氨酸。
(11)根据(I)至(8)之任一项的用于生产化学品的方法，其中化学品是有机酸。
(12)根据(11)的用于生产化学品的方法，其中化学品是乳酸。
(13)根据(I)至(8)之任一项的用于生产化学品的方法，其中化学品是尸胺。
发明的有益效果
本发明使得能够长时间稳定分离膜的过滤性质、增强发酵结果、减少被培养所需的微生物之外的不想要微生物污染的可能性、以及在发酵工业中广泛地以低成本稳定地生产化学品一作为发酵产物。
附图简述

图1是示意性，显示待在本发明中使用的膜分离型连续发酵装置的一个例子。
图2是显示在比较实施例1和实施例1图3是显示在比较实施例1和实施例1图4是显示在比较实施例1和实施例1图5是显示在比较实施例1和实施例1图6是显示在比较实施例3和实施例5图7是显示在比较实施例3和实施例5图8是显示在比较实施例3和实施例5图9是显示在比较实施例3和实施例5图10是显示在比较实施例5和实施例9图11是显示在比较实施例5和实施例9图12是显示在比较实施例5和实施例9图13是显示在比较实施例5和实施例9-13中的跨膜压差变化的图表。
图14是质粒pTRSll的序列图。
发明实施方式
1.连续发酵装置
接下来将参考图1描述连续发酵装置的一个例子。图1是根据本发明实施方案的连续发酵装置的示意图。
如图1中所示，连续发酵装置100配备发酵罐1、分离膜组件2、和用于在发酵罐I与分离膜组件2之间连接的管道。发酵罐I和分离膜组件2彼此连接，构成一个循环系统。
发酵罐I的构成使得培养物可以置于其中。更具体而言，发酵罐I由具有优良的耐压性、抗热性和防污性质的材料制成。发酵罐I可以具有多种形状，例如圆柱形和多边柱形。发酵罐I可以具有这样的形状，所述形状允许在其中倾倒发酵原料、细胞和发酵所需的固体、液体或气体、以及搅拌所得到的混合物，并且需要时允许灭菌、以及允许密封。从培养物搅拌效率的角度来看，发酵罐I优选是圆柱形的。发酵罐I优选内部维持在压力下，以便阻止微生物从发酵罐外进入发酵罐I内且在其中增殖。为了控制发酵罐I中的压力，提供随后描述的机械装置，例如发酵罐压力计23等。
分离膜组件2配备许多分离膜例如中空纤维膜或平片膜。分离膜组件的细节将随后详细描述。
连续发酵装置100配备控制装置28。控制装置28可以进行多种计算。基于多种传感器的检测结果、用户的输入和多种设置，控制装置28控制连续发酵装置100中的每个部件的操作。
连续发酵装置100进一步配备发酵罐气体供应装置21、发酵罐压力调节阀22、发酵罐压力计23、温度控制部件3、搅拌装置4、pH控制部件5和水位控制部件6，作为主要参与发酵步骤的机械装置。
发酵罐气体供应装置21将气体供应到发酵罐I。由此供应的气体可以被回收且随后再次借助于发酵罐气体供应装置21向发酵罐I中供应。
基于控制装置28的控制，当通过发酵罐压力计23检测到的发酵罐I中的大气压达到上限时,发酵罐压力调节阀22将空气从发酵罐I释放到外部。以此方式，发酵罐I内的压力可以维持在合适水平。发酵罐I内的压力优选维持在高于外部大气压的压力下，以防止发酵罐中微生物被污染。
温度控制部件3配备温度传感器和温度调节部件。温度传感器检测发酵罐I中的培养物温度。在控制装置28的控制下，温度调节部件工作，以使得温度传感器的检测结果落入预定范围内。因此，适于发酵或细胞增殖的温度环境可以通过保持发酵罐I中的温度恒定，而维持。温度调节部件可以具有加热和冷却功能中的一种或两种。
搅拌设备4通过搅拌发酵罐I中的培养物，维持适当的发酵环境。
pH控制部件5配备pH传感器51和中和剂供应泵10。pH传感器51检测发酵罐I中的培养物的pH。中和剂供应泵10置于管道上，所述管道连接中和剂槽和发酵罐1、并且将中和剂加入发酵罐I中。中和剂供应泵10在控制装置28的控制下工作，使得pH传感器51的检测结果落入预定范围内。作为中和剂，使用酸或碱。
水位控制部件6配备水位传感器61和培养基供应泵9。培养基供应泵9置于连接培养基槽和发酵罐I的管道上。在控制装置28的控制下，当水位传感器61的检测结果显示发酵罐I中的培养物液体表面水位低于预定下限时，培养基供应泵9开始运转以将培养基供应给发酵罐I ;当液体表面达到上限时，终止培养基供应泵9的运转。由此，发酵罐I中的培养物量被维持在适当量。
连续发酵装置100配备循环系统，在发酵罐I与分离膜组件2之间循环培养物。更具体而言，连续发酵装置100配备有连接在发酵罐I与分离膜组件2的第一侧(primaryside)之间的管道81、和将未通过分离膜组件2的分离膜的浓缩物送回发酵罐I的管道82。在本发明实施方案中，管道81与分离膜组件2的下部连接，由此培养物从此下部供应给分离膜组件2。在将培养物从发酵罐I供应到分离膜组件2的管道81上，放置循环泵8。循环泵8工作，以将培养物从发酵罐I注入分离膜组件2。
此外，连续发酵装置100配备管道83，所述管道83连接至分离膜组件2并且将滤液(即，透过物)排出该装置。在管道83上，提供过滤泵11，并且在过滤泵和分离膜组件2之间提供过滤阀12。
连续发酵装置100配备用于回洗分离膜组件2的构造。术语“回洗”(backwash)意指通过使清洁用的液体(下文可以被称为“清洁液”)经过分离膜从其第二侧到第一侧来清洁分离膜。连续发酵装置100配备在其中含有清洁液的清洁液槽、连接清洁液槽和分离膜组件2的第二侧的管道84、在管道84上提供的清洁泵13、和在清洁泵13和分离膜组件2之间提供的清洁阀14。通过清洁泵13，清洁液被递送给分离膜组件2。
管道84可具有压力计、流量计、除菌装置、除菌滤器等。
压力差控制部件7可以检测分离膜组件2的跨膜压差(TH))。换言之，它检测在第一侧(培养物供应侧)和第二侧(透过物，即滤液，排放侧)之间的压力差。
连续发酵装置100进一步具有涉及擦洗的构造。擦洗是一种清洁方法，其中将气体供应给分离膜组件的第一侧，并且利用气体经过分离膜组件的过程中发生的液体和气体的振荡，从分离膜表面去除附着至其上的物质。
在连续发酵装置100中，特别地，从分离膜组件2的下部和连接发酵罐I与分离膜组件2的管道81之至少一个，向分离膜组件2供应气体。特别地作为与擦洗相关的构造，配备气体供应源、气体供应口、和能够调节自气体供应源的气体供应速率的机械装置。
更具体而言，连续发酵装置100配备:组件气体供应控制阀15、组件擦洗气体供应装置16、管道气体供应控制阀17、管道擦洗气体供应装置18、泵上游的管道气体供应控制阀19、和泵上游的管道擦洗气体供应装置20。
应当注意，在组件擦洗气体供应装置16、管道擦洗气体供应装置18和泵上游的管道擦洗气体供应装置20中，至少一个气体供应源是必需的。这意味着，本发明实施方案涵盖具有仅一个、仅两个和所有三个气体供应装置的相应构造。组件气体供应控制阀15、管道气体供应控制阀17、和泵上游管道气体供应控制阀19是分别与组件擦洗气体供应装置16、管道擦洗气体供应装置18、和泵上游管道擦洗气体供应装置20配对的构件。
组件擦洗气体供应装置16经由管道86连接至分离膜组件2的分离膜的第一侧，即培养物供应侧。管道86是不同于管道81的管道，培养物经由所述管道81供应给分离膜组件2。这意味着，组件擦洗气体供应装置16经由不同于培养物供应途径的通道直接地连接至分离膜组件2。此外，管道86连接至分离膜组件2的下部。如本文使用的术语“下部”可指，分离膜组件2的底部、或在距离底面1/3高度内的分离膜组件2部分。经由管道86，组件擦洗气体供应装置16可以自分离膜组件2的下部，注入气体。组件气体供应控制阀15置于管道86上，可以通过打开或关闭该阀，调节气体供应量。
管道擦洗气体供应装置18连接在循环泵8的下游，经由管道87连接至管道81。管道气体供应控制阀17在管道87上提供，可以通过打开或关闭该阀，调节气体供应量。管道擦洗气体供应装置18，从连接发酵罐I与分离膜组件2之间的管道81，供应气体。当管道81连接至分离膜组件2的上 部时，管道擦洗气体供应装置18可以自分离膜组件2的上部，供应气体。
泵上游管道擦洗气体供应装置20经由循环泵8上游的管道88连接至管道81。泵上游管道气体供应控制阀19在管道88上提供，并且可以通过打开或关闭该阀，调节气体供应量。泵上游管道擦洗气体供应装置20自分离膜组件2的下部供应气体，并且同时自连接发酵罐I与分离膜组件2的管道81供应气体。当管道81连接至分离膜组件2的上部时，泵上游管道擦洗气体供应装置20可以自分离膜组件2的上部供应气体。
从86到88的管道可以配备除菌装置或除菌滤器，以防止不想要的微生物进入发酵罐I。
如本文使用的术语“气体供应口 ”意指，气体由其释放到培养物或液体内的部分。气体供应口优选具有允许生成能够清洁膜表面的气泡的构造。生成的气泡可以是细小的气泡或大气泡。取决于分离膜的种类或条件例如气体扩散量，气泡的大小可以通过改变气体供应口的形状而改变。气体供应口可以通过提供具有气体排放孔的由聚氯乙烯或不锈钢制成的管道形成，或可以使用利用多孔橡胶、陶瓷或膜的曝气管(diffuser tube)。气体供应口的尺寸并无限制，只要它可以供应指定量的气体、且同时足够大到不引起发酵液的堵塞。气体供应口可以配备除菌滤器，以防止不想要的微生物进入发酵系统。[0097]在图1中，气体供应口在管道86至88之每个管道的两末端部分中近分离膜组件2侧的末端部分上提供。换言之，管道86至88是连接气体供应源到气体供应口的管道。
因此，在图1中，气体供应口可以在分离膜组件的下部提供。在经由泵将培养物从发酵罐供应到分离膜组件的构造中，它可以在发酵罐与泵之间或在泵与分离膜组件之间提供。
作为测量通过擦洗提供的气体的线速度的机械装置的一个例子，流量计91、92和93显示于图1中。流量计91安在管道86中，可以测量在管道86中经过的气体的流速。流量计91用于测量由组件擦洗气体供应装置16供应的气体的线速度。流量计92安在管道87中，可以测量在管道87中经过的气体的流速。流量计92用于测量由管道擦洗气体供应装置18供应的气体的线速度。流量计93安在管道88中，可以测量在管道88中经过的气体的流速。流量计93用于测量由泵上游管道擦洗气体供应装置20供应的气体的线速度。
2.分离膜组件
分离膜组件包括分离膜和用于容纳分离膜的容器。
待用于 分离膜组件的分离膜可以是有机膜或无机膜。分离膜并无限制，只要它是可用于过滤培养物且耐受气体清洁的膜即可。分离膜的例子包括由聚偏二氟乙烯、聚砜、聚醚砜、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯和陶瓷制成的膜。在这些中，由聚偏二氟乙烯制成的分离膜是特别优选的，因为它们抵抗发酵液引起的污染，可以容易清洁，并且对气体清洁具有优良的耐性。
分离膜优选是具有0.001 μ m或更大但小于10 μ m的平均孔径的孔的多孔膜，以便有效分离发酵液中的细胞。分离膜可以具有任何形状，并且可以使用平片膜或中空纤维膜，但相对于组件体积具有大膜面积的中空纤维膜是优选的。膜的平均孔径根据ASTM:F316-86中所述的方法(另一个名称:半干法)进行测定。通过这种半干法测定的是膜的最小孔层的平均孔径。
下述是当使用半干法时平均孔径的标准测量条件。
使用的液体:乙醇
测量温度:25°C
压力升高速率=IkPa/秒
平均孔径[μ m]由下式进行测定:
平均孔径[μπι]= (2860 X表面张力[mN/m] ) /半干气压[Pa]
乙醇在25°C 的表面张力是 21.97mN/m (The Chemical Society of Japan,KagakuBinran Kisohen Kaitei第3版,第11-82页,Maruzen, 1984),因此在本发明的标准测量条件下，平均孔径可以由下式确定:
平均孔径[μm] =62834.2/ (半干气压[Pa])。
外部压力型中空纤维膜的外径优选是0.5mm-3mm。当外径是0.5mm或更大时,在中空纤维膜中流动的滤过液的阻力可以被抑制至相对低的水平。另一方面，当外径是3mm或更小时，可以防止中空纤维膜因发酵液或气体引起的外部压力而发生坍塌。
内部压力型中空纤维膜的内径优选是0.5mm-3mm。当内径是0.5mm或更大时,在中空纤维膜中流动的发酵液的阻力可以被抑制至相对低的水平。另一方面，当内径是3_或更少时，因为可以确保膜表面积，可以阻止所用组件数目的增加。[0114]分离膜组件的容器由具有优良的耐压性的材料制成，并且它的形状并无限制，只要它能够允许发酵液供应给组件的第一侧即可。例子包括圆柱和多边形柱。考虑发酵液的流动和操作性质，容器优选具有圆柱形形状。
3.用于生产化学品的方法
根据本发明实施方案的生产方法是用于通过连续发酵生产化学品的方法，并且具有下述步骤(a)至(d):
(a)在发酵罐中培养培养物中的细胞，以发酵原料而制备化学品；
(b)通过使用分离膜组件，进行培养物的过滤；
(c)从培养物中分离含化学品的透过物，而将未透过的液体保留在发酵罐中，和
(d)从分离膜组件的下部和连接发酵罐与分离膜组件的管道中的至少一个供应气体，以便将分离膜组件中的气体线速度调整至0.15cm/s-70cm/s,同时向分离膜组件供应液体。
以下将对每一个步骤进行详细描述。注意，步骤(a)至(C)可以被称为连续细胞培养步骤或连续发酵步骤。
3-1.(a)制备化学品的步骤
[细胞]
如本文使用的“细胞”意指包括微生物、培养细胞、真核细胞和原核细胞的概念。微生物的例子包括在发酵工业中广泛使用的酵母，例如面包酵母；微生物，例如大肠杆菌、乳酸微生物和棒状微生物；丝状微生物；和放线菌。培养细胞是衍生自多细胞生物的细胞，其例子包括动物细胞和昆虫细胞。待用于`化学品生产的细胞可以是从天然环境中分离的细胞、或具有因突变或基因重组而改变的一些性质的细胞。
真核细胞在其中具有称为细胞核(核)的结构，明确区别于不具有细胞核(其在下文被简称为“核”)的原核生物。对于化学品的生产，在真核细胞中，酵母是优选使用的。适于化学品生产的酵母的例子包括属于酵母属(Saccharomyces)的酵母和属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母。
原核细胞在其中具有被称为“细胞核(核)”的结构、明确区别于具有细胞核(核)的真核细胞。对于化学品的生产，在原核细胞中，乳酸微生物是优选的。
取决于待制备的化学品、发酵原料、培养条件等，选择细胞。
产生L-氨基酸的细胞的例子包括广泛用于发酵工业中的微生物，例如大肠杆菌和棒状微生物。
更特别地，L-苏氨酸生产微生物的例子包括属于埃希氏杆菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属、短杆菌属和沙雷氏菌属的微生物。在这些中，大肠杆菌、雷氏普威登斯菌、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和粘质沙雷氏菌是特别优选的。
L-赖氨酸生产微生物的例子包括属于埃希氏杆菌属、棒状杆菌属和短杆菌属的微生物。在这些中，大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌是特别优选的。
作为L-谷氨酸生产微生物，谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌是优选的。
L-色氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is)、淀粉液化芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和大肠杆菌。
L-异亮氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和粘质沙雷氏菌。
L-谷氨酰胺生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和里加黄杆菌(Flavobacterium rigense)。
L-精氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
L-丙氨酸生产微生物的例子包括黄色短杆菌和氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)。
L-组氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
L-脯氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、Kurthia catenaforma、粘质沙雷氏菌和大肠杆菌。
L-苯丙氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和大肠杆菌。
L-天冬氨酸生产微生物的例子包括黄色短杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)、大肠杆菌和突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
L-酪氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和大肠杆菌。
作为L-甲硫氨酸生产微生物，谷氨酸棒状杆菌是优选的。
丝氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和氧化节杆菌。
L-丝氨酸生产微生物的例子包括嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)和乳糖发酵短杆菌。
L-缬氨酸生产微生物的例子包括乳糖发酵短杆菌、粘质沙雷氏菌和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。
L-亮氨酸生产微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌和粘质沙雷氏菌。
具有L-氨基酸生产能力的微生物可以从天然环境中分离、或具有由突变或基因重组而被修饰的一些性质。例子包括在JP-A-2-219582中描述的具有改善的L-苏氨酸生产力的雷氏普威登斯菌、和在JP-T-3-500486中描述的具有改善的L-丙氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌。
培养物中含有的L-氨基酸的分离和纯化可以使用常规已知方法，例如过滤、浓缩、蒸馏和结晶、及其组合，来进行。
对于乳酸的生产，酵母是优选的真核细胞，乳酸微生物是优选的原核细胞。在这些中，通过将编码乳酸脱氢酶的基因引入细胞内获得的酵母是优选的。特别地，显示出相对于葡萄糖消耗具有50%或更高的产率、更优选相对于葡萄糖消耗具有80%或更高的产率的乳酸微生物是优选的。术语“相对于葡萄糖消耗的产率”意指乳酸生产量相对于消耗的葡萄糖量的比值(重量比)。
乳酸微生物的例子包括具有合成乳酸的能力的野生型菌株，例如属于乳杆菌属(Lactobacillus)、芽抱杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、漫游球菌属(Vagococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、奇异菌属(Atopobium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、和芽抱乳杆菌属(Sporolactobacillus)的微生物。
可以选择和使用具有相对于葡萄糖消耗的乳酸高产率的乳酸微生物、或能够提供具有高光学纯度的乳酸的乳酸微生物。具有选择地生产D-乳酸的能力的乳酸微生物的例子包括属于芽孢乳杆菌属的D-乳酸生产微生物。优选的具体例子包括SporolactobacillusIaevolacticus和菊糖芽抱乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)。更优选的例子包括 Sporolactobacillus laevolacticus AT23492、ATCC23493、ATCC23494、ATCC23495、ATCC23496、ATCC223549、IAM12326、IAM12327、IAM12328、IAM12329、IAM12330、IAM12331、IAMl2379、DSM2315、DSM6477、DSM6510、DSM6511、DSM6763、DSM6764 和 DSM6771 和菊糖芽孢乳杆菌JCM6014。
具有相对于葡萄糖消耗的L-乳酸高产率的乳酸微生物的例子包括Lactobacillus yamanashiensis、动物乳杆菌(Lactobacillus animal is)> 倉泛动乳杆菌(Lactobacillus agilis)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)、和乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis.)。这些微生物可以被选择且用于生产L-乳酸。
对于D-乳酸的生产 ，还优选使用具有增强的D-乳酸脱氢酶(其在下文可以被称为“DLDH”)活性的野生型细胞。对于增强酶活性，可以采用常规已知的化学诱变。D-乳酸脱氢酶的酶活性也可以通过在细胞中掺入编码D-乳酸脱氢酶的基因得到增强。这意味着重组细胞也优选用于化学品的生产。
当D-乳酸使用重组细胞进行生产时，大肠杆菌和乳酸微生物作为原核细胞是优选的，而酵母作为真核细胞是优选的。在这些中，酵母是特别优选的。
作为编码D-乳酸脱氢酶的基因，衍生自植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidiIactici)、和左旋乳酸芽抱杆菌(Bacilluslaevolacticus)的基因是优选的，其中衍生自左旋乳酸芽孢杆菌的基因是更优选的。
当生产L-乳酸时，可以使用人为赋予乳酸生产能力的细胞或具有人为强化的乳酸生产能力的细胞。例如，通过将L-乳酸脱氢酶(其在下文可以被称为“L-LDH”)基因引入细胞内，可以获得被赋予了 L-乳酸生产能力的细胞或具有强化的1-乳酸生产能力的细胞。作为赋予细胞L-乳酸生产能力或增强这种能力的方法，可以使用常规已知的化学诱变方法。具有强化的L-乳酸生产能力的细胞也可以通过将L-LDH掺入细胞来获得。这意味着优选使用重组细胞。
当L-乳酸使用重组细胞产生时，原核细胞例如大肠杆菌和乳酸微生物和真核细胞例如酵母作为宿主细胞是优选的，其中酵母是特别优选的。在酵母中，属于酵母属的那些是优选的，其中酿酒酵母是更优选的。
L-LDH的序列并不限于具体序列，条件是它编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸转化成氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和L-乳酸的活性的蛋白质。例如，作为L-LDH，可以使用衍生自具有相对于葡萄糖消耗的高产率的乳酸微生物的基因、衍生自哺乳动物的基因、或衍生自蛙的基因。作为衍生自哺乳动物的基因，衍生自智人(Homo sapiens)的L-LDH是优选的。作为蛙衍生的基因，衍生自负子蟾科(Pipidae)的蛙的L-LDH是特别优选的。此外，在属于负子蟾科的蛙中，优选使用衍生自光滑爪蟾(XenopusIaevis)的 L-LDH0
人或蛙源的L-LDH包括突变型基因，例如遗传多态性基因和诱变基因。术语“遗传多态性基因”意指由于在基因上的天然诱变而具有部分改变的碱基序列的基因。术语“诱变基因”意指具有人为引入其中的突变的基因。诱变可以例如通过使用引入定点诱变的试剂盒(Mutan-K (Takara Bio的产品))的方法、或使用引入随机诱变的试剂盒(BD DiversifyPCR Random Mutagenesis (CL0NTECH的产品)的方法来实现。人或蛙源的L-LDH可以在其部分碱基序列中具有缺失或插入，只要它编码的蛋白质具有将NADH和丙酮酸转换成NAD+和L-乳酸的活性即可。
接下来将对丙酮酸的生产作出描述。生产丙酮酸的细胞的例子包括属于假单胞菌属、棒状杆菌属、埃希氏杆菌属和不动杆菌属(Acinetobacter)的微生物。微生物例如突光假单胞菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠杆菌是更优选的。还可以使用通过突变或遗传重组而具有部分修饰的性质的微生物。例如，还优选使用通过突变或缺失ATP酶基因(通过氧化磷酸化直接参与ATP生产)而获得的微生物。
霉菌和酵母也是优选的。例子包括属于酵母属、球拟酵母属(Toluropusis)Jg丝酵母属(Candida)和裂裙菌属(Schizophyllum)的霉菌和酵母。更优选地，属于酿酒酵母、Saccharomyces copsis、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、解脂假丝酵母(CandidaIipoIytiCa)、光滑球拟酵母(Toluropusis glabrata)和裂裙菌(Schizophyllum commune)的霉菌和酵母可以用于生·产丙酮酸。
培养物中含有的丙酮酸的分离和纯化可以通过使用过滤和阴离子交换柱的方法进行。例如，可以优选使用在JP-A-6-345683中描述的使用弱碱性离子交换剂的纯化方法。
接下来将对琥珀酸的生产作出描述。作为琥珀酸生产细胞，例如可以优选使用属于厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)和放杆菌属(Actinobacillus)的微生物。其具体例子包括在美国专利号5，143,833中描述的产琥拍酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)和由 James B.Mckinlay,等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.,71,6651-6656 (2005))公开的玻拍酸放杆菌(Actinobacillus succinogenes)。此外，还可以使用棒状微生物例如属于棒状杆菌属和短杆菌属的那些和大肠杆菌。在棒状微生物中，谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌是优选的。
可以使用具有通过遗传重组而改善的琥珀酸生产能力的微生物，提高琥珀酸生产力。此类微生物的例子包括在JP-A-2005-27533中描述的乳酸脱氢酶缺陷的黄色短杆菌MJ233AB-41 (FERM BP-1498)、在非专利文献I中描述的谷氨酸棒状杆菌、和在美国专利号5，770, 435中描述的已缺乏丙酮酸甲酸裂合酶和乳酸脱氢酶缺陷的大肠杆菌AFPlll菌株。[0165]接下来将对衣康酸的生产作出描述。作为可用于生产衣康酸的细胞，例如优选使用霉菌和酵母。属于曲霉菌属(Aspergillus)或黑粉菌属(Ustilago)的霉菌或属于假丝酵母属或红酵母属(Rhodotorula)的酵母是更优选的。在这些中，霉菌例如土曲霉(Aspergillus terreus)、衣康酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、狗牙根黑粉菌(Ustilago cynodontis)、和拉宾黑粉菌(Ustilagorabenhorstina)、和南极假丝酵母(Candia Antarctica)可以优选用于衣康酸的生产中。
接下来将对尸胺的生产作出描述。作为可用于生产尸胺的细胞，具有赖氨酸脱羧酶和/或赖氨酸尸胺反向转运蛋白的增强酶活性的微生物是优选的，其中掺入了编码赖氨酸脱羧酶和/或赖氨酸尸胺反向转运蛋白的基因的重组微生物是更优选的，并且其中掺入了一个或多个编码赖氨酸脱羧酶的基因的重组微生物是更优选的。
当生产尸胺时，重组微生物优选是大肠杆菌和棒状微生物，更优选具有赖氨酸脱羧酶活性且具有选自高丝氨酸营养缺陷型和S- (2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性中的至少一种性质的棒状微生物。更优选高丝氨酸脱氢酶活性缺陷的微生物，更加优选由于插入基因引起的突变而具有高丝氨酸脱氢酶活性缺陷的微生物。此外，棒状微生物优选是选自棒状杆菌属和短杆菌属的至少一个属，其中谷氨酸棒状杆菌是更优选的。
[培养基]
术语“发酵原料”(其在下文被简单地称为“原料”)是指，通过发酵由其获得目的化学品的物质。取决于细胞、培养条件和目的化学品产品，原料可以变化。
除了原料，待用于培养的培养基还含有能够加速细胞生长以顺利地产生目的发酵产物化学品的组分。如本文使用的术语“培养基”意指液体培养基，除非另有特别说明。培养基含有例如碳源、氮源和无机盐、以及根据需要，氨基酸和有机微量营养素例如维生素。
碳源的例子包括糖例如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和乳糖；含有这些糖的淀粉、淀粉水解产物、番薯糖蜜、甜菜糖蜜和蔗汁；甜菜糖蜜或蔗汁的提取物或浓缩物；糖浆(HiTest糖蜜)；通过纯化或结晶甜菜糖蜜或蔗汁获得的原料糖；通过纯化或结晶甜菜糖蜜或蔗汁获得的纯化糖；有机酸例如乙酸和延胡索酸；醇例如乙醇；和甘油。如本文使用的术语“糖”意指这样的碳水化合物，其为多元醇的第一氧化产物，具有一个醛基或酮基，并且分类为醛糖(即含醛的糖)和酮 糖(即含酮的糖)。
氮源的例子包括氨气、氨水、铵盐、尿素、硝酸盐、和辅助使用的其他有机氮源,例如油饼、大豆水解物、酪蛋白水解物、其他氨基酸、维生素、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉膏、肽例如蛋白胨、和各种发酵细胞及其水解物。
作为无机盐，可以根据需要使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
[培养物]
培养物含有培养基和在其中培养的细胞并且还可以含有由于培养而产生的化学品O
使用分离膜组件获得的滤液基本上不含有细胞，但为了描述方便，滤液也可以被称为“培养物”。
[培养]
在连续发酵装置100中，通过从发酵罐I中取出培养物，同时将发酵原料引入发酵罐I中，进行连续培养。[0179]可以在培养的最初阶段进行分批培养或补料分批培养以增加细胞浓度后，开始连续培养。这时，可以根据需要取出细胞。在化学品生产中，在细胞浓度增加后，接种高浓度的细胞，可以随着培养的开始，进行连续培养。
以下描述原料的引入。在图1中，由于在培养过程中培养基供应泵9的运作，培养基被引入发酵罐I中，并且由此引入原料。
在培养进行时，可以继续原料的引入而不停止，或原料的引入及其停止可以根据情况而转换。例如，如上所述，培养基引入的开始和停止可以基于水位传感器61的检测结果进行，或可以基于测量结果使用定时器(尚未描述)以规律的时间间隔进行。原料的自动和手动弓I入都包括在本发明的技术范围中。
接下来，对培养物的取出进行描述。为了达到有效生产力，培养物中的细胞浓度优选维持高浓度，只要该培养基环境对于增殖的微生物或培养细胞而言不造成不适当高比例的死亡即可。
在连续发酵装置100中，可以进行连续培养，通过使用循环系统取出培养物以回收化学品，同时保持细胞高浓度。通过使用循环系统取出培养物将在随后详细描述。
用于取出的通道以及连接至分离膜组件2的管道81可以连接至发酵罐1，并且培养物的取出可以借助于此取出通道进行。这时，可以取出培养物的液体部分以及细胞。
在培养过程中，可以将新鲜细胞引入发酵罐I内。细胞可以手动或自动引入。
在发酵罐中，原料的供 应和培养物取出的开始可以不必同时进行。原料的供应和培养物的取出可以相继或间歇地进行。
为了实施方便，通常优选在单个发酵罐中进行连续培养操作。然而，发酵罐的数目并无限制，只要采用的方法是连续发酵培养方法即可，其中在增殖细胞的同时形成产物。当发酵罐具有小容量时，可以使用多个发酵罐。在此情况，甚至可以通过在经由管道平行或串联连接的多个发酵罐中进行连续培养来获得高生产力。
在图1所示的连续发酵装置100中，通过搅拌装置4搅拌发酵装置I中的培养物，并且通过温度控制部件3、pH控制部件5、水位控制部件6、发酵罐气体供应装置21等，维持适于发酵的条件。
细胞的培养通常可以在pH33-2.培养物的过滤步骤(b)
过滤步骤使得能够从培养物连续回收化学品以及使得能够连续培养。更特别地，在图1中，培养物借助于循环泵8从发酵罐I中取出，流经管道81，且供应给分离膜组件2。培养物通过分离膜组件2分离成浓缩物和透过物。
图1所示的泵8对应于交叉流循环泵，并且交叉流过滤在分离膜组件2中进行。本发明并不限于此，盲端过滤可以用作膜过滤方法。然而，在连续发酵操作中，大量污物例如微生物附着至膜，为了有效去除这些污物，交叉流过滤是优选的。当采用交叉流过滤时，污物可以通过利用培养物的剪切力而去除。更高的清洁效率可以通过使用交叉流过滤和擦洗的组合来实现。[0193]过滤的驱动力可以使用虹吸管、利用在发酵罐与分离膜组件之间的水位差(水头差)获得，或使用通过交叉流循环泵而发生的跨膜压差来获得。作为过滤的驱动力，可以将吸引泵(suction pump)安在分离膜组件的滤液侧上。在图1所示的实施方案中，过滤泵11对应于吸引泵。
当使用交叉流循环泵时，跨膜压差可以通过吸引泵的压力加以控制。跨膜压差也可以通过引至分离膜组件的第一侧的气体或液体的压力加以控制。在分离膜组件的第一侧上的压力与在滤液侧上的压力之间的差异被检测为跨膜压差，基于此跨膜压差，可以进行泵等的控制。
在图1的构造中，培养物借助于循环泵8从发酵罐I供应到分离膜组件2。取决于通过压力差控制部件7检测的跨膜压差，控制循环泵8和过滤泵11的运作，并由此，合适地调节供应给分离膜组件2的培养物的量。
过滤可以连续或间歇地进行。当过滤间歇地进行时，每当连续进行过滤例如53-3.分离和循环步骤(C)
培养物中的细胞不渗透通过分离膜，因此已经通过分离膜组件2的浓缩物(已保留而未渗透通过分离膜的液体)具有增加的细胞浓度。因为浓缩物借助于管道82被送回发酵罐1，所以细胞保留在发酵罐I中。已通过分离膜组件2的分离膜的滤液借助于管道83排出到装置外。
因此，发酵罐I中维持高细胞浓度，并且化学品连续地自培养系统分离出来。
3-4.第一气体供应步骤(d)
第一气体供应步骤(d)在图1的构造中以擦洗清洁的方式进行。如上所述，在图1所示的构造中，擦洗气体借助于组件擦洗气体供应装置16、管道擦洗气体供应装置18、和泵上游管道擦洗气体供应装置20中的任何一个或多个供应。使用由此供应的气体，自分离膜组件中的分离膜上去除污物。
当擦洗开始时，组件气体供应控制阀15、管道气体供应控制阀17、和泵上游管道气体供应控制阀19中的至少一个通过控制装置28的控制或手动地打开。当擦洗终止时，类似地通过控制装置28的控制或通过手动关闭这些阀。
在擦洗过程中，将液体供应给分离膜组件。可以通过经由擦洗造成的清洁效果和经由分离膜组件中的液体流动造成的清洁效果的组合，产生高清洁效果。
特别地在图1所示的构造中，培养物在擦洗过程中从发酵罐I供应到分离膜组件
2。更特别，在供应 擦洗气体时，运作循环泵8。这时，可以终止过滤泵11，并且同时，可以关闭过滤阀12。过滤可以终止。可替代地，可以运作过滤泵11，并且同时，可以打开过滤阀12。
因此，可以通过源自培养物流动的剪切力和擦洗造成的清洁效应，产生高清洁效应。应当注意，在气体供应时供应给分离膜组件的液体并不限于培养物。除了培养物外，例如，还可以使用不抑制发酵的液体例如不含有细胞的培养基。
可用于擦洗的气体的例子包括借助于气瓶、鼓风机、压缩机或管道供应的压缩气体。这意味着，作为组件擦洗气体供应装置16、管道擦洗气体供应装置18、和泵上游管道擦洗气体供应装置20，可用的是能够压缩气体同时以预定压力供应该气体的装置、或能够在其中容纳压缩气体且以预定压力供应该气体的罐。
当需氧发酵在发酵罐I中进行时，通过擦洗供应的气体优选是含氧气体，并且它可以是纯氧。氧的浓度可以通过混合不会不利地影响发酵的气体，例如空气、氮、二氧化碳、甲烷或其混合气体，进行调节。为了增加氧的供应率，可以使用通过将氧加入空气、向培养物施加压力、提高搅拌速率、或提高充气速率而将氧浓度维持在21%或更大的手段。
另一方面，当厌氧发酵在发酵罐I中进行时，如果应减少氧的供应率，那么还可以供应空气与无氧气体例如二氧化碳、氮、甲烷或氩的混合物。
供应给分离膜组件的气体的线速度是每膜组件横截面积的气体供应量，可以根据下式(I)进行确定:
气体线速度(m/s) =气体供应量(m3/s) XlOO+ (分离膜组件的内部横截面积(m2)X (100 -膜充填比(％))...(I)
例如，分离膜组件配备具有内径R的圆柱形容器和容纳在容器中具有外径r的a片中空纤维膜，分离膜组件的内部横截面积是^记’膜充填比由^父一 +妒父^^彡表示。平片膜组件的膜充填比也可以基于容器的横截面积(即，组件的内部横截面积)、平片膜的横截面积和平片膜的数目进行计算。
在图1的构造中在控制装置28中，供应给分离膜组件2的气体的线速度可以通过将流量计91、92或93中测量的气体供应量填入上式(I)内进行确定。控制装置28可以控制阀15、17或19的打开或关闭，使得气体线速度落入上述范围内。
当擦洗气体仅借助于组件擦洗气体供应装置16供应时，气体供应速率基于流量计91的检测结果通过打 开或关闭阀15进行调节。当气体通过组件擦洗气体供应装置18供应时，气体供应速率基于流量计92的检测结果通过打开或关闭阀17进行调节。当气体由泵上游管道擦洗气体供应装置20供应时，气体供应速率基于流量计93的检测结果通过打开或关闭阀18进行调节。
气体线速度的调节可以使用控制装置28和自动阀自动控制，或可以使用手动阀手动控制。
在0.15cm/s或更大的气体线速度时，擦洗是有效的，并且由气体供应引起的培养物搅拌、氧供应等也是有效的。如上所述，连续发酵装置100配备阀22和排放口用于将空气从发酵罐I转移到外部。过大的气体线速度增加培养物的发泡量，并且趋于引起问题，例如由于泡沫从排放孔溢流而产生的污染、和由于泡沫造成的水位传感器对发酵罐I中的液体表面位置的错误检测，因此气体线速度优选是70cm/s或更少。
擦洗清洁对于去除附着至分离膜表面的污物例如细胞是有效的。擦洗清洁对于改善发酵效率也是有效的。通过擦洗供应的气体与培养物接触，在管道中流动(此时与发酵液接触)，与分离膜接触并振荡分离膜组件中的膜，从分离膜组件流动到发酵罐(此时在管道中与发酵液接触)，在发酵罐中被搅拌，随后上升到发酵液表面上方的空间以结束与发酵液的接触。另一方面，当气体直接供应给发酵罐时，在发酵罐中被搅拌的气体立即上升到发酵液表面上方的空间，结束与发酵液的接触。
对擦洗条件，即擦洗时机、频率、每次擦洗的时间、等，没有特别的限制。擦洗条件可以随多种条件而改变，例如跨膜压差、跨膜压差的变化、发酵罐中的压力、供应的气体种类、培养的细胞种类、生产的化学品种类、和原料种类。例如，擦洗可以在先前擦洗完成后以预定时间间隔相继进行，或每当培养物向分离膜组件2的供应量，即过滤量或跨膜压差达到预定值时进行。连续发酵装置100可以配备测量设备例如定时器(未举例说明)，以便确定擦洗的开始和终止时间。
例如，擦洗清洁频率优选为0.1次/小时至360次/小时、更优选12次/小时至120次/小时。360次/小时或更少的擦洗清洁频率几乎不会引起诸如由培养物发沫造成的不便、损害滤膜、和操作成本增加等问题。另一方面，0.1次/小时或更多的擦洗清洁频率使得能够达到足够的清洁效应，并且因为发酵罐中的压力可以维持足够高，可以阻止各种微生物的混合。
根据擦洗清洁频率、跨膜压差、跨膜压差的变化、发酵罐中的压力和化学品的生产率，可以确定擦洗清洁时间/次。
用于间歇擦洗清洁的清洁时间是5秒/次至I小时/次，更优选10秒/次至600秒/次。在一小时内的擦洗清洁时间可以阻止出现诸如滤膜损害或干燥和操作成本增加的问题。5秒或更多的擦洗清洁时间可以达到足够的清洁效应，并且同时由于可以抑制发酵罐中压力的降低，可以防止发酵罐中被不想要的微生物污染。应当注意，气体线速度可以随擦洗清洁时间而调节。
3-5.第二气体供应步骤
除了步骤(d)外，化学品的生产方法可以进一步具有将气体供应给发酵罐的步骤。在图1的构造中，可以使用发酵罐气体供应装置21和搅拌装置4，实施向发酵罐I供应气体的这个步骤。
特别地，当擦洗清洁间歇地进行时，在停止供应用于擦洗的气体时，微生物生长所需的气体供应量可以通过将 气体供应给发酵罐而维持。即，当擦洗在连续发酵装置100中间歇地进行时，控制装置28工作，使得在终止擦洗时借助于另一机制例如发酵罐气体供应装置21和搅拌器4对发酵罐I的气体供应速率增加超过在进行擦洗时借助于该机制对发酵罐I的气体供应速率。取决于发酵条件等，可以改变该供应速率的增加程度。
3-6.回洗
本发明化学品的生产方法进一步具有分离膜组件的分离膜的回洗步骤。在图1的构造中，清洁管道84连接至分离膜组件2的第二侧，使得清洁液可以借助于清洁泵13引入分离膜组件2内。
当进行回洗时，停止过滤以阻止清洁液进入保留滤液的滤液槽。换言之，关闭过滤阀12，并且同时，停止过滤泵11。在这个状态下，打开清洁阀14，并且清洁泵13开始运作，通过其进行回洗。
当停止回洗时，关闭清洁阀14，并且停止清洁泵13。在这个状态下，打开过滤阀12，并且过滤泵11开始运作，通过其进行过滤。
此控制可以借助于控制装置28进行。连续发酵装置100可以配备测量设备例如定时器(未举例说明)，以确定回洗的开始时间或终止时间。
用于回洗的清洁液的例子包括对发酵没有不利影响并且同时能够清洁分离膜的液体，例如水、滤液、发酵培养基、加入发酵培养基的一些组分、和盐酸、硫酸、硝酸、氢氧化钠、氢氧化钙或次氯酸钠的水溶液、及其混合物。
4.化学品
可通过本文描述的生产方法获得的化学品是在培养物中由细胞产生的物质。化学品的例子包括在发酵工业中产生的物质团，例如醇、有机酸、二胺、氨基酸和核酸。该生产方法还可以应用于物质例如酶、抗生素和重组蛋白质的生产。
醇的例子包括乙醇、1，3- 丁二醇、1，4- 丁二醇和甘油。
有机酸的例子包括乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、氨基酸和柠檬酸。二胺的例子包括尸胺，而核酸的例子包括肌苷、鸟苷和胞苷。
氨基酸的例子包括L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸。在这些中，L-苏氨酸、L-赖氨酸和L-谷氨酸是特别优选的。
实施例
本发明将在下文中通过实施例更具体地描述。然而，应当记住，本发明并不限于这些实施例或受这些实施例限制。除了与擦洗清洁相关的构造外，在下述实施例中使用的连续发酵装置具有类似于图1的示意性构造。在下述实施例中，L-苏氨酸和L-赖氨酸作为化学品通过连续发酵产生。
[A.L-苏氨酸浓度的测量方法]
使用下述方法，测量在培养物中含有的L-苏氨酸浓度。在称重25 μ L含有待测量的L-苏氨酸的培养物后，加入150 μ I NaHCO3 (75mM)和作为内部标准的25 μ I L-甲硫氨酸(2g/L)。向所得到的溶液中加入900 μ I乙醇和150 μ 10.2Μ 二硝基氟苯(DFNB)，随后混合。允许所得到的混合物在37°C静置一小时，并且随后在下述条件下实施HPLC分析。
柱:CAPCELLPAKC18TYPE SG120 (Shiseido 的产品)
移动相:0.1% (w/v) H3PO4:乙腈=7:3 (流速:1.2mL/ 分钟)
检测方法:UV(360nm)
温度:23°C
使用具有已知浓度的L-苏氨酸作为标准品，通过在横坐标上标绘L-苏氨酸浓度和在纵坐标上标绘(L-苏氨酸面积)/ (L-甲硫氨酸(内部标准)面积)比值，通过分析，绘制校准曲线。
[B.L-赖氨酸浓度的测量方法]
使用下述方法，测量在培养物中含有的L-赖氨酸浓度。在称重25 μ L含有待测量的L-赖氨酸的培养物后，加入400 μ I NaHCO3 (75mM)和作为内部标准的25 μ 11，4- 丁二醇(2g/L)。向所得到的溶液中加入150 μ 10.2MDFNB,并且使所得到的混合物在37°C反应一小时。
将反应混合物(50 μ I)溶解于ImL乙腈中，以10，OOOrpm离心所得到的溶液5分钟获得上清液，使用HPLC在下述条件下分析10 μ I该上清液。
柱:CAPCELLPAKC18TYPE SG120 (Shiseido 的产品)
移动相:(0.1% (w/w)磷酸水溶液):乙腈=45:55 (流速:lmL/分钟)[0248]检测方法:UV(360nm)
温度:23°C
使用具有已知浓度的L-赖氨酸作为标准品,在横坐标上标绘L-赖氨酸浓度和在纵坐标上标绘(L-赖氨酸面积)/ (I, 4- 丁二醇(内部标准)面积)比值，通过分析，绘制校准曲线。
[C.L-乳酸浓度的测量方法]
使用下述方法，测量在培养物中含有的L-乳酸浓度。通过称重100 μ L含有L-乳酸的培养物且通过使用HPLC在下述条件下测量乳酸的量，加以证实。
柱:Shim-PackSPR-H (Shimadzu 的产品)
移动相:5mM对甲苯磺酸(流速:0.8mL/分钟)
反应液:5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris,0.1mM EDTA.2Na (流速:0.8mL/ 分钟)
检测方法:导电性
温度:45°C。
使用具有已知浓度的L-乳酸作为标准品，在横坐标上标绘L-乳酸浓度和在纵坐标上标绘检测峰面积，通过进行分析而绘制校准曲线。
[D.葡萄糖浓度的测量方法]`[0260]“Glucose test Wako C，，(商标)(Wako Pure Chemical Industries 的产品)用于测量葡萄糖的浓度。
通过测量适当稀释的发酵液在0D600nm处的吸光度，测定微生物浓度。
[E.中空纤维组件的制造]
拆开由Toray Industries制造的聚偏二氟乙烯中空纤维压力型组件“HFS1020”，仅切下未用粘合剂固定的部分。将由此切下的聚偏二氟乙烯中空纤维膜放入容器中，以将中空纤维膜组件制备为分离膜组件。使用的容器由聚碳酸酯树脂制成。由此制备的中空纤维膜组件具有0.02L的容量和200cm2的有效过滤面积。在所有实施例和比较实施例中，采用此相同类型的组件。
[F.用于连续发酵制备L-赖氨酸的基因重组菌株的制备]
作为具有L-赖氨酸生产能力的微生物，制备了高丝氨酸脱氢酶(HOM)基因被破坏的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株(其在下文缩写为“ATCC13032菌株”)。更具体而言，根据在JP-A-2008-212138中描述的方法，进行遗传修饰。由此获得的菌株被称为谷氨酸棒状杆菌Λ HOM菌株(其在下文缩写为“ Λ HOM菌株”)。使用Λ HOM菌株，如下所述进行L-赖氨酸的连续发酵。
[G.用于连续发酵制备L-乳酸的基因重组菌株的制备]
制备具有引入roCl基因座、SEDl基因座和TDH3基因座内的光滑爪蟾来源的Idh基因的酵母。Idh基因具有在SEQ ID NO:1中描述的碱基序列。使用PCR进行光滑爪蟾的Idh基因的克隆。在PCR中，噬菌粒DNA用作模板，该模板使用源自光滑爪蟾肾的cDNA文库(STRATAGENE的产品)和相随的技术方案进行制备。
在PCR中，使用KOD-Plus聚合酶(Toyobo的产品)。使用与之一起提供的反应缓冲液、dNTP混合物等。
PCR反应溶液是50 μ I/样品，并且制备以含有50ng/样品的根据制造商方案制备的噬菌粒DNA、50pmol/样品的引物和I单位/样品的KOD-PIus聚合酶。通过使用PCR扩增设备iCycler (BIO-RAD的产品)在94°C 5分钟热变性(热变性)反应溶液，随后为30个处理循环，包括在94°C热变性30秒、在55°C引物退火30秒、和在68°C互补链延伸I分钟。随后将反应溶液冷却至4°C。制备用于基因扩增的引物(SEQ ID NOS:2和3)，使得Sal1-识别序列和NotI识别序列分别加至5’ -末端和3’ -末端。
将PCR扩增片段纯化，用T4多核苷酸激酶(TAKARA BIO INC.的产品)在其末端上磷酸化，并且随后连接至PUC118载体(其已用限制性酶HincII消化，并且已对消化末端实施去磷酸化处理)。使用DNA连接试剂盒Ver.2 (TAKARA BIO INC.的产品)进行连接。将大肠杆菌DH5a的感受态细胞(TAKARA BIO INC.的产品)用连接溶液转化，在含有50 μ g/mL抗生素氨苄青霉素的LB板上种植，并且培养过夜。通过使用小量制备法，从由此生长的菌落中收集质粒DNAs，并且用限制性酶SalI和NotI消化。随后，选择其中插入了源自光滑爪蟾的Idh基因的质粒。上述系列操作完全根据制造商的方案执行。
用限制性酶SalI和NotI消化插入了光滑爪蟾来源的Idh基因的pUC118载体，并且使用1%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。随后，根据常规方法，纯化含有光滑爪蟾Idh基因的片段。
将由此获得的含Idh基因的片段连接至图14中所示的表达载体pTRSll的XhoI/NotI消化位点。质粒DNA以与上文描述相似的方式回收，并且用限制性酶XhoI和NotI消化，以选择其中引入了光滑爪蟾Idh基因的表达载体。以此方式制备的引入了光滑爪蟾Idh基因的表达载体在下文被称为“PTRS102”。
使用PTRS102作为扩增模板，使用寡核苷酸(SEQ ID NOS:4和5)作为引物组，执行PCR以扩增含有光滑爪蟾Idh基因和TDH3终止序列的1.3kb PCR片段。伴随地，SEQ IDNO:4的设计使得加入了对应于roCl基因起始密码子上游60bp的序列。
接下来，用质粒pRS424 作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:6和7)作为引物组，执行PCR以扩增含有TRPl基因作为酵母选择标记的1.2kb PCR片段。伴随地，SEQ IDNO:7的设计使得加入了对应于roCl基因终止密码子下游60bp的序列。
使用1%琼脂糖凝胶电泳分离因此获得的DNA片段，并且以常规方式纯化。使用所得到的1.3kb片段和1.2kb片段的混合物作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:4和7)作为引物组，执行PCR。结果，扩增了约2.5kb的PCR片段。在所得到的片段中，对应于PDCl基因上游和下游60bp的序列分别加至5’ -末端和3’ -末端，并且光滑爪蟾来源的Idh基因、TDH3终止子和TRPl基因彼此连接。
使用1%琼脂糖凝胶电泳分离所得到的PCR片段，以常规方式纯化，转化到酿酒酵母NBRC10505菌株内，并且在无色氨酸的培养基上培养。由此，选择了在染色体上在I3DCl基因启动子下游位点引入了光滑爪蟾Idh基因的转化株。
如下所述证实，由此获得的转化株是在染色体上于roci基因启动子下游引入了光滑爪蟾来源的Idh基因的酵母。首先，使用基因组DNA提取试剂盒“Dr.GenTLE”(TAKARABIO INC.的产品)，制备转化株的基因组DNA。使用所得到的基因组DNA作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:7和8)作为引物组，执行PCR以获得约2.8kb的扩增DNA片段。结果，证实由此获得的转化株是上述酵母。当使用非转化株时，使用上述PCR可以获得约2.1kb的扩增DNA片段。[0278]在染色体上roci基因启动子下游位点上引入了光滑爪蟾来源的Idh基因的转化株在下文被称为“B2菌株”。roci基因的上游和下游序列可以得自酵母属基因组数据库(URL:http://ww.yeastgenome.0rg/)。
随后，将在SEQ ID NO:1中描述的Idh基因引入B2菌株的SEDl基因座内。具体地说，使用在参考实施例1中制备的PTRS102作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:5和9)作为引物组，执行PCR以扩增含有光滑爪蟾来源的Idh基因和TDH3终止序列的1.3kbPCR片段。设计SEQ ID NO:9，使得加入对应于SEDl基因起始密码子上游60bp的序列。
接下来，使用质粒PRS423作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:6和10)作为引物组，执行PCR以扩增含有HIS3基因(B卩，酵母选择标记)的约1.3kb PCR片段。设计SEQID NO:10，使得加入对应于SEDl基因终止密码子下游60bp的序列。
使用1%琼脂糖凝胶电泳分离因此获得的DNA片段，并且以常规方式纯化。使用由此获得的约1.3kb的两个片段的混合物作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:9和10)作为引物组，执行PCR以获得约2.6kb的PCR片段，其中对应于SEDl基因上游和下游60bp的序列分别加至5’ -末端和3’ -末端，并且光滑爪蟾来源的Idh基因、TDH3终止子和HIS3基因彼此连接。
使用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR片段，以常规方式纯化，转化到B2菌株内，并且在无组氨酸的培养基上培养。由此，选择了在染色体上SEDl基因启动子下游位点上具有引入的光滑爪蟾Idh基因的转化株。
如下所述证实，由此获得的转化株是在染色体上SEDl基因启动子下游位点上具有引入的光滑爪蟾Idh基因的酵母。首先，使用基因组DNA提取试剂盒“Dr.GenTLE”(TAKARABIO INC.的产品)，制备转化株的基因组DNA。使用所得到的基因组DNA作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:11和12)作为引物组，执行PCR以获得约2.9kb的扩增DNA片段。结果，证实由此获得的转化株是具有引入的上述基因的酵母。当使用非转化株时，使用上述PCR获得约1.4kb的扩增DNA片段。在染色体上SEDl基因启动子下游的位点上具有引入的光滑爪蟾来源的Idh基因的转化株在下文被称为“SU014-1菌株”。
接下来，将在SEQ ID NO:1中描述的Idh基因引入SU014-1的TDH3基因座内。通过将pTRS102的TDH3终止子替换为ADHl终止子，制备质粒，以实现在TDH3基因座内的引入。
首先，通过使用基因组DNA提取试剂盒“Dr.GenTLE” (TAKARA BIO INC.的产品)，由NBRC10505菌株制备基因组DNA。使用提取的基因组DNA作为模板，以寡核苷酸(SEQ IDNOS:13和14)作为引物组，执行PCR，通过其扩增了含有ADHl启动子的PCR片段。向SEQID NO:13的5’ -末端加入NotI识别序列，并且向SEQ ID NO:14的3’ -末端加入HindIII识别序列。
将PCR扩增的片段纯化，用T4多核苷酸激酶(TAKARA BIO INC.的产品)在其末端上磷酸化，并且随后连接至PUC118载体(其已用限制性酶HincII消化，并且已对消化末端实施去磷酸化处理)。将连接溶液转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞(TAKARA BIO INC.的产品)内，随后在含有50 μ g/mL氨苄青霉素(其为抗生素)的LB板上种植且培养。通过使用小量制备程序从因此生长的菌落中回收质粒DNA，并且用限制性酶NotI和HindIII消化，以选择具有ADHl终止子插入其中的质粒。因此制备的质粒被称为“pUC118-ADHlt”。[0287]接下来，用限制性酶NotI和HindIII消化pUC118_ADHlt ;使用1%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段；并且以常规方式纯化含有ADHl终止子的片段。含有ADHl终止子的所得片段连接至PTRS102中的Notl/Hindlll消化位点。以与上文描述相似的方式回收质粒DNA，随后用限制性酶NotI和HindIII消化，以选择具有ADHl终止子代替TDH3终止子的质粒。因此制备的质粒下文被称为“PTRS150”。
使用PTRS150作为模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:15和16)作为引物组，执行PCR。通过PCR，扩增含有蛙L-1dh基因和ADHl终止序列的1.3kb PCR片段。设计SEQ ID NO:16的引物，使得加入对应于TDH3基因起始密码子上游60bp的序列。
接下来，用质粒pRS426作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:17和18)作为引物组，执行PCR。通过PCR，扩增含有URA3基因(即，酵母选择标记)的1.2kb PCR片段。设计SEQ ID NO:18的引物，使得加入对应于TDH3基因终止密码子下游60bp的序列。
使用1%琼脂糖凝胶电泳分离因此获得的这些DNA片段，并且以常规方式纯化。使用所得到的1.3kb片段和1.2kb片段的混合物作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:16和18)作为引物组，执行PCR。以此方式，扩增约2.5kb的PCR片段，其中蛙源L-1dh基因、ADHl终止子和URA基因已彼此连接。
使用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR片段，并且以常规方式纯化。随后，将因此获得的片段转化到SU014-1菌株内，随后在无尿嘧啶的培养基上培养。以此方式，选择了具有如下染色体的转化株，在该染色体中蛙源L-1dh基因已引入在TDH3基因启动子下游位点上。
如下所述证实，因此获得的转化株是已在染色体上TDH3基因启动子下游的位点上引入了蛙L-1dh基因的酵母。首先，使用基因组DNA提取试剂盒“Dr.GenTLE” (TAKARABIO INC.的产品)，制备转化株的基因组DNA。使用所得到的基因组DNA作为扩增模板，以寡核苷酸(SEQ ID NOS:19和20)作为引物组，执行PCR。当通过上述PCR获得约2.8kb的扩增DNA片段时，转化株是上述酵母。当使用非转化株时，使用上述PCR获得约2.1kb的扩增DNA片段。在染色体上·TDH3基因启动子下游的位点上引入了蛙L-1dh基因的转化株在下文被称为“SU014-1I菌株”。
接下来，通过组合在pdc5基因中具有温度敏感性突变的酵母SW015菌株和上文获得的SU014-1I菌株，获得二倍体细胞。SW015菌株在W02007/097260中描述。在子囊形成培养基上形成二倍体细胞的子囊。子囊各自借助于显微操作器解剖，以分别获得单倍体细胞。
检查因此获得的单倍体细胞的营养缺陷型。从获得的单倍体细胞中选择显示出MATa交配型的菌株，并且从具有插入pdcl基因座、sedl基因座和tdh3基因座内的光滑爪蟾Idh基因且在pdc5基因中具有温度敏感性突变(不能在34°C生长)的菌株中选择ΜΑΤ α交配型。在因此获得的酵母菌株中，显示出MATa交配型的菌株和显示出MATa交配型的菌株在下文分别被称为“SU014-8A菌株”和“SU014-3B菌株”。
将因此获得的SU014-8A菌株和SU014-3B菌株组合，以获得具有营养缺陷型的营养缺陷二倍体菌株。所得到的菌株被称为“SU014”。
[H.通过连续发酵生产L-苏氨酸]
(比较实施例1)
通过操作图1中所示的连续发酵装置，进行L-苏氨酸的连续发酵。作为分离膜，使用参考实施例2中制造的中空纤维膜。下文是下述实施例和比较实施例共同的L-苏氨酸连续发酵的操作条件。
共同条件
微生物:雷氏普威登斯菌SGR588-77菌株(FERMP-10528)
培养基:L_苏氨酸发酵培养基(表I)
发酵液的体积:3.0 (L)
中空纤维膜MD体积:0.02 (L)
温度:37(°C)
发酵罐搅拌速率:350 (rpm)
灭菌:对发酵罐，包括中空纤维膜组件和使用的培养基，都在高压灭菌器中在121°C实施20分钟的高压(2个大气压)蒸汽灭菌。
pH调整:用28%氨水溶液调整至pH7
循环泵流速:3L/分钟
过滤速率:170ml/小时(固定的)
[表 I]用于雷氏普威登斯菌的L-苏氨酸发酵培养基
权利要求
1.一种用于通过连续发酵生产化学品的方法，所述方法包括: Ca)在发酵罐中培养培养物中的细胞，以发酵原料而产生化学品； (b)通过使用分离膜组件，进行所述培养物的过滤； (C)从培养物中分离含化学品的透过物，而将未透过的液体保留在发酵罐中，和 (d)从分离膜组件的下部和连接发酵罐与分离膜组件之间的管道中的至少一个，供应气体，以调整分离膜组件中的气体线速度至0.15cm/s-70cm/s,同时向分离膜组件供应液体。
2.根据权利要求
1的用于生产化学品的方法，其中在步骤(d)中，所述气体含有氧。
3.根据权利要求
2的用于生产化学品的方法，除了步骤(d)外，其进一步包括向发酵罐供应气体的步骤(e)，其中: 在步骤(d)中气体进行间歇地供应，且 在步骤(d)中不供应气体时，与步骤(d)中供应气体时相比，步骤(e)中的气体供应速率增加。
4.根据权利要求
1至3之任一项的用于生产化学品的方法，其中步骤(b)中的过滤间歇地进行。
5.根据权利要求
1至4之任一项的用于生产化学品的方法，其中细胞是微生物。
6.根据权利要求
5的用于生产化学品的方法，其中所述微生物是属于埃希氏杆菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属、短杆菌属和沙雷氏菌属之任一的微生物。·
7.根据权利要求
6的用于生产化学品的方法，其中所述微生物是大肠杆菌、雷氏普威登斯菌、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、和粘质沙雷氏菌之任一。
8.根据权利要求
1至4之任一项的用于生产化学品的方法，其中细胞是酵母。
9.根据权利要求
1至8之任一项的用于生产化学品的方法，其中化学品是氨基酸。
10.根据权利要求
9的用于生产化学品的方法，其中所述氨基酸是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸或L-亮氨酸。
11.根据权利要求
1至8之任一项的用于生产化学品的方法，其中化学品是有机酸。
12.根据权利要求
11的用于生产化学品的方法，其中所述化学品是乳酸。
13.根据权利要求
1至8之任一项的用于生产化学品的方法，其中所述化学品是尸胺。
专利摘要
本发明提供用于通过连续发酵生产化学品的方法，该方法包括(a)在发酵罐中培养培养物中的细胞，以发酵原料而产生化学品；(b)通过使用分离膜组件进行培养物的过滤；(c)从培养物中分离含化学品的透过物，而将未透过的液体保留在发酵罐中，和(d)从分离膜组件的下部和连接发酵罐与分离膜组件之间的管道中的至少一个，供应气体，以将分离膜组件中的气体线速度调整至0.15cm/s-70cm/s，同时向分离膜组件供应液体。
文档编号C12P13/00GKCN103249840SQ201180058917
公开日2013年8月14日 申请日期2011年12月8日
发明者金森智子, 千智勋, 耳冢孝, 武内纪浩, 西田诚, 田中祐之 申请人:东丽株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan