专利名称：一种检测犬流感的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测犬流感的方法。
背景技术：
犬流感由各种甲型流感病毒引起，该病毒于2004年被发现能引起犬流感。犬对这 类病毒没有天生的免疫能力，因此，该传染病可能迅速地在犬只间传播，是一种发病率高的 疾病，主要表现为眼鼻分泌物、喷嚏、咳嗽等多种呼吸道症状，在临床表现上还容易与犬瘟 热、副流感等呼吸道疾病相混淆。在我国犬群中已检出H3N2亚型犬流感病毒并成功分离到 病毒。然而，目前对于犬流感国内外均还没有有效的疫苗和药物进行防制，控制该病的主要 手段是通过对犬只的早期检测，及早检测出带毒阳性犬，从而进行治疗来减少和清除犬群 中的H3N2亚型犬流感病毒。针对流行性病毒的发病特点，在短时间内确认是否感染病毒，有助于迅速采取措 施防止疫情蔓延，从而降低在人类和动物体内变异的危险性，例如冠状SARS病毒和H5亚型 禽流感以及甲型Hmi亚型流感的爆发。因此，快速鉴定微生物病原技术在公共健康和社 会卫生以及农业良性发展过程中必将发挥发挥着举足轻重的作用。H5亚型禽流感等重大 传染病PCR检测技术相继建立，在H3N2亚型犬流感在我国开始出现的形势下，H3N2亚型犬 流感病毒的快速检测成为一个重要的研究课题。PCR检测方法作为一种敏感性高、特异性 强、操作简便快速，已经广泛应用于临床上，目前，国内外对于其它种属动物流感都已建立 了 PCR检测方法，国内外多家动物医院都已开始采用该方法进行动物多种疾病进行检测和 诊断。但是，目前仍未见任何关于利用PCR检测方法检测犬流感病毒的方法的报道。相反 的，ELISA检测试剂盒成为目前检测犬流感病毒常用的一种手段。虽说ELISA检测试剂盒 也在临床中进行应用，但ELISA检测有一定的假阳性，而且其价格非常昂贵。ELISA检测的 另一个缺点的是该检测试剂盒均是批量检测，对H3N2亚型犬流感这种散在爆发的疾病不 是非常有利，这样一来在其昂贵的价格的基础上又会增加相当的成本。从而造成犬只的检 测成本过高，动物医院和宠物主人都难以接受。再者，单个犬只或寥寥几个犬只进行ELISA 检测时则造成试剂盒的严重浪费。除此之外，ELISA检测操作的影响因素非常多而复杂，也 造成结果一定程度的不可靠性。鉴于H3N2亚型犬流感我国开始散在发生的情况下，需要建 立一种快速、简便的H3N2CIV检测方法，以推动和促进社会的和谐稳定健康快速发展，同时 也具有一定社会公共卫生学意义。
发明内容
本发明的目的是在于针对现有技术的不足，提供一种经济实用的检测犬流感病毒 的方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的一种检测犬流感的方法，采用PCR检测方法。首先，提取待测犬只的鼻咽拭子RNA，进一步合成cDNA，于_20°C保存备用备用，作为下一步PCR反应的反应物质之一。鼻咽拭子RNA的提取可采用Invitrogen公司TRIzol LS Reagent试剂盒，具体操 作过程如下250iiL 病毒液中加入 750iiL 的 Trizol Ls Reagent，室温下(15_30°C )摇勻 5min，再加入200iiL氯仿，室温下(15_30°C )摇勻l_2min，在12000g，4°C下离心lOmin，吸 取上清液约5001^，加入5001^异丙醇，再在12000g，4°C下离心lOmin，弃上清液后，加入 70% DEPC乙醇1000ii L，在7500g，4°C下离心5min，在超净台内充分干燥后加入20 y LDEPC 水，-20°C下保存。PCR反应体系包括以下物质两个序列分别为SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2的引 物、dNTPs、Ex TaqUOXEx Taq buffer、cDNA模板。各物质的体积比例如下序列分别为 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 的引物溶液各 0. 3 份、dNTPs 2 份、Ex Taq 0. 3 份、10 XEx Taq buffer (Mg2+Plus) 2. 5份、cDNA模板2份、最终以水补至25份。其中引物溶液的浓度为 20pmol/u L，以灭菌双蒸水作为溶质；dNTPs溶液为各种dNTP含量为2. 5mM ；Ex Taq溶液的 浓度为5U/iiL。PCR反应条件为95°C下反应5min，进行1个循环；94°C下反应lmin，53°C下反应 lmin，72°C下反应2min，反复进行30个循环；72°C下反应lOmin ；4°C下反应12_24h。在PCR反应结束后，通过电泳及紫外分析，检测有无目的条带，从而判断犬只是否 患病。而目的条带的对照是通过将犬流感病毒RNA作为模版合成cDNA后，进行所述PCR反 应及电泳和紫外分析进行确定的。具体过程为在5 u L提取的病毒RNA加入1 y L的随机引 物后于70°C水浴锅中作用5min，然后冰浴lOmin。随后加入HPRI 0. 5 u L，AMV luL,5XAMV buffer 4 u L, dNTPs 4u L,R 0 1 y L，DEPC 水 3. 5 ii L，42°C水浴锅中作用 1 个小时。取出后 冰浴2-3min进行PCR反应。引物稀释成20pmol/y L，25 y L体系中各组分所加入的体积为 上下游引物各 0. 3 ii L，dNTPs 2u L,Ex Taq 0. 3 u L, lOXEx Taq buffer (Mg2+Plus) 2. 5 u L, cDNA模板2 ii L，补水至25 ii L，混勻。按以下条件进行PCR反应95 V 5min, 1个循环； 94°C lmin，53°C lmin，72°C 2min，30 个循环；72°C lOmin ；4°C 12_24h。反应结果的判定经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳，阳性检测产物呈现目的条带，阴性则无目的状带；检测结果经紫外 分析仪即可判定，因此易于在临床推广应用。PCR的反应原理为(1)双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单连的DNA分子， 然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTPs合成新生的DNA互补 链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动新链的合成。(2)在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条单链DNA都可作为合 成新生互补链的模板。由于在PCR反应中所选用的一对引物，是按照与扩增区段两端序列 彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿 着相反链延伸。本发明所采用的引物是针对载犬流感的基因序列的保守区域设计而得的。应 用 DNASTAR(Version 5. 07)及 Primer Premier (Version 5. 0)基因分析软件，对收录于 GenBank中的多条犬流感病毒毒株的M基因序列进行比较，并在相对保守区域设计特异引 物。所选择保守区域大小在1000bp左右。设计后的引物送上海英俊公司合成。本发明考虑多方面因素，通过多次的筛选后，采用了该两种引物。多次试验证明，该引物特异性强。另外，本发明PCR反应体系中各组分的浓度配比是经过多次实验调整优化后所得 出的，可以达到良好的反应结果。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1.本发明提供的检测方法敏感性高。PCR产物的生成以指数方式增加，能将极微 量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。这是PCR技术最主要的特点，它 可对单拷贝基因、单个细胞等微量标本进行分析。2.本发明提供的检测方法特异性强。自从提取出耐热TaqDNA聚合酶以来，在热变 性处理时不被消化、不必在每次循环扩增中再加入新酶，以及在较高温度下连续反应，显著 提高了 PCR反应产物的特异性。3.本发明的检测方法操作简便、快速。只需把反应材料按一定浓度混合，反应便按 所输入的程序进行。整个PCR操作过程，从标本处理、PCR扩增到产物分析，可在4h内完成 全部实验。4.本发明的检测方法对起始材料质量要求低，便于临床上的应用。
图1为本发明方法检测病例犬样品的结果，其中M表示DNA Marker (DL2000)，1表 示阳性对照，2表示检测样品，3表示阴性对照。图2为本发明方法检测健康犬样品的结果，其中M表示DNA Marker (DL2000)，1表 示阳性对照，2表示检测样品。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的内容。实施例1取临床病例犬的鼻咽拭子1份，放入装有750 y L生理盐水的离心管内，反复挤压 数次，上清液作为病毒液进行RNA提取。具体操作步骤如下250iiL 病毒液中加入 750iiL 的 Trizol Ls Reagent，室温下(15_30°C )摇勻 5min，再加入200 u L氯仿，室温下(15_30°C )摇勻l_2min，在12000g，4°C下离心lOmin,吸 取上清液约500ii L，加入500 ii L异丙醇，再在12000g，4°C下离心lOmin，弃上清液后，加入 70% DEPC乙醇lOOOii L，在7500g，4°C下离心5min，在超净台内充分干燥后加入20 y LDEPC 水，-20°C下保存。5 u L上述提取的病毒RNA加入1 y L的随机引物后于70°C水浴锅中作用5min，然 后冰浴 lOmin。随后力口入 HPRI 0. 5 u L, AMV 1 u L,5XAMV buffer4 u L, dNTPs 4u L, R 0 1 U L，DEPC水3. 5 ii L，42°C水浴锅中作用1个小时。取出后冰浴2_3min进行PCR反应。PCR反应采用25 y L体系。待测样品与阳性对照和阴性对照三组同时进行。其中 阳性对照为H3N2亚型犬流感RNA所合成的cDNA ；阴性对照为灭菌双蒸水。三组中各组分 所加入的体积为序列分别为SEQ ID NO :USEQ IDN0 :2的引物各0. 3 y L，dNTPs 2u L,Ex Taq 0.3uL,10X Ex Taq buffer 2. 5 u L, cDNA 模板 2 ii L (阴性对照不加 cDNA 模板)，补水至25uL，混勻。按以下条件进行PCR反应95°C 5min，1个循环；94°C lmin，53°C lmin， 72°C 2min，30个循环；72°C lOmin ；4°C 12_24h或者直接进行琼脂糖凝胶电泳作结果判定。上述实验组与DNA Marker (DL 2000)经1. 5%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。由结果可知阳性样品出现目的条带；阴性对照则无目的状带；待测样品有目的 状带，判断为阳性。实施例2如实施例1，但其样品为健康犬的鼻咽拭子。结果如图2所示阳性样品出现目的条带；阴性对照则无目的状带；待测样品无目 的状带，判断为阴性。
权利要求
一种检测犬流感的方法，其特征在于采用PCR检测方法，包括PCR反应步骤，所述的PCR反应所采用的两个引物的序列为SEQ ID NO1、SEQ IDNO2。
2.如权利要求1所述的检测犬流感的方法，其特征在于在进行PCR反应前提取待测犬 只的鼻咽拭子RNA。
3.如权利要求2所述的检测犬流感的方法，其特征在于所提取的RNA进一步合成cDNA 模板，于-20°C保存备用。
4.如权利要求1或3所述的检测犬流感的方法，其特征在于所述的PCR反应体系中包 含以下物质序列分别为 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 的引物、dNTPs、Ex TaqUOXEx Taq buffer > cDNA 模板。
5.如权利要求4所述的检测犬流感的方法，其特征在于所述的PCR反应体系中包含以 下体积比例的物质序列分别为SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2的引物溶液各0. 3份、dNTPs 2 份、Ex Taq 0. 3份、lOXEx Taq buffer 2. 5份、cDNA模板2份、最终以水补至25份。
6.如权利要求4所述的检测犬流感的方法，其特征在于所述的序列分别为SEQID NO 1、SEQ ID NO 2的引物溶液的浓度为20pmol/ u L ；dNTPs溶液为各种dNTP含量为2. 5mM, Ex Taq溶液的浓度为5U/ u L。
7.如权利要求4所述的检测犬流感的方法，其特征在于所述的PCR反应条件为95°C 下反应5min，进行1个循环；94°C下反应lmin，53°C下反应lmin，72°C下反应2min，反复进 行30个循环；72°C下反应lOmin ；4°C下反应12_24h。
8.如权利要求1所述的检测犬流感的方法，其特征在于在PCR反应结束后，通过电泳及 紫外分析，检测有无目的条带，从而判断犬只是否患病。
9.如权利要求8所述的检测犬流感的方法，其特征在于所述的目的条带的对照是通过 将犬流感病毒RNA作为模版合成cDNA后，进行所述PCR反应及电泳和紫外分析进行确定 的。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测犬流感的方法，采用PCR检测方法，其PCR反应体系中包含以下物质序列分别为SEQ ID NO1、SEQID NO2的引物、dNTPs、Ex Taq、10×Ex Taq buffer、cDNA模板。在PCR反应结束后，通过电泳及紫外分析，检测有无目的条带，从而判断犬只是否患病。本发明所提供的检测方法敏感性高、特异性强、操作简便、快速，并且对起始材料质量要求低，便于临床上的应用。
文档编号C12Q1/70GK101838708SQ20101014017
公开日2010年9月22日 申请日期2010年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者师志海, 李守军, 焦培荣, 远立国 申请人:华南农业大学