专利名称：：用蛋白酶水解法制备高铁含量血红素多肽复合物方法
技术领域：
：本发明涉及血红素多肽复合物的方法，尤其是提供一种用蛋白酶水解制备高铁含量血红素多肽复合物的水解法，属生物工程
技术领域：
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背景技术：
：血红素是含铁的卟啉(铁卟啉)化合物，是血液红细胞所含血红蛋白的重要组成成分。血红蛋白是血红素的结合蛋白，其血红素是通过铁原子以配价键与珠蛋白的组氨酸残基(配位体)结合，形成结合蛋白质。血红素可以直接被小肠吸收，不受植物性食物所含的妨碍铁离子吸收的物质的影响，其吸收利用率要比无机铁盐及植物性食物所含铁离子高得多。动物血是血红素的丰富来源，但要在胃肠道内将蛋白质消化，血红素释出后才能吸收利用。传统用化学方法从血液中提取血红素，可得纯度高的氯化血红素，是结晶化合物，但不溶于酸性水溶液，难于吸收。
发明内容本发明提供一种用蛋白酶水解制备高铁含量血红素多肽复合物，克服了传统化学法提取的血红素制品不溶于酸性水溶液的缺点。本发明还公开了上述血红素多肽复合物的制备方法，具有工艺简单，容易控制等优点，制成含铁量较高亲水性强的血红素多肽。本发明提供的用蛋白酶两次水解制备高铁含量血红素多肽复合物方法，可以通过以下技术方案制得将动物血加水或稀酸调到pH3-7，加入蛋白酶，在搅拌下保温将血红蛋白水解，水解10-48小时，使化学反应达到平衡，停止保温，高速离心弃去不沉淀的氨基酸和小肽，收集沉淀物，即得血红蛋白第一次水解产物，为分子量较大的血红素多肽。根据化学平衡原理，分离氨基酸及小肽后继续加酶水解，即可打破原来的平衡状态，趋向新的平衡，得到更彻底的水解产物，即含铁量更高的、分子量更小的血红素多肽复合物，满足软胶囊生产原料的要求。若水解时应用两种不同的蛋白酶，如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，由于酶的作用特异性不同，水解肽链的位点不完全一致，相互补充，则水解的效果更佳，更容易获得较小分子量的血红素多肽产物。本发明高铁含量血红素多肽复合物的制备方法，包括以下步骤将动物血加等量水或稀盐酸调到pH3-7，加入蛋白酶(每公斤加入1-4克)，在搅拌下保温将血红蛋白水解，水解10-40小时，停止保温，离心收集沉淀物，加热烘干后粉碎，得血红素多肽粗提物；将血红素多肽粗提物加水1-5倍，加等量水或稀盐酸调到pH3-7，再加蛋白酶(每公斤加入1-4克)保温水解，水解10-40小时，停止保温，高速离心收集沉淀物，加热烘干后粉碎，即得浓縮血红素多肽产物。本发明涉及的动物血是指猪血或其他屠宰动物的血液。本发明涉及的蛋白酶包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意一种或双酶联用。3本发明方法制得的血红素多肽复合物，可使血红素有亲水多肽的结合，通过用盐析、等电点沉淀、三氯乙酸沉淀等方法处理，都不能将血红素和多肽分离，说明血红素多肽是相当稳定的复合物而不是简单的混合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>亲水性质保证血红素铁在肠道里的消化吸收，多肽含有大量氨基和羧基等亲水基团，是亲水性物质，它的结合使不溶于水的血红素转变为可溶于酸性水溶液的物质，即血红素与多肽结合而成的亲水复合物。本发明的积极效果在于采用两次蛋白酶水解血红蛋白，血红素与蛋白水解产生的肽类结合成血红素与多肽的复合物(血红素多肽)，这种复合物的结合相当牢固，不易将它们分离开来，两次酶水解能够实现血红素多肽中的肽类更进一步分解，提高了血红素多肽中血红素含量，降低了多肽的含量，血红素铁含量高；由于血红素有亲水的多肽的结合和覆盖，使复合物具有一定的亲水性，易溶于胃酸、醋酸等酸性溶液，容易消化吸收。而且应用高速离心技术可简便地将血红素多肽分离，使得血红素多肽能够制成制备胶囊剂的原料，满足生产的需要。具体实施例方式实施例1取10kg新鲜猪血加等量水溶血，加热至沸，冷却至摄氏40度，加入木瓜蛋白酶20克，摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎即得第一次水解产物。然后加两倍重量的水搅拌，再加入木瓜蛋白酶20克，保持摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎，即得铁含量较高的血红素多肽的第二次水解产物。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>实施例2取10kg新鲜猪血加等量水溶血，加热至沸，冷却至摄氏40度，加入木瓜蛋白酶40克，摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎即得第一次水解产物。然后加两倍重量的水搅拌，再加入木瓜蛋白酶40克保持摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎，即得铁含量较高的血红素多肽粉。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例3取10kg新鲜猪血加等量水溶血，加热至沸，冷却至摄氏40度，加入木瓜蛋白酶10克，摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎即得第一次水解产物。然后加两倍重量的水搅拌，再加入木瓜蛋白酶10克保持摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎，即得铁含量较高的血红素多肽粉。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例4取10kg新鲜猪血加等量水溶血，加热至沸，冷却至摄氏40度，加入木瓜蛋白酶20克，摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎即得第一次水解产物。然后加两倍重量的水搅拌，再加盐酸调PH3，加入胃蛋白酶20克，保持摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，加碳酸钠调至pH5.0，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎，即得铁含量更高的血红素多肽粉。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例5取10kg新鲜猪血加等量水溶血，加热至沸，冷却至摄氏40度，加入木瓜蛋白酶40克，摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎即得第一次水解产物。然后加两倍重量的水搅拌，再加盐酸调PH3，加入胃蛋白酶40克，保持摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，加碳酸钠调至pH5.0，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎，即得铁含量更高的血红素多肽粉。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例6取10kg新鲜猪血加等量水溶血，加热至沸，冷却至摄氏40度，加入木瓜蛋白酶10克，摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎即得第一次水解产物。然后加两倍重量的水搅拌，再加盐酸调PH3，加入胃蛋白酶10克，保持摄氏40度下搅拌20小时。停止加热保温，加碳酸钠调至pH5.0，高速离心收集浆状沉淀物，烘干粉碎，即得铁含量更高的血红素多肽粉。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果说明实施例4、5、6的先木瓜蛋白酶后胃蛋白酶的效果最佳，两次木瓜蛋白酶的实施例1、2、3的效果最差；无论何种方式，两次酶水解的效果都优于一次酶水解。权利要求一种用蛋白酶两次水解制备高铁含量血红素多肽复合物，可以通过以下方法得到将动物血加等量水或稀盐酸调到pH3-7，加入蛋白酶(每公斤加入1-4克)，在搅拌下保温将血红蛋白水解，水解10-40小时，停止保温，离心收集沉淀物，加热烘干后粉碎，得血红素多肽粗提物；将血红素多肽粗提物加水1-5倍，加等量水或稀盐酸调到pH3-7，再加蛋白酶(每公斤加入1-4克)保温水解，水解10-40小时，停止保温，高速离心收集沉淀物，加热烘干后粉碎，即得浓缩血红素多肽产物。2.根据权利要求1所述高铁含量血红素多肽复合物的制备方法，包括以下步骤将动物血加等量水或稀盐酸调到pH3-7，加入蛋白酶(每公斤加入1-4克)，在搅拌下保温将血红蛋白水解，水解10-40小时，停止保温，离心收集沉淀物，加热烘干后粉碎，得血红素多肽粗提物；将血红素多肽粗提物加水1-5倍，加等量水或稀盐酸调到pH3-7，再加蛋白酶(每公斤加入1-4克)保温水解，水解10-40小时，停止保温，高速离心收集沉淀物，加热烘干后粉碎，即得浓縮血红素多肽产物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于动物血是指猪血或其他屠宰动物的血液。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于蛋白酶包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意一种或双酶联用。全文摘要本发明公开一种用蛋白酶两次水解法制备高铁含量血红素多肽复合物，用两次酶水解血液制备血红素多肽的方法，水解蛋白质产生的多肽包裹血红素，形成血红素多肽复合物；采用两次蛋白酶水解血红蛋白，血红素与蛋白水解产生的肽类结合成血红素与多肽的复合物(血红素多肽)，这种复合物的结合相当牢固，不易将它们分离开来，酶水解能够实现血红素多肽中的肽类更进一步分解，提高了血红素多肽中血红素含量，降低了多肽的含量，血红素铁含量高；由于血红素有亲水的多肽的结合和覆盖，使复合物具有一定的亲水性，易溶于胃酸、醋酸等酸性溶液，容易消化吸收。文档编号C12P21/06GK101748181SQ20101003083公开日2010年6月23日申请日期2010年1月15日优先权日2010年1月15日发明者岳海涛,王友联,谢海泉,麦荫乔申请人:白求恩医科大学制药厂