专利名称：一种活体磁性微生物的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物和生物制造领域，具体涉及微生物磁化技术方法。
背景技术：
生物制造是将生命科学、材料科学以及生物技术融入到制造学科中，是微纳米制 造技术和生命科学交叉产生的一门新兴学科。它包括仿生制造、生物质和生物体制造，运用 现代制造科学和生命科学的原理和方法，通过细胞或微生物的受控三维加工和组装，制造 新材料、器件及生物系统。生物制造为微纳制造技术提供了一类全新的制造手段，扩展了传 统制造领域的边界和范畴。生物制造的本质是以生物作为完成制造过程的主体，在微纳米尺度通过生物的受 控自组装自装配构成各种微结构。主要包括对DNA、蛋白质、多糖等生物大分子进行有序操 纵；对微生物定向诱导或有序排列，利用其天然结构及功能开发新型功能材料；以及通过 细胞受控组装，完成具有新陈代谢特征的生命体成型和制造。微生物是地球上最古老的生命体，包括细菌、真菌、病毒等，种类繁多，形态与生物 学功能各异，其个体大小从几十纳米到微米级，具有极强的生命力和适应性，能够以较低成 本进行大批量培养，在微纳米加工领域具有极大的应用潜力。另外，利用微生物进行材料 加工是低能耗、节约土地及自然资源、保护环境的绿色工艺过程，还可定向培育新品种，因 此是天然的可用于纳米、微米及多层次跨尺度加工的“基本单元”。以微生物为分子组装的 机器，以微纳米尺度的过程控制方法对其进行二维数字定位以及图案化排列或者三维微操 纵，由此可设计创制出具有特定功能的新材料。其关键是以合适的方法控制微生物群体的 定向运动与有序排列，进而才能够利用其天然生物学功能完成自装配、有序组装等过程。目前能够用于生物制造过程控制的微纳米制造方法主要有机械作用喷射技术、直 写技术、电纺丝技术等。而这其中大多数方法不能应用于对微生物活细胞的控制，主要是因 为其控制条件不够温和，不能保证在整个控制过程中微生物个体的存活以及生物学功能的 完整。发明人提出了活体磁性微生物的新概念，是指人工构建的在外加磁场下可以进行 趋磁性运动的活性微生物。它将可用于建立一种用磁场来控制微生物的生物制造过程控制 方法，这在生物制造领域尚属空白。磁控方法相较于其他过程控制方法具有条件温和、可操 作性强、精细程度高、能进行定向或定域控制、可以进行动态控制以及容易与其它过程控制 方法结合使用等优点。趋磁细菌是天然的磁性微生物。专利号US2006073540-A1的美国专利 "Controlling of micro-object (s)involves modifying the orientation of magneticfield to modify the displacement path of magnetotactic bacterium，，曾 涉及到一种通过改变磁场取向从而对微米级的物体进行控制的方法，该发明建立了一种 基于趋磁细菌的系统，即通过将微米级的物体与趋磁细菌偶联从而使该系统具有磁响应， 进而运用磁场控制。但是趋磁细菌生物量小，必须在苛刻的条件下培养，并且不同生物
5制造过程对微生物功能和形态的要求各异，因此需要建立简便易行而又对不同菌种有广 泛适用性的方法，来人工构建磁性微生物。申请日2002. 10. 11，申请号02130836. 5的中 国专利申请文件“以微生物细胞为模板的空心金属微粒及其制备方法”曾涉及到一种以 微生物细胞为模板的空心金属微粒及其制备方法，它是利用不同几何外形的微生物细胞 为模板，通过化学镀方法在其表面沉积金属层或合金镀层，来制备成轻质空心金属导电 或磁性微粒，但是这种方法将使微生物致死，且其所制备的只能是金属微粒，而不能在生 物制造领域进一步应用于组装生物材料、生物器件。专利号JP2005349254-A的日本专 利“Moving a minuteobject(e. g. a microorganism)bound to or containing magnetic microparticles， comprises moving a magnetic probe to move the object on a substrate”曾涉及到一种利用磁针引导结合或含有磁性微粒的微小物体进行重排列的方 法，该发明可用于研究细胞的行为或细胞与微生物间的相互作用等，但该发明没有涉及到 在微生物表面或内部导入磁性微粒的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活体磁性微生物的制备方法。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种活体磁性微生物的制备方法，包括以下步骤(1)按常规方法活化培养待磁化微生物。(2)对于细胞表面带负电荷的微生物，将聚阳离子和聚阴离子交替吸附在经活化 培养的微生物细胞表面，并使微生物细胞最外层为聚阴离子；对于细胞表面带正电荷的微 生物，则将聚阴离子和聚阳离子交替吸附在经活化培养的微生物细胞表面，并使微生物细 胞最外层为聚阴离子，得到细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液，所用的聚阳离子和聚 阴离子为对所选待磁化微生物代谢功能和细胞结构不造成破坏的聚阳离子和聚阴离子。(3)在细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液中加入CaCl2溶液和磁性纳米颗粒 水溶液，然后，再用NaOH溶液使微生物菌悬液的pH维持在弱酸性的条件下缓慢滴加Na2HPO4 溶液，使反应生成的磷酸钙沉淀均勻的沉积在微生物细胞表面，同时使磁性纳米颗粒也均 勻地掺入到磷酸钙的沉积层中。在上述步骤(2)和(3)中为使微生物细胞不至吸水涨破，涉及到的全部操作应在 0 4°C条件下进行；在上述步骤(2)和(3)中所使用的全部试剂包括去离子水、聚阳离子 溶液、聚阴离子溶液、CaCl2溶液、磁性纳米颗粒水溶液、Na2HPO4溶液及NaOH溶液，在配制时 应加入NaCl，根据所处理的微生物细胞选择适当的浓度，以维持细胞渗透压；在上述步骤 (2)和(3)中所使用的全部试剂在使用前须经过高温高压灭菌。上述步骤(1)所述的活化培养待磁化微生物的方法是选取待磁化微生物菌种， 按常规方法接种至液体培养基活化培养至微生物培养液中的细胞浓度为IO6 IO8Hir1 ；待 磁化微生物，可以是真菌或细菌，其形态可以是球状、杆状或螺旋状，其表面可以是带有正 电荷，也可以是带负电荷。活化培养待磁化微生物的常规方法可参见周德庆主编的《微生物 学实验教程》，高等教育出版社2006年第二版。上述步骤(2)所述的将聚阳离子和聚阴离子交替吸附在经活化培养的带负电荷 的微生物表面，并使微生物细胞最外层为聚阴离子的具体方法包括以下步骤
a)清洗微生物细胞表面取一定体积的活化培养后的微生物培养液转移至离心 管中，通常取5 IOmL活化培养后的微生物培养液转移至离心管中，用合适的离心转速及 离心时间离心，离心转速及离心时间根据所选微生物菌种确定，弃上清液，加入与所取活化 培养后的微生物培养液等体积的去离子水，摇勻使微生物细胞形成菌悬液，将该步骤中的 离心、弃上清液、加入等体积的去离子水、摇勻的过程重复进行1 3次；b)细胞表面聚阳离子的吸附将菌悬液离心，弃上清后加入与步骤a)中所加去离 子水等体积的质量百分比为0. 01 0. 5%的聚阳离子稀溶液，摇勻后静置10 30分钟；c)除去菌悬液中未吸附的聚阳离子将步骤b)处理过的菌悬液离心，弃上清，加 入与步骤a)中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加入去 离子水、摇勻的过程重复进行1 3次；d)细胞表面聚阴离子的吸附将步骤C)处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与步 骤a)中所加去离子水等体积的质量百分比为0.01 0.5%的聚阴离子稀溶液，摇勻后静置 10 30分钟；e)除去菌悬液中未吸附的聚阴离子将步骤d)处理过的菌悬液离心，弃上清，加 入与步骤a)中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加入去 离子水、摇勻的过程重复进行1 3次；f)聚阳离子和聚阴离子在微生物细胞表面的交替吸附将步骤b)、c)、(！)、e)依次 重复进行1 4次，得到细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液。上述步骤(2)所述的将聚阴离子和聚阳离子交替吸附在细胞表面带正电荷的微 生物表面，并使微生物细胞最外层为聚阴离子的具体方法包括以下步骤a’ )清洗微生物细胞表面取一定体积的活化培养后的微生物培养液转移至离心 管中，通常取5-10mL活化培养后的微生物培养液转移至离心管中，用合适的离心转速及离 心时间离心，离心转速及离心时间根据所选微生物菌种确定，弃上清液，加入与所取活化培 养后的微生物培养液等体积的去离子水，摇勻使微生物细胞形成菌悬液，将该步骤中的离 心、弃上清液、加入等体积的去离子水、摇勻的过程重复进行1 3次；b’ )细胞表面聚阴离子的吸附将菌悬液离心，弃上清后加入与步骤a’ )中所加 去离子水等体积的质量百分比为0. 01 0. 5%的聚阴离子稀溶液，摇勻后静置10 30分 钟；c’)除去菌悬液中未吸附的聚阴离子将步骤b)处理过的菌悬液离心，弃上清，加 入与步骤a’ )中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加入 去离子水、摇勻的过程反复进行1 3次；d’ )细胞表面聚阳离子的吸附将步骤C’ )处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与 步骤a’)中所加去离子水等体积的质量百分比为0.01 0.5%的聚阳离子稀溶液，摇勻后 静置10 30分钟；e’ )除去菌悬液中未吸附的聚阳离子将步骤d’ )处理过的菌悬液离心，弃上清， 加入与步骤a’ )中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加 入去离子水、摇勻的过程反复进行1 3次；f')将上述步骤b，)、c，)、d，)、e，)依次重复进行1 4次，并在最后一次重复 时，只依次进行步骤b’)、c’)，使细胞最外层为聚阴离子，得到细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液。上述步骤(2)所述的对所选待磁化微生物代谢功能和细胞结构不造成破坏的聚 阳离子可以是聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙烯氯化铵或阳离子聚丙烯酰胺，所述的对所 选待磁化微生物代谢功能和细胞结构不造成破坏的聚阴离子可以是聚丙烯酸钠、聚苯乙烯 磺酸钠、阴离子聚丙烯酰胺或海藻酸钠。上述步骤(3)所述的在细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液中加入CaCl2溶液 和磁性纳米颗粒水溶液，然后，在用NaOH溶液使微生物菌悬液的pH维持在弱酸性的条件下 缓慢滴加Na2HPO4溶液，使反应生成的磷酸钙沉淀均勻的沉积在微生物细胞表面，同时使磁 性纳米颗粒也均勻地掺入到磷酸钙的沉积层中的具体方法包括以下步骤g)加入待反应的CaCl2 将经过上述步骤(2)处理后的菌悬液离心，弃上清，加入 与前述清洗微生物细胞表面步骤中所加去离子水等体积的浓度为0. 005 0. 05mol/L的 CaCl2溶液，摇勻；h)加入磁性纳米颗粒向步骤g)处理过的菌悬液中加入浓度为0. 01 0. lg/L的 磁性纳米颗粒的水溶液，其体积为步骤g)所加CaCl2溶液的1/20 1/5，摇勻。所用磁性 纳米颗粒水溶液中的磁性纳米颗粒可以是Fe3O4或γ -Fe2O3，平均粒径小于50nm，磁性纳米 颗粒的水溶液的制备方法可参考文献“New technique for synthesizing iron ferrite magnetic nanosized particles, Langmuir,1997,13(15) :3927_3933，，或"Synthesis and surface engineering ofiron oxide nanoparticles for biomedical applications, Biomaterials,2005，26 (18) :3995_4021”。i)向经过步骤h)处理过的含有磁性纳米颗粒的菌悬液中缓慢滴加与步骤g)所加 CaCl2溶液体积相同的浓度为0. 005 0. 05mol/L的Na2HPO4溶液，并不停摇勻，同时用浓度 为0. 005 0. 05mol/L的NaOH溶液调节pH，使Na2HPO4溶液的整个滴加过程中pH维持在 6. 7 6. 8 ；j) Na2HPO4与NaOH溶液全部滴加完毕后，继续摇勻10 60min ；k)除去过量而未反应的试剂将步骤j)处理后的菌悬液离心，弃上清，加入与前 述清洗微生物细胞表面步骤中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、 弃上清、加入去离子水、摇勻的过程反复进行1 3次，即制得磁性微生物。基于本发明方法，本发明提供了一种人工制备的活体磁性微生物，该微生物细胞 的表面有以人工方法附着的磁性纳米颗粒，附着的磁性纳米颗粒是平均粒径小于50nm的 Fe3O4 Y-Fe2O30实验资料1.对实施例1制得的磁性酵母菌趋磁性的观察制备的磁性酵母菌样品用浓度为0.05g/L的盐酸四环素对表面Ca2+离子进行荧光 染色，并用光学显微镜(Olympus 1X71)在360 370nm紫外光下进行荧光观察。另外准备 对照组酵母菌，按照实施例1方法制备，但在制备过程中不添加磁性纳米颗粒Y-Fe2O3，同 样用盐酸四环素进行荧光染色后观察。用小磁针测试酵母细胞的趋磁性。结果显示加入小磁针后，磁性酵母菌在小磁针 附近大量聚集，呈现明亮荧光效果(图Ic)，说明该酵母菌具有良好的趋磁性；对照组酵母 菌则不会聚集于小磁针周围(图2c)。两组实验结果可以说明磁性纳米颗粒成功搭载于酵母菌表面，并使酵母菌具有趋磁性。2.对实施例1制得的磁性酵母菌存活性的证明将由实施例1制得的磁性酵母菌用小磁铁进行磁性分离纯化，4°C条件下保存于 7g/L的NaCl溶液中。存放一周后，用0. 01mol/L的盐酸溶液将磁性酵母菌悬浮液调pH值 至6，接种至液体培养基，30°C恒温摇床培养48小时。结果证明酵母菌能够良好生长，并且 在光学显微镜下观察其形态特征与普通接种的酵母菌一致。3.对实施例1制得的磁性酵母菌表面微观结构的观察用扫描电子显微镜(QUANTA200)观察磁性酵母菌的表面形貌，样品经过冷冻干燥 处理。用透射电子显微镜(FEI Tecnai G2 20 TWIN)观察磁性酵母细胞切面形貌，采用戊 二酸——锇酸双重固定法固定后进行超薄切片，以醋酸铀和柠檬酸铅染色后观察。图3显 示出了扫描电镜观察到的磁性酵母菌的整体形貌，表面有连续褶皱起伏结构。天然的酵母 菌细胞壁表面平整无褶皱(图4b)。经过实施例1处理后的酵母菌表面有明显的“锯齿”状 结构(图4a)，且细胞壁最外层部分厚度明显增加，该部分结构分布连续，较为均勻。由此可 以推断出磁性纳米颗粒已牢固附着于酵母细胞表面，这也是使细胞有趋磁性的原因。本发明公开了一种在活的微生物表面高效导入磁性纳米颗粒，获得活体磁性微生 物的制备方法。本发明方法可操作性强，对不同微生物菌种有良好的广泛适用性，制备的微 生物具有趋磁性，并且可以保持存活。活体磁性微生物是由本发明提出的新概念，活体磁性微生物是指人工构建的在外 加磁场下可以进行趋磁性运动的活性微生物。由本发明制得的磁性微生物虽然磁性不可 遗传，同时细胞的分裂增值受到了限制，但可保持活性，这为进一步探索基于微生物活细胞 的，能够发挥微生物整体生物学功能及优势的生物制造磁控过程工艺奠定了基础。通过生 物技术与微纳米技术的有机结合，以磁性微生物为微纳米机器人，用磁场控制的方法在微 纳米尺寸范围内定位操纵和有序排列活性微生物，诱发其特有的生物学功能，进行受控自 组装等生物制造过程，由此有望设计和创制一系列新型特殊功能材料和器件。
图1为试验1中所述在光学显微镜下对实施例1制得的磁性酵母菌趋磁性的观察 结果，未加磁针时，在光学显微镜下观察磁性酵母菌，图a)、b)分别为同一视野下拍摄的荧 光结果及普通结果；加入磁针后，在光学显微镜下观察磁性酵母菌，图c)、d)分别为同一视 野下拍摄的荧光结果及普通结果，结果显示加入小磁针后，磁性酵母菌在小磁针附近大量 聚集，呈现明亮荧光效果，说明该酵母菌具有良好的趋磁性；图2为试验1中所述对照实验的观察结果，未加磁针时，在光学显微镜下观察对照 组酵母菌，图a)、b)分别为同一视野下拍摄的荧光结果及普通结果；加入磁针后，在光学显 微镜下观察对照组酵母菌，图c)、d)分别为同一视野下拍摄的荧光结果及普通结果，结果 显示对照组酵母菌不会聚集于小磁针周围，与图1结果对比，两组实验结果可以说明磁性 纳米颗粒成功搭载于酵母菌表面，并使酵母菌具有趋磁性；图3为试验3中所述由实施例1制得的磁性酵母菌的扫描电镜图，显示出了扫描 电镜观察到的磁性酵母菌的整体形貌，表面有连续褶皱起伏结构；图4为试验3中所述由实施例1制得的磁性酵母菌的透射电镜图(a)，与对照组天
9然酵母菌的透射电镜图(b)，图中显示出天然的酵母菌细胞壁表面平整无褶皱，经过实施例 1处理后的酵母菌表面有明显的“锯齿”状结构，且细胞壁最外层部分厚度明显增加，该部分 结构分布连续，较为均勻，由此可以推断出磁性纳米颗粒已牢固附着于酵母细胞表面，这也 是使酵母菌有趋磁性的原因。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。以下实施例1所述步骤(2)、(3)和实施例2所述步骤(2)、(3)中涉及到的全部操 作在0 4°C条件下进行。实施例1(1)选取待磁化微生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，接种至YPD液体 培养基(蛋白胨2%，酵母粉1 %，葡萄糖2% )后30°C恒温摇床培养48h。(2)微生物细胞表面的改性处理用去离子水配制浓度为7g/L的NaCl溶液，再用 该溶液配制所有制备过程中将使用到的其他溶液，高温高压灭菌；取IOmL培养后的酵母培 养液转移至离心管中，5000rpm离心6min(实施例1中所有离心都采用此条件)，弃上清液， 加入IOmLNaCl溶液，摇勻成菌悬液，将离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻的过程反复进行 2次；将酵母菌悬液离心，弃上清后加入IOmL质量百分比为0. 的聚二烯丙基二甲基氯化 铵溶液，摇勻后静置20分钟；将菌悬液离心，弃上清，加入IOmLNaCl溶液，摇勻；将菌悬液 离心，弃上清，加入IOmL质量百分比为0. 1 %的聚丙烯酸钠溶液，摇勻后静置20分钟；将菌 悬液离心，弃上清，加入IOmLNaCl溶液，摇勻；将上述步骤离心、弃上清、加入聚二烯丙基二 甲基氯化铵溶液、摇勻、静置，离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻，离心、弃上清、加入聚丙 烯酸钠溶液、摇勻、静置，离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻，依次重复再进行1次。(3)磁性纳米颗粒在酵母细胞表面的附着将步骤(2)处理后的菌悬液离心，弃上 清，加入IOmL浓度为0. 01mol/L的CaCl2溶液，摇勻；向其中加入浓度为0. lg/L的磁性纳 米颗粒Y-Fe2O3的水溶液lmL，摇勻，所用磁性纳米颗粒水溶液中的Y-Fe2O3平均粒径为 20nm 30nm ；向含有磁性纳米颗粒的菌悬液中缓慢滴加IOmL浓度为0. 01mol/L的Na2HPO4 溶液并不停摇勻，同时用浓度为0. 01mol/L的NaOH溶液调节pH，使Na2HPO4溶液的整个滴 加过程中PH维持在6. 8 ；Na2HPO4与NaOH溶液全部滴加完毕后，继续摇勻60min ；将处理后 的菌悬液离心，弃上清，加入IOmLNaCl溶液，摇勻，将离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻的 过程再进行2次，即制得磁性酵母菌。实施例2(1)选取待磁化微生物大肠杆菌(Escherichia coli)，接种至LB液体培养基(蛋 白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%,ρΗ 7. 4)后37°C恒温摇床培养12h。(2)微生物细胞表面的改性处理用去离子水配制浓度为5g/L的NaCl溶液，再用 该溶液配制所有制备过程中将使用到的其他溶液，高温高压灭菌；取IOmL培养后的大肠杆 菌培养液转移至离心管中，6000rpm离心IOmin (实施例2中所有离心都采用此条件)，弃上 清液，加入IOmLNaCl溶液，摇勻成菌悬液，将离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻的过程反复 进行1次；将大肠杆菌菌悬液离心，弃上清后加入IOmL质量百分比为0. 05%的聚丙烯氯化 铵溶液，摇勻后静置10分钟；将菌悬液离心，弃上清，加入IOmLNaCl溶液，摇勻；将菌悬液
10离心，弃上清，加入IOmL质量百分比为0. 05%的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇勻后静置10分钟； 将菌悬液离心，弃上清，加入IOmLNaCl溶液，摇勻；将上述步骤离心、弃上清、加入聚丙烯氯 化铵溶液、摇勻、静置，离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻，离心、弃上清、加入聚苯乙烯磺 酸钠溶液、摇勻、静置，离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻，依次重复再进行2次。(3)磁性纳米颗粒在大肠杆菌细胞表面的附着将步骤(2)处理后的菌悬液离心， 弃上清，加入IOmL浓度为0. 005mol/L的CaCl2溶液，摇勻；向其中加入浓度为0. 01g/L的 磁性纳米颗粒Fe3O4的水溶液0. 5mL，摇勻，所用磁性纳米颗粒水溶液中的Fe3O4平均粒径为 IOnm 20nm ；向含有磁性纳米颗粒的菌悬液中缓慢滴加IOmL浓度为0. 005mol/L的Na2HPO4 溶液并不停摇勻，同时用浓度为0. 005mol/L的NaOH溶液调节pH，使Na2HPO4溶液的整个滴 加过程中PH维持在6. 75 ；Na2HPO4与NaOH溶液全部滴加完毕后，继续摇勻30min ；将处理后 的菌悬液离心，弃上清，加入IOmLNaCl溶液，摇勻，将离心、弃上清、加入NaCl溶液、摇勻的 过程再进行1次，即制得磁性大肠杆菌。实施例3对实施例1制得的磁性酵母菌趋磁性的观察制备的磁性酵母菌样品用浓度为0.05g/L的盐酸四环素对表面Ca2+离子进行荧光 染色，并用光学显微镜(Olympus 1X71)在360 370nm紫外光下进行荧光观察。另外准备 对照组酵母菌，按照实施例1方法制备，但在制备过程中不添加磁性纳米颗粒Y-Fe2O3，同 样用盐酸四环素进行荧光染色后观察。用小磁针测试酵母细胞的趋磁性。结果显示加入小磁针后，磁性酵母菌在小磁针 附近大量聚集，呈现明亮荧光效果，见图lc，说明该酵母菌具有良好的趋磁性；对照组酵母 菌则不会聚集于小磁针周围，见图2c。两组实验结果可以说明磁性纳米颗粒成功搭载于酵 母菌表面，并使酵母菌具有趋磁性。实施例4对实施例1制得的磁性酵母菌存活性的证明将由实施例1制得的磁性酵母菌用小磁铁进行磁性分离纯化，4°C条件下保存于 7g/L的NaCl溶液中。存放一周后，用0. 01mol/L的盐酸溶液将磁性酵母菌悬浮液调pH值 至6，接种至液体培养基，30°C恒温摇床培养48小时。结果证明酵母菌能够良好生长，并且 在光学显微镜下观察其形态特征与普通接种的酵母菌一致。实施例5对实施例1制得的磁性酵母菌表面微观结构的观察用扫描电子显微镜(QUANTA200)观察磁性酵母菌的表面形貌，样品经过冷冻干燥 处理。用透射电子显微镜(FEI Tecnai G2 20 TWIN)观察磁性酵母细胞切面形貌，采用戊 二酸——锇酸双重固定法固定后进行超薄切片，以醋酸铀和柠檬酸铅染色后观察。图3显示出了扫描电镜观察到的磁性酵母菌的整体形貌，表面有连续褶皱起伏结 构。天然的酵母菌细胞壁表面平整无褶皱，见图4b。经过实施例1处理后的酵母菌表面有 明显的“锯齿”状结构，见图4a，且细胞壁最外层部分厚度明显增加，该部分结构分布连续， 较为均勻。由此可以推断出磁性纳米颗粒已牢固附着于酵母细胞表面，这也是使细胞有趋 磁性的原因。
1权利要求
一种活体磁性微生物的制备方法，包括以下步骤(1)按常规方法活化培养待磁化微生物；(2)对于细胞表面带负电荷的微生物，将聚阳离子和聚阴离子交替吸附在经活化培养的微生物细胞表面，并使微生物细胞最外层为聚阴离子；对于细胞表面带正电荷的微生物，则将聚阴离子和聚阳离子交替吸附在经活化培养的微生物细胞表面，并使微生物细胞最外层为聚阴离子，得到细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液，所用的聚阳离子和聚阴离子为对所选待磁化微生物代谢功能和细胞结构不造成破坏的聚阳离子和聚阴离子。(3)在细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液中加入CaCl2溶液和磁性纳米颗粒水溶液，然后，再用NaOH溶液使微生物菌悬液的pH维持在弱酸性的条件下缓慢滴加Na2HPO4溶液，使反应生成的磷酸钙沉淀均匀的沉积在微生物细胞表面，同时使磁性纳米颗粒也均匀地掺入到磷酸钙的沉积层中。
2.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的待磁化微 生物，可以是真菌或细菌。
3.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的待磁化微 生物，是表面带有正电荷的或负电荷的微生物。
4.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的待磁化微 生物，其形态可以是球状、杆状或螺旋状。
5.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的活化培养 待磁化微生物的方法是选取待磁化微生物菌种，按常规方法接种至液体培养基活化培养 至微生物培养液中的细胞浓度为IO6 IO8Hir1 ；
6.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的将聚阳离 子和聚阴离子交替吸附在经活化培养的带负电荷的微生物表面，并使微生物细胞最外层为 聚阴离子的具体方法包括以下步骤a)清洗微生物细胞表面取一定体积的活化培养后的微生物培养液转移至离心管中， 用合适的离心转速及离心时间离心，弃上清液，加入与所取活化培养后的微生物培养液等 体积的去离子水，摇勻使微生物细胞形成菌悬液，将该步骤中的离心、弃上清液、加入等体 积的去离子水、摇勻的过程重复进行1 3次；b)细胞表面聚阳离子的吸附将菌悬液离心，弃上清后加入与步骤a)中所加去离子水 等体积的质量百分比为0. 01 0. 5%的聚阳离子稀溶液，摇勻后静置10 30分钟；c)除去菌悬液中未吸附的聚阳离子将步骤b)处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与 步骤a)中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加入去离子 水、摇勻的过程重复进行1 3次；d)细胞表面聚阴离子的吸附将步骤c)处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与步骤a) 中所加去离子水等体积的质量百分比为0.01 0.5%的聚阴离子稀溶液，摇勻后静置10 30分钟；e)除去菌悬液中未吸附的聚阴离子将步骤d)处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与 步骤a)中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加入去离子 水、摇勻的过程重复进行1 3次；f)聚阳离子和聚阴离子在微生物细胞表面的交替吸附将步骤《、()、(1)^)依次重复进行1 4次，得到细胞最外层为聚阴离子的微生物菌悬液。
7.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的将对所选 待磁化微生物代谢功能和细胞结构不造成破坏的聚阴离子和聚阳离子交替吸附在细胞表 面带正电荷的微生物表面，并使微生物细胞最外层为聚阴离子的具体方法包括以下步骤a’ )清洗微生物细胞表面取一定体积的活化培养后的微生物培养液转移至离心管 中，用合适的离心转速及离心时间离心，弃上清液，加入与所取活化培养后的微生物培养液 等体积的去离子水，摇勻使微生物细胞形成菌悬液，将该步骤中的离心、弃上清液、加入等 体积的去离子水、摇勻的过程重复进行1 3次；b’ )细胞表面聚阴离子的吸附将菌悬液离心，弃上清后加入与步骤a)中所加去离子 水等体积的质量百分比为0. 01 0. 5%的聚阴离子稀溶液，摇勻后静置10 30分钟；c’)除去菌悬液中未吸附的聚阴离子将步骤b)处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与 步骤a)中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加入去离子 水、摇勻的过程反复进行1 3次；d’ )细胞表面聚阳离子的吸附将步骤c)处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与步骤 a')中所加去离子水等体积的质量百分比为0.01 0.5%的聚阳离子稀溶液，摇勻后静置 10 30分钟；e’)除去菌悬液中未吸附的聚阳离子将步骤d)处理过的菌悬液离心，弃上清，加入与 步骤a’ )中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻，将该步骤中的离心、弃上清、加入去离 子水、摇勻的过程反复进行1 3次；f')将上述步骤b’)、c’)、d’)、e’)依次重复进行1 4次，并在最后一次重复时， 只进依次行步骤b’)、C’)，使细胞最外层为聚阴离子，得到细胞最外层为聚阴离子的微生 物菌悬液。
8.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的对所选待 磁化微生物代谢功能和细胞结构不造成破坏的聚阳离子是聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙 烯氯化铵或阳离子聚丙烯酰胺；所述的对所选待磁化微生物代谢功能和细胞结构不造成破 坏的聚阴离子是聚丙烯酸钠、聚苯乙烯磺酸钠、阴离子聚丙烯酰胺或海藻酸钠。
9.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的在细胞最 外层为聚阴离子的微生物菌悬液中加入CaCl2溶液和磁性纳米颗粒水溶液，然后，在用NaOH 溶液使微生物菌悬液的PH维持在弱酸性的条件下缓慢滴加Na2HPO4溶液，使反应生成的磷 酸钙沉淀均勻的沉积在微生物细胞表面，同时使磁性纳米颗粒也均勻地掺入到磷酸钙的沉 积层中的具体方法包括以下步骤g)加入待反应的CaCl2将经过权利要求1所述步骤(2)处理后的菌悬液离心，弃上清， 加入与权利要求6所述步骤a)或与权利要求7所述步骤a’ )中所加去离子水等体积的浓 度为0. 005 0. 05mol/L的CaCl2溶液，摇勻；h)加入磁性纳米颗粒向步骤g)处理过的菌悬液中加入浓度为0.01 0. lg/L的磁 性纳米颗粒的水溶液，其体积为步骤g)所加CaCl2溶液的1/20 1/5，摇勻；i)向经过步骤h)处理过的含有磁性纳米颗粒的菌悬液中缓慢滴加与步骤g)所加 CaCl2溶液体积相同的浓度为0. 005 0. 05mol/L的Na2HPO4溶液，并不停摇勻，同时用浓度 为0. 005 0. 05mol/L的NaOH溶液调节pH，使Na2HPO4溶液的整个滴加过程中pH维持在`6. 7 6. 8 ；j)Na2HPO4与NaOH溶液全部滴加完毕后，继续摇勻10 60min ；k)除去过量而未反应的试剂将步骤j)处理后的菌悬液离心，弃上清，加入与权利要 求6所述步骤a)或与权利要求7所述步骤a’ )中所加去离子水等体积的去离子水，摇勻， 将该步骤中的离心、弃上清、加入去离子水、摇勻的过程反复进行1 3次。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所 述的磁性纳米颗粒水溶液中的磁性纳米颗粒是Fe3O4或γ -Fe2O3，其平均粒径小于50nm。
11.根据权利要求1所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2) 和步骤(3)是在0 4°C条件下进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所 述的去离子水、聚阳离子溶液、聚阴离子溶液、CaCl2溶液、磁性纳米颗粒水溶液、Na2HPO4溶 液和NaOH溶液中加入了 NaCl，以维持微生物细胞渗透压，NaCl的加入量根据所处理的微生 物细胞所需的渗透压确定。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的活体磁性微生物的制备方法，其特征在于，所 述的去离子水、聚阳离子溶液、聚阴离子溶液、CaCl2溶液、磁性纳米颗粒水溶液、Na2HPO4溶 液和NaOH溶液在使用前经过高温高压灭菌。
14.人工制备的活体磁性微生物，其特征在于，该微生物细胞的表面有以人工方法附着 的磁性纳米颗粒。
15.据权利要求14所述的人工制备的磁性微生物，其特征在于，该微生物细胞表面以 人工方法附着的磁性纳米颗粒是平均粒径小于50nm的Fe3O4或γ -Fe203。
全文摘要
本发明提供了一种在微生物表面高效导入磁性纳米颗粒，获得活体磁性微生物的制备方法，即将待磁化的微生物进行活化培养后用适当的聚阳离子和聚阴离子的稀溶液对微生物细胞表面进行改性处理，然后加入CaCl2溶液和磁性纳米颗粒的水溶液以及Na2HPO4和NaOH，生成的磷酸钙沉淀沉积在微生物细胞表面，磁性纳米颗粒掺入到磷酸钙的沉积层中而附着于微生物细胞表面，制得的磁性微生物可保持活性。本方法可操作性强，对于不同种类的微生物具有较好的普适性，可以使一般微生物活细胞额外获得趋磁性，可应用于微生物生物制造的过程控制，进一步组装微纳米新材料和新器件。
文档编号C12R1/865GK101906409SQ200910062428
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者史续典, 杨光, 王大明 申请人:华中科技大学