专利名称：Sx1近交系小鼠的dna分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA序列，具体涉及山西省自行培育的SX1近交系小鼠微卫星(SSR) 位点DNA分子标记及其应用。
背景技术：
实验动物在生物医学和科学研究领域的应用日益广泛，实验动物的标准化问题也 亟待解决。预先了解不同品系或近交系的遗传纯度及背景信息，对于实验材料的选取和实 验结果分析都有很大帮助。国内外针对近交系实验动物的遗传质量控制均制定了相应的检 测标准，但检测方法多集中于形态学、染色体及蛋白水平。对于毛色相同的小鼠形态学鉴定 较为困难，而染色体和蛋白水平的鉴定所需样本量大，对饲养成本较大的近交系小鼠难以 普及应用。
发明内容
本发明的目的是从小鼠基因组中克隆出SXl近交系小鼠特异的SSR位点，并用于 SX1近交系小鼠鉴定。 本发明通过大量筛选SSR分子标记，获得4个SX1近交系小鼠的SSR位点特征性 DNA条带，经对其克隆、测序和同源比较，确定D2Mitl7，D9Mitl8，D12Mit136和DXMitl86四 个位点的特征性DNA序列，这些位点DNA序列可作为分子遗传学标记，用于SX1近交系小鼠 鉴别。 本发明获得的SX1近交系小鼠DNA分子标记，由核苷酸序列1、序列2、序列3和序 列4组成(见序列表)。 本发明发现该小鼠在4个位点D2Mitl7， D9Mitl8， D12Mitl36和DXMitl86的微卫 星片段长度与两个国际标准品系BALB/c和C57BL/6在这些位点的片段长度不一致。经进 一步的克隆、测序，获得SX1近交系小鼠在这些位点的特征性序列信息D2Mitl7包含28个 TG重复单元和19个AG重复单元；D9Mitl8包含20个GT重复单元；D12Mit136包含28个 CA重复单元；DXMitl86包含23个CA重复单元。 用4个SSR位点引物来扩增小鼠尾尖基因组DNA样本，经8%非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(PAGE)筛选，克隆测序，若获得4个特征性序列，为SX1近交系小鼠。
这4个SSR位点引物如下
D2Mitl7 上游弓|物AGGCAATTACAAGGCCTGG
下游弓|物CACCCATCTCCCTCAGTCAT
D9Mitl8 上游弓|物TCACTGTAGCCCAGAGCAGT
下游弓|物CCTGTTGTCAACACCTGATG
D12Mitl36
上游引物TTTAATTTTGAGTGGGTTTGGC 下游引物TTGCTACATGTACACTGATCTCCA DXMH186 上游弓I物ATCAATGCATAGTATTTGGGCC 下游引物AATTTGTCACTGCGGGTAGG 本发明克服了常规形态标记，细胞标记及生化标记鉴定方法的不足，提供了对实 验动物小鼠快速、准确鉴定的分子标记方法。
具体实施例方式
实施例1SX1近交系小鼠SSR位点DNA分子标记序列获得及应用
1、采用常规酚_氯仿法提取SX1近交系小鼠及两个标准品系BALB/c， C57BL/6 尾尖总基因组DNA。即剪取小鼠尾尖2-3mm，9g/L生理盐水洗净，剪碎，加入360ii1 TES， 40ii 110% SDS，4ii 1 Proteinase K(20mg/ii 1) ， 4 ii 1 RNase (10mg/ii 1)，充分混匀后，55°C 消化过夜。加入等体积饱和酚(pH7. 6)缓慢混匀20min。 10， 000r/min离心10min。取上清液 于另一EP管中，加入等体积酚氯仿异戊醇(25 : 24 : 1)缓慢抽提20min， 10， OOOr/min 离心10min。取上清液于另一EP管中，加入等体积氯仿异戊醇(24 : 1)缓慢抽提20min， 10， OOOr/min离心10min。取上清液于另一 EP管中，加入2倍体积预冷无水乙醇-2(TC放置 2h。 10， OOOr/min离心5min。 DNA沉淀于管底，用70%预冷乙醇洗涤2次。37。C烘干。溶 于适量TE。 2、参照相关数据库Mouse Genome Database (http//www. informatics, jax. org)， 获得19对微卫星引物并由上海英潍捷基生物有限公司合成。 3、PCR反应体系优化。本发明采用梯度PCR法对PCR反应体系和循环程序进行优 化。PCR循环体系为94。C预变性3min后，经94。C 45s，50_65°C lmin，72。C 90s，循环40次， 最后72"延伸10min， l(TC保存。 4、 PCR产物的检测。用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)经溴化乙锭染色 后，凝胶呈象做进一步的分型验证。根据聚丙烯酰胺凝胶上DNA泳动距离进行结果判读，泳 动距离最长的带设定英文字母a，依次为b， c， d……。若发现SX1在某一 SSR位点的扩增片 段与两标准品系不同。就将该位点的PCR扩增产物回收。 5、PCR产物回收。依据以上方法选择回收4个微卫星位点的扩增产物，应用DNA胶 回收试剂盒回收PCR产物。 6、应用DNA重组技术回收克隆DNA序列。将回收产物插入pGEM-T easy vector, 转化大肠杆菌进行克隆，酶切验证后送往北京奥科生物公司测序，进一步对序列在NCBI上 做Blast分析。 (1)在0. 5ml低DNA结合力的离心管中按照T载体说明将回收DNA条带与T载体 连接，具体连接步骤如下10iil反应体系中含有5ii1 T4 DNA连接酶2X快速连接缓冲液， lii lpGEM-T Easy vector (50ng) ， 3 ii 1 PCR产物，lii 1 T4 DNA连接酶(3Weiss/ii 1)。用移 液器吹打连接反应液使之混匀，4t:孵育过夜，待用。 [OOSO] (2)转化反应和细菌培养 1)从-7(TC冰箱中取出50iU感受态细胞DH5a ，冰水解冻，轻掸管壁以混匀细胞； 2)短暂离心连接反应管(4，000g，30s)，取一半体积的连接反应物于解冻后的感
受态细胞中，轻掸混匀，冰水浴30min ; 3)取出离心管，于42t:水浴50-90s ; 4)冰水浴2min ; 5)离心管中加入950 ii 1 SOC液体培养基； 6)37t:，温和地振摇1. 5h(150转/分)，使细菌复苏，并使质粒编码的抗性基因表 达； 7) 1， OOOg，常温10min离心，倒去绝大部分上清液(留存150 iU左右)，重新温 和地悬浮细菌，涂于预先处理好的平板培养基上(提前半小时涂lOOiU 100mM IPTG和 20 ii 150 ii g/ml X-gal于平板培养基中)。待吸收后倒置放入37。C烘箱中，16h左右观察蓝、 白菌落，可置4t:短期保存待用； 8)取经灭菌的试管若干，加入约4ml左右的液体LB培养基(含0.1%氨苄抗生 素)； 9)用灭菌牙签小心挑取白色菌落，丢于试管中；
10) 37°C ， 250转/分振荡培养过夜，至溶液混浊。 (3)应用酶切鉴定法进一步鉴定阳性克隆子。方法与步骤质粒回收，经蓝白斑和 氨苄筛选，重组质粒扩大培养，采用上海华舜生物工程有限公司的产品小量质粒快速抽提 纯化试剂盒按照其步骤回收质粒；将获得的质粒用EcoR I进行酶切鉴定，10ul的酶切体 系中含有lul 10Xbuffer，5ul PCR product,0. 208ul EcoR I (12U/ul)和3. 792ul H20。 37t:温浴120min，取5ul用于1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切的DNA片段长度与回 收是DNA片段长度相一致的确定为阳性克隆。 (4)将含有目的片段的菌液约1. 5ml送往北京奥科生物公司进行测序。在获得的 DNA序列两端找到PCR扩增时采用的特异引物序列，进一步确定阳性克隆的真实性。
7、序列分析。对获得的DNA序歹lj，在NCBI网站Mouse Genome Resources中进行 BlastN搜索，确定为SX1小鼠微卫星位点序列。
8、 SSR位点序列用于SX1近交系小鼠鉴定 (1)参照相关数据库Mouse Genome Database (http//www. informatics, jax. org) 获得4个微卫星位点引物(D2Mitl7， D9Mitl8， D12Mitl36和DXMitl86)。这4个微卫星位
点引物如下 D2Mitl7 上游引物AGGCAATTACAAGGCCTGG 下游引物CACCCATCTCCCTCAGTCAT D9Mitl8 上游引物TCACTGTAGCCCAGAGCAGT 下游弓|物CCTGTTGTCAACACCTGATG D12Mitl36 上游引物TTTAATTTTGAGTGGGTTTGGC 下游引物TTGCTACATGTACACTGATCTCCA
DXMitl86 上游引物ATCAATGCATAGTATTTGGGCC 下游引物AATTTGTCACTGCGGGTAGG (2)采用常规酚-氯仿法提取SXl近交系小鼠尾尖总基因组DNA，利用PCR法 获得以上4个SSR位点的PCR产物。PCR循环体系为94。C预变性3min后，经94。C 45s， 57-61°C lmin(D2Mit17， DXMitl86， 57°C ;D9Mitl8，6rC ;D12Mit136， 59°C )，72°C 90s，循环 40次，最后72。C延伸10min，l(TC保存。 将PCR产物回收，进行DNA重组，克隆转化及测序。如果获得如下特征性的序列片 段即为SX1近交系小鼠。D2Mitl7扩增片段长度233bp，序列特征(TG)28(AG)19 ;D9Mitl8 扩增片段长度206bp，序列特征(GT)20 ;D12Mitl36扩增片段长度194bp，序列特征(CA) 28 ; DXMitl86扩增片段长度112bp，序列特征(CA)23。因此这4个微卫星位点可作为SX1小鼠 鉴定。 SEQUENCE LISTING 〈110〉山西大学 〈120>SX1近交系小鼠的DNA分子标记及其应用 〈160>4 〈210>1 〈211>233 〈212>DNA 〈213>SX1近交系小鼠SSR位点D2Mi "7的DNA序列 〈400〉 1 aggcaattec aaggcctggg agatggtcte aactttecag tttctcggct ggtgtggatg 60 ccctcacaaa cattcteagt gaatctegat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 120 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtg卿g3 g卿g卿g3 g卿g卿g3 g卿g卿g3 180 g3ggg卿g3 ggg卿gttc 3ggtg3tg朋g卿tgEictg郷g卿tgg gtg 233 〈210>2 〈211>206 〈212>DNA 〈213>SX1近交系小鼠SSR位点D9Mitl8的DNA序列 〈400>2 tcactgtagc ccagagcagt catttctctt tcaaattegg tggcatttte tcctttegte 60 cttetcateg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgte tgtgtgtgtg 120 tgtg朋ggtg cacatec朋g 3gtgtecatt tgcatgtgga atcteagtgt tgacatcagg 180 tgatgacatc aggtgttgac aacagg 206 〈210>3 〈211>194 〈212>DNA 〈213>SX1近交系小鼠SSR位点D12Mitl36的DNA序列 〈400>3
tttaattttg agtgggtttg gctcgcttta tctetctetc tetctetcte tctetctatc 60 tatctetcte tctetctatc tetcteatct atctetctec acacacacac acacacacac 120 acacacacac acacacacac acacacacac acacatetet atgttcaact tggagatcag 180 tgtecatgta gcaa 194 〈210〉4 〈211>112 <212>DNA 〈213〉SX1近交系小鼠SSR位点DXMitl86的DNA序列 〈400〉4 atcaatgcat agtetttggg cctecattag tgtttccccc aacacacaca cacacacaca 60 cacacacaca cacacacaca cacacacaga gttgatccte cccgcagtga ca 11权利要求
一种SX1近交系小鼠DNA分子标记，其特征在于由核苷酸序列1、序列2、序列3和序列4组成。
2. 如权利要求1所述的SXl近交系小鼠DNA分子标记在鉴定SXl近交系小鼠中的应用o
全文摘要
本发明通过筛选SSR分子标记，获得山西省自行培育的SX1近交系小鼠特异的4个SSR位点条带，经对其克隆、测序和同源比较，获得该小鼠4个SSR位点的DNA序列，该序列可作为分子遗传学标记，用于SX1近交系小鼠的鉴定。本发明克服了常规形态标记，细胞标记及生化标记鉴定方法的不足，提供了对实验动物小鼠快速、准确鉴定的分子标记方法。
文档编号C12N15/11GK101709334SQ20101003334
公开日2010年5月19日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者任连生, 张建珍, 张建琴, 杨美玲, 闻建华, 马恩波 申请人:山西大学