专利名称：：穿刺巴氏杆菌活体繁殖的方法
技术领域：
：本发明涉及一种细菌活体繁殖的方法，具体地讲是涉及一种穿剌巴氏杆菌活体大量繁殖的方法。
背景技术：
：穿剌巴氏杆菌(Pasteuriapenetrans)寄生根结线虫(Meloidogynespp.)，属于革兰氏阳性菌。其繁殖方式是产生不具有游动性的休眠内生孢子。当根结线虫的二龄幼虫在土壤中移动遇到孢子，通过接触，土壤中的休眠孢子附着于线虫的体表上，并随着二龄幼虫侵入寄主植物的根系。当二龄幼虫在寄主植物中建立侵染点并开始取食之后，休眠孢子萌发，产生侵染管并穿过线虫的体壁，侵入到线虫的假体腔，侵染后的线虫能继续取食，脱皮，发育成三龄，四龄幼虫直至成虫。侵染后的雌虫不能产卵或只产生少量的卵，其假体腔被穿剌巴氏杆菌充满，菌丝体大量繁殖，形状如花椰菜，菌丝体分化后进入产孢阶段，最终每个雌虫体内能产生多达二百万个内生休眠孢子，这些休眠孢子随着根系和雌虫的分解进入土壤中，完成其生活史。休眠孢子具有良好的抗逆性，能抗高温、干旱(燥)、高湿及各种化学和物理因子。穿剌巴氏杆菌因其独特的抗逆性和作用机制，大量研究证明它是一种非常有效防治根结线虫病的生防因子，具有广阔的开发前景。然而，目前该菌难以在人工合成培养基上大量繁殖，成为大规模应用其防治线虫的瓶颈，有学者将目光转移到了该菌活体培养方式的研究。早在1980年，Stirling和Wachtel就提出了利用活体繁殖技术生产穿剌巴氏杆菌菌剂的技术(Stirling.G.R..andWachtel.M.F.1980.MassproductionofBacilluspenetransforthebiologicalcontrolofroot-knotnematodes.Nematologica26:308-312)，随后Brown、Channer、Verdejo等学者相继对活体扩繁体系中孢子附着技术进行了研究，确立了几种穿刺巴氏杆菌？包子附着的技术体系(Brown.S.M.，Smark.G.C.Jr.1985.RootpenetrationbyMeloidogyneincognitajuvenilesinfectedwithBacilluspenetrans.JournalofNematology17:123—126;Cha皿er.A.G.，andS.R.Gowen.1988.PreliminarystudiesonthepotentialofPasteuri即enetranstocontrolMeliodogynespecies.Proceedingsofbrightoncropprotectionconference,pestsanddiseases.Surrey,England:TheBritishCropProtectionCouncil;Verdejo.S.，andB.A.Jaffee.1988.ReproductionofPasteuriapenetransinatissue—culturesystemcontainingMeloidogynejavanicaandAgrobacteriumrhizogenes-transformedroots.Phytopathology8:1284-1286)。此外，2006年Gomathi等人试验比较了四种不同植物活体繁殖穿剌巴氏杆菌的效率(Gomathi.C.，咖ar.S.，Subramanian.S.EffectofhostplantonmassproductionofPasteuriapenetrans.IndianJournalofNematology.NematologicalSocietyofIndia,NewDelhi,India:2006.36:2,297-299)。综述以上研究，国内外对活体扩繁中的接种体系并未展开系统的研究。本发明拟通过对根结线虫的寄主品种、接种量、接种次数、接种时期进行筛选，优化穿剌巴氏杆菌活体繁殖体系，期望进一步提高穿剌巴氏杆菌活体繁殖的产量。
发明内容本发明提供了一种活体大量繁殖穿剌巴氏杆菌繁殖的方法。本发明所提供的穿剌巴氏杆菌活体繁殖的方法，是将附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫接种于番茄上并进行培养。其中，所述番茄选自下述番茄品种中的任意一种白果强丰、佳粉18、秦星908、毛粉802和嘉宝。上述番茄品种均可从当地蔬菜种子公司(如北京德胜种业发展有限公司)购买获得。所述根结线虫的接种量可为1000-12000条/株，优选为2000-10000条/株。具体可为2000-5000条/株、5000-10000条/株。所述接种中，对所述番茄进行接种的时期可为番茄的2-12片真叶期，优选为4-10片真叶期。所述接种中，附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫对所述番茄进行接种的次数可为1-7次，优选为2-5次。将附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫幼虫以最佳接种量在所述最佳番茄品种的最佳接种时期接种后，可先放置在最适温度条件下培养一周后再转移至温室条件下进行培养。所述最适温度条件为18°C_36"，优选为21°C_36°C;所述温室条件为15°C_40°C。上述方法中，所述番茄品种可种植在最适宜穿剌巴氏杆菌繁殖的土壤中，所述土壤具体可为砂壤土、中壤土或轻壤土，优选种植在中壤土中。所述土壤可为不同土壤肥力的土壤，具体可分为施用基肥、不施用基肥、施用基肥并追肥的土壤。所述土壤也可为施用或不施用杀线剂的土壤，具体可分为未施用杀线剂土壤、施用有机磷类杀线剂的土壤、施用氨基甲酸酯类杀线剂的土壤。上述方法中，所述穿剌巴氏杆菌是通过离心将穿剌巴氏杆菌的孢子附着在线虫上并侵染到线虫体内得到的。上述方法中，所述附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫是将根结线虫溶液和孢子溶液混合，通过离心方法获得。上述方法中，所述附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫是将根结线虫溶液和剌巴氏杆菌的孢子溶液混合后，离心得到的。所述离心的条件为3000g-9000g离心2-7min，具体可为9000g离心3min。本发明方法同样适用于穿剌巴氏杆菌(参考文献为SAYRERM，STARRMP.Pasteuriapenetrans(exThorne，1940)nom.rev.，combn，sp.n.，amycelialandendospore-formingbacteriumparasiticinplant-parasiticnematodes[J].ProceedingsoftheHelminthologicalSocietyofWashington,1985，52:149-165)种寄生其它根结线虫种的穿剌巴氏杆菌的大量繁殖，如寄生南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)等。上述穿剌巴氏杆菌均可从Pasteuriabioscience公司购得。所述线虫为根结线虫(Meloidogynespp.)(殷友琴，杨宝君，王秋丽.根结线虫病的病原鉴定[J].植物保护学报，1989，(03))，包括南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)等。所述根结线虫(Meloidogynespp.)可由中国林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)购得。本发明提供了一种大量活体繁殖穿剌巴氏杆菌技术。该技术是在筛选出活体扩繁根结线虫及穿剌巴氏杆菌的最佳寄主植物品种基础上，进一步对线虫接种量，接种时间、线虫接入次数及接入线虫后初期培养温度进行筛选，最终提高了单株番茄繁殖穿剌巴氏杆菌孢子的能力，穿剌巴氏杆菌的阳性侵染率可达40%以上，单株总产孢量可达9.0*108以上。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂商店购买得到的。实施例1、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究1、供试线虫及其分离供试线虫为南方根结线虫Meloidogyneincognita(中国林业微生物菌种保藏管理中心)。取已感染南方根结线虫的番茄植株，将番茄的根用清水洗净，放置于0.5%次氯酸钠溶液中30sec，快速搓洗，过筛，冲洗，收集南方根结线虫的卵粒于垫有3层滤纸的线虫分离器中，在室温下孵化3-4天，得到南方根结线虫二龄幼虫。2、供试菌株及其分离供试菌株为穿剌巴氏杆菌Pasteuriapenetrans(美国PasteuriaBioscience公司)。挑取被穿剌巴氏杆菌侵染的根结线虫雌虫于一离心管中，压破，释放出成熟的穿剌巴氏杆菌孢子。3、穿剌巴氏杆菌附着南方根结线虫将上述步骤(1)培养的南方根结线虫与(2)获得的穿剌巴氏杆菌孢子溶液混合，制成孢子_线虫混合液，混合液中，根结线虫的浓度为2000J2/ml，穿剌巴氏杆菌孢子的浓度为1.0X104个孢子/ml，将混合液吹打混匀后，平均分装到6个离心管中，溶液体积小于离心管体积的1/2，9000g离心3min，收集沉淀备用。随机取样在400倍显微镜下计数每条线虫体表附着的孢子数，结果表明，附着率为100%，且每条线虫体表都附着有至少一个穿剌巴氏杆菌的孢子。4、穿剌巴氏杆菌活体繁殖效率对比研究(1)将步骤3中已附着穿剌巴氏杆菌的南方根结线虫分别接种6叶期的番茄苗。(2)番茄品种为白果强丰、佳粉18和秦星908，每盆栽种1株番茄，每盆接种2000条，移入温室中，随机排列，每周浇水2-3次，并根据需要进行病虫害管理。(3)接种60天调查各个处理番茄的根重、根结级数、穿剌巴氏杆菌孢子侵染阳性率及总产孢量。结果表明(见表1)，秦星908的阳性侵染率最高为43.3%，其次为佳粉18阳性侵5染率31.3%、最低为白果强丰23.3%，且秦星908的单株番茄总产孢量为白果强丰单株总产孢量的4倍，佳粉18单株番茄总产孢量为白果强丰单株总产孢量的2倍。表1穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究重复实施例1，但进行下述修改选用实施例1步骤4(2)中番茄品种秦星908，线虫接种量分别为2000条/盆、5000条/盆、10000条/盆，其它条件不变。结果表明(见表2)，接种10000条/盆时，根结级数、卵块数、单株总产孢量与接种2000条/盆、5000条/盆都有显著性提高，但阳性率显著性降低。接种5000条/盆时，秦星908的总产孢量为6.87*107株，为接种2000条/盆总产孢量的3倍；且阳性侵染率同样显著性高于接种2000条/盆的阳性侵染率。表2穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究重复实施例1，但进行下述修改选用实施例1步骤4(2)中番茄品种秦星908，将线虫的接种量改为5000条/盆，将线虫接种时间分别改为番茄4叶期、6叶期、10叶期，其它条件不变。结果表明(见表3)，接种时期对根结级数及穿剌巴氏杆菌阳性侵染率无显著性影响，但影响番茄根系大小，10叶期接种附有穿剌巴氏杆菌的根结线虫的根系最大，但单株产孢量与6叶期接种无显著性差异，番茄4叶期接种单株产孢量最低，仅为5.34*107株。表3穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究重复实施例l，但进行下述修改选用实施例1步骤4(2)中番茄品种秦星908，将线虫的接种量改为5000条/盆，分为1次、2次、5次接种植物根系周围，每次接种间隔时间为2天，其它条件不变。结果表明(见表4)，与接种l次相比，5000条线虫分2次接种番茄根系可对番茄造成同等程度伤害，包括根结级数、每棵根上卵块数都无显著性差异，但分2次接种时穿剌巴氏杆菌阳性侵染率和单株产孢量显著性增高；5000条线虫分5次接种后，穿剌巴氏杆菌的阳性侵染率可显著性增高，但与分2次接种相比，单株番茄总产孢量和单株番茄根系卵块数显著性降低。表4穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例5、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究重复实施例1，但进行下述修改选用实施例1步骤4(2)中番茄品种秦星908，将线虫的接种量改为5000条/盆，接种后分别放在21-24t:、27-3(TC、33-36t:条件下培养一周后转移至温室条件下15°C-401:中，其它条件不变。结果表明(见表5)，接种后先在27-3(TC条件下培养可显著性提高穿剌巴氏杆菌的阳性侵染率，33-36°C条件下单株产孢量最高，但与27-30°C条件下单株产孢量差异不显著，比较温度对线虫侵染寄主根系能力，21-24t:、27-3(rC、33-36t:条件与28。C条件无显著性差异。表5穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例6、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究重复实施例1，但进行下述修改选用实施例1步骤4(2)中番茄品种秦星908，分别种植在砂壤土、中壤土、轻壤土中，将线虫的接种量改为5000条/盆，其它条件不变。结果表明(见表6)，中壤土中番茄根系显著性大于轻壤土、砂壤土中番茄根系，且穿剌巴氏杆菌的阳性侵染率和单株总产孢量同样显著性高于轻壤土、砂壤土中穿剌巴氏杆菌的阳性侵染率和单株总产孢量，砂壤土中阳性侵染率和单株产孢量最低。表6穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果土壤质地根重(g)根结级数阳性率(％)总产孢量*io7株轻壤土19.03±2.956.05±0.5534.7±3.87.84±0.63中壤土28.43±7.405.75±0.4537.3±2.78.26±0.70砂壤土19.26±6.486.25±0.7531.3±3.47.15±0.63实施例7、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究重复实施例1，但进行下述修改选用实施例1步骤4(2)中番茄品种秦星908，分别种植在不施用基肥土壤、施用基肥土壤、施用基肥土壤并追肥土壤中，将线虫的接种量改为5000条/盆，其它条件不变。结果表明(见表7)，施用基肥可以促进根的生长发育，根系显著性大于未施用基肥的番茄根系大小，但施用基肥及追肥不影响穿剌巴氏杆菌的阳性侵染率及单株总产孢表7穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果土壤肥力根重(g)根结级数阳性率(％)总产孢量*io7株不施用基肥32.2±4.17.25±0.4622.5±6.05.44±0.63施用基肥40.6±4.07.00±020.0±4.05.62±0.70施基肥并追肥65.2±7.47.50±0.5320.9±6.05.83±0.70实施例8、穿剌巴氏杆菌大量活体繁殖效率对比研究1、供试土壤供试土壤为田间未施用杀线剂的土壤，温室中施用杀线剂福气多(青岛德地得农化产品营销有限公司)的土壤及施用丁硫克百威(恒大百盛生物科技发展有限公司)的土壤。2、分别称取上述土壤308，加入1.0*105个穿剌巴氏杆菌孢子，混匀，所得土壤即为含有穿剌巴氏杆菌孢子的施用杀线剂和未施用杀线剂的土壤。3、向上述所得土壤中分别加入2000条新孵化的南方根结线虫二龄幼虫，室温条8件下放置3天。4、采用悬浮离心法分离上述土壤中的二龄幼虫，并在显微镜下记录每条线虫体表孢子数和被孢子附着的线虫数。结果表明(见表8)，土壤中施用杀线剂福气多或丁硫克百威不影响孢子附着线虫的能力，比较施用杀线剂和未施用杀线剂土壤中线虫体表孢子数、线虫体表孢子附着率都无显著性差异。表8穿剌巴氏杆菌活体繁殖对比实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通过上述实施例1-8的实验，结果表明，本发明方法通过对线虫寄主植物的筛选、接种时期和接种量的选择、接种次数优化、土壤质地和接种后培养温度的筛选，有效地提高了穿剌巴氏杆菌的活体繁殖量。权利要求一种穿刺巴氏杆菌活体繁殖的方法，是将附着穿刺巴氏杆菌的根结线虫接种于番茄上并进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述番茄选自下述番茄品种中的任意一种白果强丰、佳粉18、秦星908、毛粉802和嘉宝。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述根结线虫的接种量为1000-12000条/株，优选为2000-10000条/株。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述接种中，对所述番茄进行接种的时期为番茄的2-12片真叶期，优选为4-10片真叶期。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述接种中，附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫对所述番茄进行接种的次数为1-7次，优选为2-5次。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述培养的方法是将接种后的番茄先放置在最适温度条件下培养一周后，再转移至温室中进行培养；所述最适温度条件为18°C-36。C，优选为21°C-36°C;所述温室的温度为15°C_40°C。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述番茄种植在砂壤土、中壤土或轻壤土中，优选种植在中壤土中。8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫是将根结线虫溶液和剌巴氏杆菌的孢子溶液混合后，离心得到的。9.根据权利要求8中任一所述的方法，其特征在于所述离心的条件为3000g-9000g离心2-7min，优选为9000g离心3min。10.根据权利要求1-9中任一所述方法，其特征在于所述穿剌巴氏杆菌(Pasteuriapenetrans)为寄生于根结线虫的所有穿剌巴氏杆菌菌株；所述根结线虫(Meloidogynespp.)为根结线虫属中的任意一种根结线虫。全文摘要本发明公开了一种活体大量繁殖穿刺巴氏杆菌的方法。该方法是将附着穿刺巴氏杆菌的根结线虫接种于番茄上并进行培养。本发明的方法在筛选出活体扩繁根结线虫及穿刺巴氏杆菌的最佳寄主植物品种基础上，进一步对线虫接种量，接种时间、线虫接入次数及接入线虫后初期培养温度进行筛选，最终提高了单株番茄繁殖穿刺巴氏杆菌孢子的能力，穿刺巴氏杆菌的阳性侵染率可达40％以上，单株总产孢量可达9.0×108以上。文档编号C12R1/01GK101735972SQ20101003375公开日2010年6月16日申请日期2010年1月8日优先权日2010年1月8日发明者何强,刘倩,卜祥霞,简恒,陈忠孝申请人:中国农业大学