真菌内切葡聚糖酶、它们的生产和应用的制作方法

专利名称：真菌内切葡聚糖酶、它们的生产和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的真菌内切葡聚糖酶、它们的生产以及用于生产它们的手段。本发明还涉及包含至少一种新的内切葡聚糖酶的酶制剂，以及用其处理纤维素材料的方法。此外，本发明还涉及包含内切葡聚糖酶的去污剂组合物和动物饲料。
背景技术：
纤维素酶是在工业中最广泛使用的酶之一。它们一般应用于纺织工业、去污剂工业、纸浆和造纸工业、饲料和食品工业包括烘焙，以及水解木质纤维素材料用于例如生物乙醇生产等中。纤维素酶的实际用途受到纤维素酶组合物的性质的阻碍，所述组合物经常是具有各种不同活性和底物特异性的酶的混合物。为此，已进行尝试以获得只具有所需活性的纤维素酶。每种纤维素酶的独特性质使得一些酶与其他酶相比更适合于某些目的。在织物处理中，纤维素酶攻击形成棉纤维的纤维素分子链，从而影响织物的特性。近年来，在纺织工业中，“石洗的”或磨蚀的外观已成为牛仔布生产商的兴趣所在。 传统的浮石石洗降低织物强度并需要负担洗衣设备。趋势已朝向酶法牛仔布精整方法，并且纤维素酶已代替浮石或正与浮石一起使用，为织物提供其所需的“磨损”外观。受控的酶处理引起对衣物和机器的较少损伤，并消除了对处置石头的需要。此外，纺织工业在生物整理中使用纤维素酶，即用于产生永久改进的去起球性以及用于改进抗起球性、通过减少细毛获得清洁的表面结构、改进织物手感例如柔软性、光滑性和更丝般感受、提高织物的悬垂性和色彩增艳以及增加吸水性。纤维素酶包含表现出纤维素酶活性的催化结构域/核心(CD)。除了催化结构域之外，纤维素酶分子还可以包含一个或多个纤维素结合结构域(CBD)、也称为糖类结合结构域 /模块(CBD/CBM)，其可以位于催化结构域的N-或C-端。CBD具有糖类结合活性，并且它们促进固体底物上的酶作用。催化核心和CBD典型地通过柔性和高度糖基化的接头区相连。主要在纤维表面上进行攻击的纤维素酶在用靛蓝染料染色的牛仔布的石洗中特别有用，因为该染料位于纤维表面上。应用于牛仔布处理的纤维素酶通常分为两大类酸性和中性纤维素酶。酸性纤维素酶典型地在PH 4. 5-5. 5下起作用，而中性纤维素酶在pH 6-8的范围内。当用于处理棉织物时，酸性纤维素酶一般需要比中性纤维素酶更短的洗涤时间。酸性纤维素酶在生物整理(去起球)以及牛仔布处理(生物石磨)中特别有用。在生物石磨中使用的酸性纤维素酶主要源自于里氏木霉(Trichoderma reesei)(有性型为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，中性纤维素酶来自于各种真菌，包括Melanocarpus、腐质霉(Humicola)、梭孢壳霉(Thielavia)、毁丝霉(Myceliophthora)、镰孢霉(Fusarium)、 支顶孢(Acremonium)和金孢(Chrysosporium)属的真菌(Haakana等，2004)。里氏木霉 (T. reesei)的酶包括例如来自糖苷家族5 (内切葡聚糖酶II，EGII)、家族7 (纤维二糖水解酶I，CBHI)和家族12 (内切葡聚糖酶III，EGIII ；Ward等，1993)的纤维素酶，中性纤维素酶大多是来自家族45和家族7的内切葡聚糖酶(Henrissat，1991 ；Henrissat和Bairoch， 1993)。内切葡聚糖酶的广泛的工业应用范围已建立起对在所需条件例如pH和温度范围下显示出所需性能的商业化内切葡聚糖酶产品的需求。已经描述了被分类为EGII和EGIII 的酸性纤维素酶在尤其是织物处理中的用途。例如，W02007/118935描述了在织物整理中使用Cel5(EGII)酶。EP 586，375B1公开了包含充分表征的木霉菌(Trichoderma spp.) EGIII酶的去污剂组合物，所述酶具有5. 5-6. O的最适pH、7. 2-8. O的pi和23_28kDa的MW。 US2007/0026420描述了获得与来自里氏木霉的EGIII共有某些保守序列的新酶基因的方法。EGIII样纤维素酶的性质没有举例，但是预计35°C至65°C范围内的温度适合于这些酶。大部分工业用酶在通常约>50°C的升高温度下工作较好，但是出于节能原因、更好的色彩牢固度和减少衣物收缩的目的，对在较低温度水平、即< 50°C例如约30至40°C或甚至20至40°C下具有良好性能的酶存在着需求。这种冷活性酶已在例如细菌、特别是芽孢杆菌(Bacillus)中描述。然而，对于工业应用来说，生产细菌酶与生产真菌酶相比复杂且费力。关于可能的冷活性真菌内切葡聚糖酶的了解仍然非常少。因此，对于具有所需性质和热特性的新的、有优势的内切葡聚糖酶，存在着持续不断的需求。本发明满足了这种需求。发明简述现在，本发明提供了具有独特的热和pH特性的新的内切葡聚糖酶。独特的热性质意味着当温度低于50°C、例如约40°C、约30°C或甚至更低时，可以观察到性能没有显著降低。内切葡聚糖酶可用于不同纤维素酶应用中，例如织物处理，特别是牛仔布处理和去起球。与以前描述的典型为酸性纤维素酶的Cel5酶相反，我们发现了一种在中性pH下具有出色生物石磨效应的新的Cel5。这能够在染色的同时进行生物整理处理，引起相当大的节约。此外，在中性条件下色彩牢固度经常更好。本发明提供了属于糖基水解酶家族12的新的内切葡聚糖酶，即可以源自于木霉属(Trichoderma)或肉座菌属(Hypocrea)的EGIII多肽。具体来说，本发明涉及真菌内切葡聚糖酶多肽，其属于糖基水解酶家族12，并且其包含与SEQ ID NO :62具有至少97%序列同一性、与SEQ ID NO :64具有至少60%序列同一性、与SEQ ID NO :66具有至少85%序列同一性、与SEQ ID NO :68具有至少83%序列同一性或与SEQ ID NO :70具有至少63%序列同一性的氨基酸序列；或其酶活性片段。本发明还提供了属于糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶，即可以源自于木霉属 (Trichoderma)或肉座菌属(Hypocrea)的EGII多肽。具体来说，本发明涉及真菌内切葡聚糖酶多肽，其属于糖基水解酶家族5，并且其包含与SEQ ID NO :42具有至少77%序列同一性、与SEQ ID NO 44具有至少70%序列同一性、与SEQ ID NO 46具有至少78%序列同一性、与SEQ ID NO 48具有至少70%序列同一性、与SEQ ID NO 50具有至少72%序列同一性、与SEQ ID NO 52具有至少78%序列同一性、与SEQ ID NO 54具有至少94%序列同一性、与SEQ ID NO :56具有至少72%序列同一性、与SEQ ID NO :58具有至少82%序列同一性或与SEQ ID NO :60具有至少73%序列同一性的氨基酸序列，或其酶活性片段。本发明还提供了属于糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶，即可以源自于木霉属 (Trichoderma)或肉座菌属(Hypocrea)之外的其他真菌例如青霉属(Penicillium)、镰孢霉属(Fusarium)或地丝霉属(Geomyces)的EGII多肽。具体来说，本发明涉及真菌内切葡聚糖酶多肽，其属于糖基水解酶家族5，并且其包含与SEQ ID NO :72具有至少70%序列同一性、与SEQ ID NO 74具有至少72%序列同一性、与SEQ ID NO 76具有至少72%序列同一性、与SEQ ID NO :78具有至少91%序列同一性、与SEQ ID NO :80具有至少61 %序列同一性或与SEQ ID NO :82具有至少62%序列同一性的氨基酸序列，或其酶活性片段。此外，本发明涉及包含所述内切葡聚糖酶的酶制剂以及包含所述酶或酶制剂的去污剂组合物和动物饲料。本发明还涉及分离的多核苷酸，其选自a)具有 SEQ ID NO :41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、 75、77、79或81的核苷酸序列，或编码上述的内切葡聚糖酶多肽的序列，b)a)的互补链，或c)由于遗传密码而与a)或b)的任一序列简并的序列。本发明还涉及包含所述多核苷酸的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞、和带有所述多核苷酸并具有下列登记号的大肠埃希氏杆菌(E. coli)菌株DSM 19418、DSM 18639、DSM 18638、DSM 19963、DSM 18642、DSM 19419、DSM 19894、DSM 19895、DSM 21129、 DSM 19898、DSM 18640、DSM 18643、DSM 19420、DSM 19899、DSM 19896、DSM 19960、DSM 19961、DSM 18505、DSM 19172、DSM 18914 或 DSM 19962。本发明还提供了生产内切葡聚糖酶多肽的方法，所述方法包含下列步骤用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能使所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞， 以及任选地回收和纯化所述多肽。最后，本发明提供了用于处理纤维素材料的方法，其中所述方法包含将纤维素材料与本发明的内切葡聚糖酶多肽或酶制剂相接触。这种方法的实例是木质纤维素生物质的水解，用于例如生物乙醇生产。在附属权利要求书中提出了本发明的具体实施方案。从下面的图、详细描述和实施例，本发明的其他目的、细节和优点将变得明显。然而，应该理解，在描述、附图和实施例中给出的实施方案仅仅是出于说明的目的，在权利要求书的范围内进行各种改变和修改是可能的。附图简述

图1是在里氏木霉(Trichoderma reesei)原生质体的转化中使用的、用于过量生产重组Cel5或Cel 12蛋白的表达盒的示意图。图 2A)显示了来自木霉(Trichoderma)或肉座菌(Hypocrea)的重组 Cel5A/EGII 蛋白制剂的最适pH，B)显示了来自木霉CTrichoderma)的重组Cell2A/EGIII蛋白制剂的最适pH，C)显示了来自木霉(Trichoderma)之外真菌的重组Cel5A/EGII蛋白制剂的最适 pH，D)显示了来自木霉(Trichoderma)或肉座菌(Hypocrea)的重组Cel5A/EGII蛋白制剂的热稳定性，E)显示了来自木霉(Trichoderma)的重组Cell2A/EGIII蛋白制剂的热稳定性，F)显示了来自木霉(Trichoderma)之外真菌的重组EGII/Cel5A蛋白制剂的热稳定性。图3-5显示了来自木霉(Trichoderma)的重组Cell2A/EGIII蛋白制剂在牛仔布处理中的温度轮廓图。图6显示了来自镰孢霉(Fusarium)的重组Cel5A/EGII蛋白制剂在牛仔布处理中的PH轮廓图。图7显示了重组Cell2制剂(Ts_RF6193_Cell2)与不含酶的对照样品相比，在 40°C下生物整理(去起毛)处理中的性能。
发明详述本发明是基于在真菌培养物保藏物中筛选低温纤维素水解活性的研究。使用各种生产培养基将真菌菌株在20°C下培养3-7日。回收上清液并在30°C和50°C的温度下测试对羧甲基纤维素(CMC)和羟乙基纤维素(HEC)的纤维素水解活性，以筛选低温特性。将最有利的菌株在20°C下培养4-7日后，在小规模生物石磨应用中进一步测试。在初步筛选后， 选择13株菌株进行基因组文库构建，并在文库中进一步筛选cel5和cell2。将阳性噬菌体克隆亚克隆到细菌载体中并通过测序进行验证，然后保藏在DSMZ。为了生产Cel5或Cell2 酶，将编码所需活性的基因融合到里氏木霉(Trichoderma reesei)的cbhl/cel7A启动子中。通过里氏木霉的cbhl/cel7A终止子确保转录终止，并使用amdS标志物筛选阳性克隆。 从载体骨架分离线性表达盒，并转化到缺失主要纤维素酶的里氏木霉原生质体中。将纯化的转化体在纤维素酶诱导培养基中培养7日，并测试培养上清液的内切葡聚糖酶活性。也测试了热和PH性质。用于大规模应用的材料通过实验室生物反应器培养获得，培养在观V 下持续3-4日，然后在需要时进行过滤和浓缩。在洗衣机中，在不同温度下的牛仔布处理中对培养上清液进行测试，使用一种 Cel5和一种Cell2商业化制剂作为参比。使用颜色反射率测量来评估得到的生物石磨效应。在牛仔布应用中，大多数酶在低温下也显示出出色的性能。还发现酶具有出色或良好的去起球效应。意外的是，发现Cel5酶是中性纤维素酶，这与该纤维素酶家族以前描述的酶相反，已知那些酶是酸性纤维素酶。本发明提供了在低温下具有显著性能的新的真菌Cell2内切葡聚糖酶多肽。本发明还提供了在中性PH下具有出色性能的新的真菌Cel5内切葡聚糖酶多肽。当在本文中使用时，“多肽”和“蛋白”是同义词。在本文中，“真菌的”是指内切葡聚糖酶或编码它的多核苷酸可以源自于真菌、特别是丝状真菌，例如木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、青霉属 (Penicillium)、地丝霉属(Geomyces)或镰孢霉属(Fusarium)。根据本发明的具体实施方案，内切葡聚糖酶源自于盖姆斯木霉(T. gamsii)、红棕肉座菌/绿色木霉(H.rUfa/ Τ. viridae)、H. atroviridis、哈茨木霉(Τ. harzianum)、可育木霉(Τ. fertile)、拟康宁木霉(H. koningiopsis)、小朿Ij 青霉(P. spinulosum)、灰黄青霉(P. griseofulvum)、 毡状地丝霉(G.parmorum)或木贼链孢霉(F. cf equiseti)。最优选，多核苷酸或多肽源自于木霉菌(Thchoderma sp.) RF6193 (CBS 1213 )、盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii) RF6208 (CBS 119563)、红棕肉座菌 / 绿色木霉(Hypocrea rufa/Trichoderma viride)RF6310(CBS 118970)、Hypocrea atroviridis RF6323 (CBS 119561)、哈茨木霉 (Trichoderma harzianum) RF6482 (CBS 119562)、哈茨木霉 RF6541 (CBS 119957)、可育木霉(Trichoderma fertile) RF6601 (CBS 121357)、拟康宁木霉(Hypocrea koningiopsis) RF6604 (CBS 119960)、小刺青霉(Penicillium spinulosum) RF6286 (CBS 121355)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum) Dierckx RF6288 (CBS 119565)、毡状地丝霉(Geomyces pannorum) RF6293 (CBS 119567)、毡状地丝霉 RF6547 (CBS 121356)或木贼链孢霉 (Fusarium cf.equiseti)RF6318(CBS 119568)。术语“源自于”结合微生物源使用时，是指多肽可以由所述特定微生物源天然产生，或编码多肽的多核苷酸可以从所述微生物源分离，并任选地在已导入来自所述微生物源的编码多肽的多核苷酸的宿主细胞中表达。然而，它不排除由例如一个或几个氨基酸/ 核苷酸的取代、缺失和/或插入造成的序列的少量修饰，只要被编码和分泌的蛋白的酶活性得以保留即可。在本发明中，“内切葡聚糖酶” (“EG”)是指被分类为E. C. 3. 2. 1. 4.的酶。它们是1，4- β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，并催化葡萄糖聚合物例如纤维素中1，4- β -D-糖苷键的内切水解。一些内切葡聚糖酶也可以水解例如还包含1，3-键的β-D-葡聚糖中的1， 4-键。因此它们也可以被分类为内切_1，30)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2. 1.6)。因此，酶可以催化几种底物上的反应，并可属于多个类别。本发明的内切葡聚糖酶可以任选包含信号序列以及与催化结构域/核心(CD)相连的一个或多个纤维素结合结构域(CBD)。“糖基水解酶家族5”和“糖基水解酶家族12”是指由Henrissat 1991以及 Henrissat和Bairoch 1993、1996所定义的糖基水解酶家族，所述文献在此引为参考。编码属于糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶的基因被称为cel5或egl2，所编码的内切葡聚糖酶被称为Cel5或内切葡聚糖酶II (EGII)。相应地，编码属于糖基水解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因被称为cell2或egl3，所编码的内切葡聚糖酶被称为Cell2或内切葡聚糖酶 III(EGIII)。一些内切葡聚糖酶在低温下显示出显著性能。在本文中，“显著性能”是指酶当应用于至少一种类型的纤维素酶应用过程例如纺织品的生物石磨和/或生物整理或在洗涤中时，显示出出色的性能。本文中使用的“冷活性”或“低温”是指温度为=50°C、特别是= 45°〇、优选为=40°C并包括=30°C。
序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同序列同
根据本发明的一个实施方案，内切葡聚糖酶包含与SEQ ID N0:42具有至少77%
性、与SEQ ID NO :44具有至少70%序列同-性、与SEQ ID NO 48具有至少70%序列同-性、与SEQ ID NO 52具有至少78%序列同-性、与SEQ ID NO 56具有至少72%序列同-性、与SEQ ID NO 60具有至少73%序列同-性、与SEQ ID NO 64具有至少60%序列同-性、与SEQ ID NO :68具有至少83%序列同-性、与SEQ ID NO :72具有至少70%序列同-性、与SEQ ID NO :76具有至少72%序列同-
性、与SEQ ID NO 46具有至少78% 性、与SEQ ID NO 50具有至少72% 性、与SEQ ID NO 54具有至少94% 性、与SEQ ID NO 58具有至少82% 性、与SEQ ID NO 62具有至少97% 性、与SEQ ID NO 66具有至少85% 性、与SEQ ID NO 70具有至少63% 性、与SEQ ID NO 74具有至少72% 性、与SEQ ID NO 78具有至少91% 性或与SEQ ID N0:82具有至少62%
性、与SEQ ID NO :80具有至少61%序列同-
性的氨基酸序列，或其酶活性片段。优选，内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO :42,44, 46、48、50、52、56、58、60、64、66、68、70、72、74、76、80 或 82 具有至少 90%、优选至少 95%、最优选至少98%或99%序列同一性的氨基酸序列、或其酶活性片段；或与SEQ ID NO 54或 78具有至少95%序列同一性、或与SEQ ID NO :54、62或78具有至少98或99%序列同一性的氨基酸序列，或其酶活性片段。 当在本文中使用时，术语“同一性”是指两个互相比较的氨基酸序列之间从相应基因编码的第一个氨基酸到最后一个氨基酸的总体同一性。出于本发明的目的，同一性优选利用使用标准算法的已知计算机程序来确定。这种程序的实例是Clone Manager Suite, 该程序包括程序部分 Align Part，并由 Scientific & Educational Software, Durham,
7NC, USA销售。根据本发明，包含了 “两序列比较/总体/DNA序列比较”(Compare Two Sequences/Global/Compare DNA sequences)功能的禾呈序版本"Clone Manager 7Align Plus 5”对于确定同一性程度来说特别有用。在这种情况下，使用可以从下列来源获得的算法Hirsctiberg，D. S. (1975)用于计算最长共同子序列的线性空间算法(A linear space algorithm for computing longest common subsequences), Commun. Assoc. Comput. Mach. 18 :341-343 ；Myers, E. W.和 W. Miller. (1988)线性空间中的最优比对(Optimal alignments in linear space)，CABIOS 4:1，11—17 ;Chao，K_M，W. R. Pearson 禾口 W. Miller. (1992)在指定斜角带内比对两个序列(Aligning two sequences within a specified diagonal band)，CA-BIOS 8:5，481_487。本技术领域的专业人员认识到下述事实，即只有当比对序列的相应结构域时，结果才是可比的。因此，对例如包含CBD或信号序列的纤维素酶序列与缺乏这些元件的序列的比较，由于没有意义而被排除。“酶活性片段”是指特定氨基酸序列的长得足以具有所需酶活性的部分。换句话说，片段可以只是例如多肽的成熟部分或甚至是成熟部分的子序列。它可以包含或可以不含接头和CBD结构域。更具体来说，酶活性是指具有水解纤维素或其衍生物的催化能力的纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶或β-葡聚糖酶活性。除了内切葡聚糖酶和/或β-葡聚糖酶活性之外，一些纤维素酶还可以具有半纤维素酶和/或木聚糖酶活性。酶活性可以如实施例1中所述来测定。本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA。根据本发明的一个实施方案，内切葡聚糖酶由具有SEQ ID NO :41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或 81的多核苷酸或其长得足以编码酶活性内切葡聚糖酶的片段编码。优选，内切葡聚糖酶由与大肠埃希氏杆菌(E. coli)DSM 19418,DSM 18639,DSM 18638,DSM 19963,DSM 18642,DSM 19419、DSM 19894、DSM 19895、DSM 21129、DSM 19898、DSM 18640、DSM 18643、DSM 19420、 DSM 19899、DSM 19896、DSM 19960、DSM 19961、DSM 18505、DSM 19172、DSM 18914 或 DSM 19962所携带的类似的多核苷酸编码。本发明的内切葡聚糖酶优选为重组蛋白。它们通过公知的重组DNA技术在异源或同源宿主中方便地制备。优选，内切葡聚糖酶在真菌宿主中过表达。简单来说，将编码内切葡聚糖酶的多核苷酸克隆并插入到表达载体中，转化到宿主细胞中并表达。“表达载体”是在转化到所需宿主中后能够表达编码内切葡聚糖酶蛋白的DNA的克隆质粒或载体。当使用真菌宿主时，目标基因优选作为整合到真菌染色体中或允许目标基因整合到宿主染色体中的克隆或表达载体的一部分提供给真菌宿主。在整合过程中，其他序列作为克隆载体或表达载体的一部分也可以与所述DNA—起整合。此外，在真菌中，表达载体或其部分可以定向到预定的基因座中。或者，所需基因可以作为自主复制质粒提供。编码内切葡聚糖酶蛋白的DNA优选置于载体提供的某些控制序列、例如启动子序列的控制之下(即与其可操作连接)。在转化后，这些控制序列与目标序列一起整合到宿主基因组中。或者，控制序列可以是整合位点处的控制序列。表达载体的表达控制序列将随着载体被设计用于在原核还是真核宿主中表达某个基因而变。表达控制序列可以含有转录调控元件例如启动子、增强子元件和转录终止序列，和/或翻译调控元件例如翻译起始和终止位点。多核苷酸分子例如DNA，如果其包含表达控制序列，所述序列含有转录调控信息并且这些序列与编码多肽的核苷酸序列可操作连接，则被称为能够表达多肽。可操作连接是指这样的连接，其中一个序列与调控序列(或多个序列)连接的方式是将序列的表达置于调控序列的影响或控制之下。两个DNA序列(例如启动子区序列与蛋白编码序列的5’末端相连)，如果启动子的功能引起转录，则被称为是可操作连接的。本发明的载体还可以包含其他可操作连接的调控元件，例如增强子序列。在优选实施方案中，构建了遗传稳定的转化体，其中通过用载体进行转化将编码蛋白的DNA整合到宿主染色体中，所述载体可以带有促进所述载体整合到染色体中的序列。已在其染色体中稳定地整合了编码内切葡聚糖酶蛋白的DNA的细胞，可以通过例如被导入的同源或异源标志物进行筛选，所述标志物允许筛选在染色体中含有表达载体的宿主细胞，例如标志物可以提供杀生物剂抗性，例如对抗生素或重金属例如铜的抗性，或者标志物与宿主染色体中的营养缺陷突变互补等。选择性标志物可以是例如与待表达的DNA 基因序列直接相连的选择性基因，或通过共转化导入到相同细胞中。也可以使用其他筛选系统。在制备了含有内切葡聚糖酶编码DNA的表达载体后，通过各种适合手段中的任一种，包括本技术领域已知的转化，将其导入到适合的宿主细胞中。在转化后，通常将受体细胞生长在对转化细胞的生长进行选择的适合的选择培养基中。适合的表达和生产宿主系统是例如为真菌宿主木霉(Trichoderma) (EP 244234) 或曲霉(Aspergillus)例如米曲霉(A. oryzae)或黑曲霉(A. niger) (W0 97/08325 和 WO 95/33386，美国专利No. 5，843，745，美国专利No. 5，770，418)开发的生产系统，或为链孢霉(Fusarium)例如尖链孢霉(F. oxysporum) (Malardier等，1989)或白腐金孢霉 (Chrysosporium luckowense)开发的生产系统。根据本发明的优选实施方案，可以使用部分纤维素酶和/或半纤维素酶和/或蛋白酶缺陷的宿主菌株。为细菌开发的适合的生产系统包括为芽孢杆菌(Bacillus)例如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽胞杆菌 (B. Iicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、或为大肠埃希氏杆菌 (E. coli)或为放线菌链霉菌(Sti^ptomyces)开发的生产系统。为酵母开发的适合的生产系统是为酵母菌(Saccharomyces)、裂殖酵母(Siizosaccharomyces)、巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)或汉逊酵母(Hansenula)开发的系统。其他微生物包括用于生物乙醇生产的联合发酵微生物、或哺乳动物细胞或植物中的生产系统，也是可能的。被克隆的基因序列的表达引起所需蛋白的生产，或该蛋白的片段的生产。在转化的细胞中发生这种表达可以是连续方式或受控方式。为了获得本发明的酶制剂，将具有所需性质的宿主(即能够表达经济可行量的内切葡聚糖酶蛋白的宿主)在适合条件下培养，并且所需的酶优选从宿主分泌到培养基中， 并任选通过本技术领域已知的方法从所述培养基回收。优选，用于这种生产的宿主是丝状真菌，例如木霉或曲霉，特别是里氏木霉。当在本发明的文本中使用时，“酶制剂”是指任何酶产品，其包含至少一种本文描述的新的内切葡聚糖酶。因此，这样的酶制剂可以是用过的培养基或滤液。用过的培养基意味着包含所产生的酶的宿主培养基。优选，在生产后将宿主细胞与所述培养基分离。如果需要，这样的制剂可以被冻干或者以其它方式对酶活性进行浓缩和/或稳定化以备储存。如果需要，可以按照常规方法例如过滤、提取、沉淀、层析、亲和层析、电泳等对所需酶进行分离和进一步纯化。然而，本发明的优点在于含有或不含宿主细胞的培养基可以不需进一步纯化而原样用作酶制剂，因为内切葡聚糖酶蛋白可以分泌到培养基中，并且它们在用过的培养基的环境条件下表现活性。酶制剂的提供和使用非常经济，因为不需要从培养基分离特定的酶。除了一种或多种内切葡聚糖酶蛋白之外，酶制剂可以包含一种或多种其他酶，其可以是例如其他纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和/或氧化酶例如漆酶、过氧化物酶和过氧化氢酶。或者，在用内切葡聚糖酶蛋白处理之前、期间或之后，可以进行另一种酶处理。酶处理可以包含例如一种或多种淀粉酶处理(例如用于牛仔布脱浆)、一种或多种纤维素酶处理和/或一种或多种过氧化物酶和/或漆酶处理。在酶制剂中包含或在酶处理中使用何种其他酶，取决于具体应用。除了内切葡聚糖酶蛋白之外，酶制剂可以包含添加剂例如稳定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基组分。优选的添加剂是在准备使用酶制剂的应用中，所述酶制剂常用的添加剂。酶制剂可以提供成液体或固体例如干粉或颗粒，特别是未粉化的颗粒或稳定化的液体。设想了可以将酶制剂进一步富集以满足各种应用例如纺织工业中特定用途的需要。 由宿主分泌的酶活性的混合物在具体的工业应用例如在生物整理和生物石磨中，可能是有利的。内切葡聚糖酶蛋白及其制剂可用于例如纺织、饲料和食品例如烘焙应用中，用于生物质水解例如生物乙醇生产中，以及用于植物油、去污剂和纸浆和造纸工业中。它们可用于处理任何纤维素材料，例如纺织材料、在食品或动物饲料中使用的植物或植物来源的材料、用于提取油的植物材料或木材来源的机械或化学纸浆或次级纤维。它们也可以添加到去污剂中，例如通过抗起球、抗发灰、色澄清和软化来改进织物护理性质，以及改进纺织品清洁效应，例如除污垢。去污剂组合物通常还包含助剂，例如表面活性剂(阴离子、非离子、 阳离子和两性离子表面活性剂)、助洁剂和其他任选的成分，例如抗再沉积和污垢悬浮剂、 荧光增白剂、漂白剂、染料和色素以及水解酶。在本文本中，“纤维素材料”是指任何包含纤维素或其衍生物作为重要组分的材料。将纤维素材料在适合条件例如适合的PH和温度下与有效量的蛋白相接触，并允许反应持续足以使酶反应发生的时间。取决于所使用的具体酶，所述的Cell2内切葡聚糖酶优选在约20-60°C、更优选约30-50°C的温度范围内使用。有用的温度可以是=50°C、例如= 45°C或=40°C或甚至=30°C。适合的pH范围约为2-8，优选为约3-6. 5，特别是约4_6。 根据一个具体实施方案，PH为约4. 5-5. 5或约5. 0-5. 5。所述的Cel5内切葡聚糖酶在约 30-70°C、优选约50-60°C的温度下和在约2_7、优选约4_6、特别是约5_6的pH范围内使用， 源自于链孢霉的内切葡聚糖酶除外，其优选用于PH范围为约4-10、更优选5-8、更加优选 6-7、特别是约6. 5并且温度为50-60°C的应用中。内切葡聚糖酶在纺织材料例如织物和衣物或纱线的处理中特别有用。纺织材料可以由含天然纤维素的纤维或含人造纤维素的纤维或其混合物、或者合成纤维与含纤维素的纤维的掺合物制成。优选，含纤维素的材料是棉、特别是牛仔布。在本发明中，“牛仔布”是指牛仔布织物，通常是牛仔布衣物，特别是牛仔裤。有利的是，牛仔布是靛蓝染色的牛仔布。牛仔布也可以用靛蓝的衍生物或用靛蓝与一些其他染料一起处理，例如具有底层用硫处理的靛蓝染色的牛仔布。所描述的内切葡聚糖酶在纺织工业、优选在生物石磨和生物整理中特别有用。石洗有三个步骤脱浆、磨蚀和后处理。第一步的脱浆过程通常是牛仔裤的第一次湿法处理，意味着除去通常施加到经纱上以防止编织过程中受损的淀粉或其他上浆剂。 α -淀粉酶被用于除去基于淀粉的上浆剂，以改善湿法工艺或使其均勻。在脱浆后，通常将牛仔裤用水漂洗或直接送往磨蚀步骤。第二步磨蚀可以使用酶或浮石或两者进行。在所有情况下都需要机械作用来除去染料，并且处理通常在洗衣机例如转筒式洗衣机中执行。术语“磨蚀的”是指牛仔布织物在被纤维素酶或石头或两者处理后的外观。同义的表述是“石洗外观”或“磨损外观”。作为染料移除不均勻的结果，在有染料区域与除去染料的区域之间存在反差。磨蚀后一般进行第三步后处理，其包括清洗和漂洗步骤，在此期间可以使用去污剂、荧光增白剂、漂白剂或柔顺剂。在酶处理后，应该停止反应以防止被处理材料的损伤，例如通过温度和/或PH失活，后者包含充分漂洗和/或去污剂洗除。这确保纤维的机械强度不受继续存在的酶的进一步损坏。当在本文中使用时，表述织物或衣物的“生物石磨”是指使用酶代替浮石或与浮石一起处理织物或衣物、特别是牛仔布。正如上面所陈述的，用纤维素酶进行的处理能够完全代替浮石处理。然而，当需要产生重度磨蚀的整理时，也可以将纤维素酶处理与浮石处理相结合。此外，内切葡聚糖酶可用于织物和衣物的生物整理。“生物整理”(也称为去起球、 去起毛、去起绒或生物精整)是指在纤维素纤维的受控水解中使用酶来修改织物或纱线表面，以便永久防止起球倾向、改善织物手感例如柔软度和光滑度、通过减少起毛清洁表面结构以导致颜色澄清，并且还可以改进织物的悬垂性、吸水性和可染色性。其他用途包括用于去污剂组合物中，通过抗起球、抗发灰、颜色澄清和软化改进织物护理性质，以及改进织物清洁作用，例如除污垢。酶法去起球可以在织物湿法处理的任何阶段执行，优选在任选的脱浆和/或漂白后执行，并可以使用与生物石磨中相似的条件。衣物形式的纺织品也可以进行处理。在生物石磨和生物整理二者中，浴比(单位重量的织物的液体体积比率)可以在约3 1至20 1、优选5 1至10 1的范围内。处理时间可以在15分钟至90分钟， 优选在30分钟至60分钟的范围内。应该强调，酶的剂量极大地依赖于织物的类型、机器、 加工条件(ΡΗ、温度、浴比、处理时间、牛仔布载量、加工规模)和酶制剂的类型等。本技术领域的专业人员能够确定适合的剂量和条件。本发明的用于处理纤维素材料的方法还涵盖了木质纤维素材料的水解，用于例如生物乙醇生产。在木质纤维素材料水解中使用联合生物加工(CBP)的一个实例由van Zyl 等描述在 Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007 ； 108 :205-35 中。通过下面的非限制性实施例对本发明进行了进一步说明。实施例1、表现出低温纤维素水解活性的菌株的筛选对Roal Oy培养物保藏中心(Roal Oy culture collection)的约180株真菌菌株测试了它们产生低温纤维素水解活性的能力。将真菌菌株在IOOml体积中、在旋转摇床
11(200rpm)上、在20°C的温度下培养3-7日。测试了含有Solka Floe纤维素作为碳源的几种生产培养基。在培养后，通过离心收集细胞和其他固体，并回收上清液。如果不立即使用， 将制备物分成等份，储存在-20°C下。为了估算在较低温度下的酶活性，对摇瓶培养制备物在30°C和50°C下进行了 1小时的测定。对所有摇瓶上清液测定了下列活性内切葡聚糖酶(CMCase)活性这基本上按照Bailey 和 Nevalainen 1981 ;Haakana 等，2004 所述，使用 3 % (w/ ν)羧甲基纤维素(CMC)作为底物在50mM柠檬酸缓冲液中进行测定。还原糖使用DNS试剂测量。测定在PH 5. O和7. O两种条件下进行。内切葡聚糖酶(EOT)活性这基本上按照Bailey和Nevalainen 1981所述，使用1 % (w/v)羟乙基纤维素 (HEC)作为底物在50mM柠檬酸缓冲液中进行测定。还原糖使用DNS试剂测量。测定在pH 5. 0和7. 0两种条件下进行。将菌株的培养上清液制备物在小规模生物石洗应用中、在LP-2Laimder Ometer中如下所述进行测试。将约7. 2g脱浆过的牛仔布样布(12x12cm)与钢球一起装入含有IOOml Mc Ilvaine缓冲液和IOOml培养上清液的1. 2升容器中，并将Launder Ometer在30°CT 运行120分钟。在碱和去污剂洗涤后，将织物样品用温水仔细漂洗并晾干。结果通过目测和测量颜色作为反射率值(数据未显示)两者进行评估。在初步筛选后，选择了 13株菌株用于进一步的应用研究(木霉菌RF6193、盖姆斯木霉RF6208、红棕肉座菌/绿色木霉RF6310、Hypocrea atroviridis RF6323、哈茨木霉RF6482和RF6M1、可育木霉RF6601、拟康宁木霉RF6604、小刺青霉RF6^6、灰黄青霉 Dierckx RF6^8、毡状地丝霉RF6293和RF6M7、以及木贼链孢霉RF6318)。为此，将菌株 RF6193在200ml的体积中、在旋转摇床QOOrpm)上、在用5% KH2PO4缓冲的复杂的基于乳糖的纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等，199 中、在20°C的温度下培养7日。将菌株 RF6208、RF6310、RF6547、RF6601 和 RF6604 在 200ml 的体积中、在旋转摇床(200rpm)上、 在20°C的温度下在培养基中培养4-7日，所述培养基含有(克/升)Solka Floc纤维素6. 0，小麦麸皮4. 0，来自桦木的木聚糖2. 0，玉米浸出粉1. 0，大豆粉1. 0，刺槐豆胶2. 0， CaCO3 2. 0，(NH4)2HPO4 1. 5，KH2PO4 0. 5，MgSO4 · H2O 0. 5，NaCl 0. 5，微量元素溶液 #1 0. 5， 微量元素溶液#2 0.5，石蜡油0.5 ；将pH调整至6. 4。微量元素溶液#1 (mg/升)=MnSO4 1. 6，ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. 0 ；微量元素溶液 #2 (mg/ 升)=FeSO4 · H2O 5. 0。将菌株RF6323、RF6482和RF6541在200ml的体积中、在旋转摇床QOOrpm)上、在20°C的温度下于培养基中培养7日，所述培养基含有(克/升)Solka Floc纤维素10.0，玉米浸出粉 1. 5，大豆粉 0. 5，CaCO3 0. 5，(NH4)2HPO4 1. 5，KH2PO4 2. 0，MgSO4 · H2O 0. 5，NaCl 0. 5，NH4NO3 0. 5, Tween-80 0.5，微量元素溶液#1 0.5，微量元素溶液#2 0. 5，石蜡油0. 5 ；将pH调整至 6. 4。微量元素溶液 #1 (mg/ 升)=MnSO4 1.6, ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. O ；微量元素溶液 #2 (mg/ 升)=FeSO4 · H2O 5. O。将菌株 RF6288, RF6293 和 RF6318 在 200ml 的体积中、在旋转摇床QOOrpm)上、在20°C的温度下于培养基中培养4-6日，所述培养基含有(克 / 升)=Solka Floc 纤维素 30. 0，玉米浸出粉 9. 0，大豆粉 1. 5，CaCO3 1. 5，(NH4)2HPO4 4. 5， KH2PO4 6. 0，MgSO4 · H2O 1. 5，NaCl 0. 5，NH4NO3 1. 5，Tween-80 0. 5，微量元素溶液 #1 0. 5，微量元素溶液#2 0.5，石蜡油0.5 ；将pH调整至6. 4。微量元素溶液#1 (mg/升)=MnSO4 1. 6，ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. 0 ；微量元素溶液 #2 (mg/升)=FeSO4 · H2O 5.0。将菌株 RF6286在200ml的体积中、在旋转摇床QOOrpm)上、在20°C的温度下于培养基中培养4_6 日，所述培养基含有(克/升)=Solka Floc纤维素18.0，小麦麸皮12.0，来自桦树的木聚糖 6.0，玉米浸出粉 3.0，大豆粉 3.0，此槐豆胶 6.0，CaC036. O，(NH4)2HPO4 4. 5，KH2PO4 1.5， MgSO4 · H2O 1.5，NaCl 0.5，微量元素溶液#1 0.5，微量元素溶液#2 0. 5，石蜡油0. 5 ；将pH 调整至 6. 4。微量元素溶液 #1 (mg/ 升)=MnSO4 1. 6，ZnSO4 · H2O 3. 45，CoCl2 · H2O 2. O ；微量元素溶液 #2 (mg/ 升)=FeSO4 · H2O 5. O。实施例2、从木霉菌RF6193、盖姆斯木霉RF6208、红棕肉座菌/绿色木霉RF6310、 Hypocrea atroviridis RF6323、哈茨木霉 RF6482 和 RF6541、可育木霉 RF6601、拟康宁木霉 RF6604、小刺青霉RF6^6、灰黄青霉Dierckx RF6288、毡状地丝霉RF6293和RF6547、以及木贼链孢霉RF6318克隆内切葡聚糖酶基因在DNA(质粒、DNA片段)的分离和酶处理、在大肠杆菌转化等中使用了标准的分子生物学方法。使用的基本方法描述在标准的分子生物学手册中，例如Sambrook等(1989) 以及 Sambrook 和 Russell (2001)。按照供应商的说明书，将木霉菌RF6193、盖姆斯木霉RF6208、红棕肉座菌/绿色木霉 RF6310、Hypocrea atroviridis RF6323、哈茨木霉 RF6482 和 RF6M1、可育木霉 RF6601、 拟康宁木霉RF6604、灰黄青霉Dierckx RF6288的基因组文库制造在Lambda FIX II/Xho I部分填补载体试剂盒Gtratagene，USA)中。将通过Raeder和Broda(1985)的方法分离的染色体DNA用Sau3A部分消化。将消化的DNA按照大小分级，并将所选大小(6-231Λ)的片段填补并连接到》ιοΙ消化的Lambda FIX II载体臂中。使用Gigapack III Gold包装提取物按照制造商的说明书(StratagenhUSA)对连接混合物进行包装。对于小刺青霉RF6^6、毡状地丝霉RF6293和RF6M7、以及木贼链孢霉RF6318来说，按照供应商的说明书使用Lambda DASH II/BamHI载体(Mratagene，USA)来构建基因组文库。将通过Raeder和Broda(1985)的方法分离的染色体DNA用Sau3A部分消化。将消化的DNA按照大小分级，并将所选大小(5-201Λ)的片段连接到BamHI消化的Lambda载体臂中。使用Gigapack III Gold包装提取物按照制造商的说明书(Stratagene，USA)对连接混合物进行包装。构建的基因组文库的滴度显示在表1中。表1、构建的基因组文库的滴度
权利要求
1.一种真菌内切葡聚糖酶多肽，其属于糖基水解酶家族12，并且其包含与SEQ ID NO 64具有至少60%序列同一性、与SEQ ID NO :66具有至少85%序列同一性、与SEQ ID NO: 68具有至少83%序列同一性或与SEQ ID NO 70具有至少63%序列同一性的氨基酸序列， 或其酶活性片段。
2.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，其源自于木霉属(Trichoderma)或肉座菌属 (Hypocrea)，优选源自于哈茨木霉(T. harzianum)或可育木霉(T. fertile)，最优选源自于木霉菌(Trichoderma sp.) RF6193 (CBS1213M)、哈茨木霉 RF6482 (CBS 119562)、哈茨木霉 RF6541 (CBS 119957)或可育木霉 RF6601 (CBS 121357)。
3.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，其与SEQID N0:64、66、68或70具有至少90%、 优选至少95%、最优选至少98%的序列同一性，或其酶活性片段。
4.权利要求3的内切葡聚糖酶多肽，其具有SEQID NO :64、66、68、70或78的氨基酸序列。
5.一种分离的多核苷酸，其选自a)具有SEQID NO :63、65、67或69的核苷酸序列，或编码权利要求1的内切葡聚糖酶多肽的序列，b)a)的互补链，或c)由于遗传密码而与a)或b)的任一序列简并的序列。
6.权利要求5的多核苷酸，其与大肠埃希氏杆菌(E.coli) DSM 18643, DSM 19420, DSM 19899或DSM 19896所携带的多核苷酸类似。
7.—种表达载体，其包含权利要求5的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求7的表达载体。
9.一种用于生产权利要求1的内切葡聚糖酶多肽的方法，所述方法包含以下步骤用编码所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能使所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收和纯化所述多肽。
10.一种酶制剂，其包含权利要求1的内切葡聚糖酶多肽。
11.一种用于处理纤维素材料的方法，其中所述方法包含将纤维素材料与权利要求1 的内切葡聚糖酶多肽或权利要求10的酶制剂相接触。
12.权利要求11的方法，其中处理在=50°C、优选=40°C的温度下进行。
13.权利要求12的方法，其在pH约4-6、优选pH4.5-5. 5、更优选pH5. 0-5. 5下进行。
14.权利要求11的方法，其是生物石磨或生物整理。
15.权利要求11的方法，其是木质纤维素材料的水解或食品应用。
16.一种去污剂组合物，其包含权利要求1的内切葡聚糖酶多肽或权利要求10的酶制剂。
17.一种动物饲料，其包含权利要求1的内切葡聚糖酶多肽或权利要求10的酶制剂。
18.大肠埃希氏杆菌菌株，其登记号为DSM18643、DSM 19420、DSM 19899或DSM 19896。
全文摘要
本发明公开了新的真菌内切葡聚糖酶Cel5和Cel12。内切葡聚糖酶通过重组技术便利地生产，并描述了用于生产它们的手段。内切葡聚糖酶被用于处理纤维素材料，特别是在纺织工业、例如生物整理或生物石磨中。它们也可用于去污剂、动物饲料和/或纸浆和造纸工业中，或用于水解木质纤维材料以例如生产生物乙醇中。
文档编号C12N15/56GK102272298SQ200980153611
公开日2011年12月7日 申请日期2009年12月28日 优先权日2008年12月30日
发明者乔治·绍卡奇, 加里·韦赫曼佩雷, 彭蒂·奥加帕罗, 泰尔希·普拉宁, 玛丽卡·阿拉普兰恩, 莉娜·瓦尔塔卡里 申请人:生化酶股份有限公司