专利名称:一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种以革兰氏阴性菌外膜孔蛋白为靶点筛选药物的方法，尤其是涉及一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法。
背景技术：
当前，人们对病原细菌的控制主要是通过几种不同杀菌机制的抗生素药物来进行的，目前常用抗生素的杀菌作用机制主要有以下4种(I)抑制细菌细胞壁的合成抑制细胞壁的合成会导致细菌细胞破裂死亡，以这种方式作用的抗菌药物包括青霉素类和头孢菌素类。(2)干扰蛋白质的合成干扰蛋白质的合成意味着细胞存活所必需的酶不能被合成。干扰蛋白质合成的抗生素包括福霉素类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素。(3)抑制核酸的转录和复制抑制核酸的功能阻止了细胞分裂和/或所需酶的合成。以这种方式作用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶。(4)与细胞膜相互作用一些抗菌素与细胞的细胞膜相互作用而影响膜的渗透性，这对细胞具有致命的作用。以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌素。
由于抗生素的大规模应用和不合理的临床使用，而使得细菌产生耐药性，不仅导致药物失去抗菌作用，甚至致使“超级细菌”的出现，这使得感染性疾病治疗及疫情控制面临困境，已在全球范围成为严重的公共卫生危机。但因具新型抗菌机制的药物的研发日益困难，且针对已有抗菌机制开发的药物的生命周期大大缩短等原因，近年来罕有新型抗菌药物上市。因此，本领域非常有必要寻找与细菌介导的感染性疾病相关的新的药物作用靶点和开发新的药物或研制新型疫苗，为更有效地控制和治疗感染性疾病提供新的途径。
已知大多数感染性疾病及历史上大规模爆发的传染病都是由革兰氏阴性菌引起，研究认为这主要与其复杂的外膜有关。革兰氏阴性菌外膜主要由外膜孔蛋白、脂质及脂多糖等成分组成，其中外膜孔蛋白为主要成分，约占50%，主要由具β_桶状结构的孔蛋白(porin)和脂蛋白两类蛋白组成，外膜孔蛋白是革兰氏阴性菌特有的成分，直接与外环境接触，不仅在维持外膜结构、细胞表面识别、信号转导和物质转运(尤其是铁的运输)等生理功能方面起重要作用，而且更为重要的是，某些外膜孔蛋白还与病原菌的毒力有关，且研究认为病原菌的毒力与机体内铁的调控有关。铁是病原菌感染发病和机体的免疫防御这一相互作用过程中的关键调控因子，病原菌经长期进化已发展了多种机制从宿主体内夺取铁来增强其毒力和致病性，同时损伤机体的免疫防御能力，是病原菌感染以及致病的关键因素之
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中国专利公开号CN1699573A，
公开日2005年11月23日，公开了一种溶藻酸弧菌外膜孔蛋白W基因与制备方法及其应用，提供一种新的溶藻酸弧菌ompW蛋白质活性的多肽的核苷酸序列和溶藻酸弧菌ompW蛋白的氨基酸序列及其利用重组技术制备溶藻酸弧菌ompW基因的方法，提供溶藻酸弧菌和副溶血弧菌ompW蛋白和编码序列的应用，其步骤为将编码具有溶藻酸弧菌ompW蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成溶藻酸ompW蛋白表达载体,将表达载体转入宿主细胞,形成溶藻酸弧菌ompW蛋白的重组细胞，培养重组细胞，分离。不足之处是用于筛选药物可靠性差、筛选药物效率低，不适用于作为靶点筛选细菌介导的感染性疾病的新药物。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的药物筛选方法可靠性差、效率低、不适用于作为靶点筛选细菌介导的感染性疾病的新药物的不足，提供了一种操作简单、筛选可靠性好、效率高的以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为新型靶点的筛选药物的方法，用于筛选细菌介导的感染性疾病的新药物。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法，所述方法包括下列步骤
(1)基因的克隆及重组载体的构建；
(2)重组载体的转化、筛选诱导表达得外膜孔蛋白OmpW高表达菌；
(3)以高表达菌的外膜孔蛋白OmpW为靶点进行细胞水平的药物筛选，用5(Γ80μg/ml的待筛选化合物作用于高表达菌，培养O. 5-lh，采用Western-blot分析检测高表达菌外膜孔蛋白OmpW的表达量变化，Ompff的表达量降低，待筛选化合物具有药物作用，Ompff的表达量不变或增加，待筛选化合物不具有药物作用。
作为优选，步骤(I)中利用大肠杆菌K12的ompW基因序列设计合成引物，引物合成后，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板扩增基因0耶1经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定并回收目的基因，利用T4-DNA连接酶将目的基因与载体连接得重组载体。从NCBI数据库中查找大肠杆菌K12的ompW基因序列(序列号No. _415772),然后根据pLLP-OmPA载体和pET_28a载体分别设计引物对ompW-pL-F/ompW-pL-R和引物对ompW-pE-F/ompW-pE-R,见表I。
作为优选,所述载体为质粒或粘粒载体。
作为优选，步骤(2)中筛选是指采用氨苄青霉素抗性平板筛选外膜孔蛋白OmpW表达量高的菌株，诱导表达是指将外膜孔蛋白OmpW表达量高的菌株培养至对数生长期，加入IPTG诱导得到相应的外膜孔蛋白OmpW高表达菌。
作为优选，诱导剂IPTG的浓度为0. 3^0. 4mmol/l。
本发明的有益效果是(1)本发明确立了以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点的药物筛选方法，通过高表达菌外膜孔蛋白OmpW的表达量变化来判断待测化合物是否具有药物特性，操作简单，可靠性高；(2)本发明通过克隆基因和构件重组载体，然后经过转化及诱导表达得到外膜孔蛋白OmpW高表达量高的高表达菌，待测化合物作用于高表达菌来进行细胞水平的药物筛选，灵敏度高，效率高。
图1是正常菌及经吞噬细胞处理后外膜孔蛋白样品的SDS-PAGE (上部分)及以Ompff抗体为一抗的Western-blot分析图谱(下部分)；
图2是正常菌及经血浆处理后外膜孔蛋白样品的SDS-PAGE (上部分)及以OmpW抗体为一抗的Western-blot分析图谱(下部分)；
图3是以OmpW抗血清为一抗对经血浆被补体消化的菌外膜孔蛋白样品进行Western-blot 分析图谱；图4是正常菌与补体灭活的血浆孵育Ih后的菌的外膜孔蛋白以OmpW抗体为一抗的ffestern-blot 分析图谱；
图5是正常菌及OmpW基因敲除菌(Nompimi SDS-PAGE及Western-blot分析验证图
谱；
图6是正常菌及OmpW基因敲除菌(komPW、的生长曲线图；
图7是THP-1细胞分别与FITC标记的野生型及OmpW基因敲除菌(Λο耶/f)孵育Ih后细胞观察图；
图8是荧光亮点计数及统计分析图；
图9是小鼠巨噬细胞分别与FITC标记的野生型及OmpW基因敲除菌(&ompW、孵育Ih后细胞观察图；
图10是荧光亮点计数及统计分析；
图11是小鼠巨噬细胞与野生型及OmpW基因敲除菌(进行孵育Ih后裂解细胞的裂解液涂平板示意图；
图12是平板计数及统计分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1 :
以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法
(1)基因的克隆及重组载体的构建以质粒为载体，引物合成后，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板扩增基因omPW,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定并回收目的基因，利用T4-DNA连接酶将目的基因与载体连接；
(2)重组载体的转化及诱导表达得高表达菌采用氨苄青霉素抗性平板筛选外膜孔蛋白表达量高的菌株，然后培养至对数期，加入O. 3mmol/l的IPTG诱导得到相应的外膜孔蛋白OmpW闻表达囷；
(3)进行以高表达菌的外膜孔蛋白OmpW为靶点的药物的筛选，用50μ g/ml的待筛选化合物作用于高表达菌，培养O. 5h，采用Western-blot分析检测高表达细胞OmpW的表达量变化，Ompff的表达量降低，待筛选化合物具有药物作用，Ompff的表达量不变或增加，待筛选化合物不具有药物作用。
实施例2:
以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法
(1)基因的克隆及重组载体的构建以粘粒为载体，引物合成后，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板扩增基因omPW,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定并回收目的基因，利用T4-DNA连接酶将目的基因与载体连接；
(2)重组载体的转化及诱导表达得高表达菌采用氨苄青霉素抗性平板筛选外膜孔蛋白表达量高的菌株，然后培养至对数期，加入O. 5mmol/l的IPTG诱导得到相应的外膜孔蛋白OmpW闻表达囷；
(3)进行以高表达菌的外膜孔蛋白OmpW为靶点的药物的筛选，用80μ g/ml的待筛选化合物作用于高表达菌，培养O. 5h，采用Western-blot分析检测高表达细胞OmpW的表达量变化，Ompff的表达量降低，待筛选化合物具有药物作用，Ompff的表达量不变或增加，待筛选化合物不具有药物作用。
实施例3:
以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法
(1)基因的克隆及重组载体的构建以质粒为载体，引物合成后，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板扩增基因omPW,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定并回收目的基因，利用T4-DNA连接酶将目的基因与载体连接；
(2)重组载体的转化及诱导表达得高表达菌采用氨苄青霉素抗性平板筛选外膜孔蛋白表达量高的菌株，然后培养至对数期，加入O. 4mmol/l的IPTG诱导得到相应的外膜孔蛋白OmpW闻表达囷；
(3)进行以高表达菌的外膜孔蛋白OmpW为靶点的药物的筛选，用65μ g/ml的待筛选化合物作用于高表达菌，培养45分钟，采用Western-blot分析检测高表达细胞OmpW的表达量变化，Ompff的表达量降低，待筛选化合物具有药物作用，Ompff的表达量不变或增加，待筛选化合物不具有药物作用。
高表达菌经新鲜的人血浆处理后，部分高表达菌被补体系统裂解消化，存活高表达菌的OmpW表达量显著增加(如图2所示)，而被补体消化的高表达菌中检测不到OmpW (如图3所示);而当高表达菌与补体灭活的血浆处理后，OmpW的表达量未见明显变化(如图4所示)。此外，高表达菌被吞噬后仍存活的高表达菌的OmpW表达量也明显增加(如图1所示)，该结果表明OmpW在 抗先天免疫过程中具有重要作用，用于筛选治疗细菌感染的药物可靠性高。
为进一步证实OmpW抗免疫作用，构建了基因敲除菌(Λο耶F)。经提取膜蛋白样品并进行SDS-PAGE和Western-blot分析表明ompW未见表达(如图5所示)。另夕卜，比较分析菌和正常菌外膜孔蛋白，发现两外膜孔蛋白Fiu和CirA的表达量明显增加(如图5所示),而二者均为TonB依赖的受体蛋白，可摄取各种含铁化合物(如enterochelin、aerobactin等)。这表明细菌在缺失OmpW后,通过上调表达Fiu和CirA来维持对铁摄取和需求的平衡。而这很可能也是的生长未受明显影响的原因。的生长曲线表明敲除后生长未受明显影响(如图6所示)。
在构建了 Λο耶r之后，进一步分析了人单核巨噬细胞(THP-1细胞系，实验时经PMA诱导为巨噬细胞)和取自小鼠的巨噬细胞对与正常菌的吞噬率差异。实验从以下2各方面进行分析
I)将正常及菌利用荧光试剂进行标记，分别取相同数量的此二种细菌与等量的巨噬细胞在37°c下进行孵育。Ih后，充分洗涤细胞，并利用台盼蓝淬灭极少数仍粘附在细胞膜上的荧光。最后在荧光显微镜下观察细胞内的细菌数量。结果显示，菌的吞噬率显著高于正常菌(如图7、图8、图9和图10所示)。
2)正常及菌与巨噬细胞孵育Ih后，充分洗涤细胞，利用纯水裂解细胞，取适量裂解液涂平板，观察并计数细菌的菌落数。结果证实巨噬细胞对菌的吞噬率高于正常菌(如图11和图12所示)，该结果表明，OmpW可促进细菌抗吞噬作用，用于筛选治疗细菌感染药物效率高。
权利要求
1.一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤(1)基因的克隆及重组载体的构建；(2)重组载体的转化、筛选和诱导表达得外膜孔蛋白OmpW高表达菌；(3)以高表达菌的外膜孔蛋白OmpW为靶点进行细胞水平的药物筛选，用5(Γ80μg/ml的待筛选化合物作用于高表达菌，培养O. 5-lh，采用Western-blot分析检测高表达菌的外膜孔蛋白OmpW的表达量变化，Ompff的表达量降低，待筛选化合物具有药物作用，Ompff的表达量不变或增加，待筛选化合物不具有药物作用。
2.根据权利要求
1所述的一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法，其特征在于步骤(I)中利用大肠杆菌K12的ompW基因序列设计合成引物，引物合成后，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板扩增基因ompW，经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定并回收目的基因，利用T4-DNA连接酶将目的基因与载体连接得重组载体。
3.根据权利要求
2所述的一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法，其特征在于，所述载体为质粒或粘粒载体。
4.根据权利要求
1或2或3所述的一种以大肠杆菌外膜孔蛋白为靶点筛选药物的方法，其特征在于步骤(2)中筛选是指采用氨苄青霉素抗性平板筛选外膜孔蛋白OmpW表达量高的菌株，诱导表达是指将外膜孔蛋白OmpW表达量高的菌株培养至对数生长期，加入IPTG诱导得到相应的外膜孔蛋白OmpW高表达菌。
5.根据权利要求
3所述的一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法，其特征在于诱导剂IPTG的浓度为O. 3^0. 4mmol/l。
专利摘要
本发明涉及一种以革兰氏阴性菌外膜蛋白为靶点筛选药物的方法，尤其是涉及一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法，旨在为了解决现有技术的药物筛选方法可靠性差、效率低的不足，所述方法包括下列步骤(1)基因的克隆及重组载体的构建；(2)重组载体的转化、筛选及诱导表达得高表达菌；(3)以高表达菌的外膜孔蛋白OmpW为靶点进行细胞水平的药物筛选。该方法具有操作简单、筛选可靠性好、效率高的优点。
文档编号C12Q1/02GKCN103031358SQ201210275708
公开日2013年4月10日 申请日期2012年8月6日
发明者潘建义, 吴贤斌, 邹海杰 申请人:浙江理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan