犬瘟热病毒与犬副流感病毒双重rt-pcr检测及其专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种犬瘟热病毒和犬副流感病毒的双重RT-PCR检测及其专用引物。本发明提供了检测病毒的专用引物，包括引物对A和引物对B，所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明提供的犬瘟热病毒和犬副流感病毒的双重RT-PCR检测专用引物敏感性好，最低能检测到RNA含量约为1×10-3ng/μL，其灵敏度远远高于1ng/μL的灵敏度。本发明的双重RT-PCR检测方法，简便、快速、经济、高效，具有很好的应用前景。
【专利说明】犬瘟热病毒与犬副流感病毒双重RT-PCR检测及其专用引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种犬瘟热病毒与犬副流感病毒双重RT-PCR检测及其专用引物；属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]犬瘟热病毒(⑶V)与犬副流感病毒(CPIV)的RT-PCR检测方法是目前快速检测这两种病原的常用方法，被广泛应用于实验室病原诊断，与病毒分离的方法相比较，RT-PCR方法诊断更快速简便，病毒分离相对来说时间太长，在临床上不利于快速诊断，所以目前病毒病的实验室诊断主要应用PCR/RT-PCR方法。目前有一些⑶V的RT-PCR试剂盒已经商品化并投入临床应用，但是，单独检测CPIV和一次性检测⑶V与CPIV的RT-PCR方法尚没有商品化试剂盒。
[0003]目前毛皮动物病多病毒混合感染相当严重。商品化的⑶V、CPIV的RT-PCR试剂盒都是单项RT-PCR，1个试剂盒1次试验仅能检测一种病毒，对于混合感染了⑶V、CPIV的同份毛皮动物病料要确诊病原就需要2种试剂盒并且要做2次RT-PCR实验，不仅费时费力，而且检测成本也较高，既不经济也不快捷。康泰在《动物医学进展》2013年、第9期、62-65页，公开了 3对引物；能分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段。通过优化反应条件，建立同时扩增⑶V (740bp)、CPV(419bp)和CPIV (559bp)的多重PCR方法。但是这三对引物对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为lng/ μ L;其灵敏性差。
【发明内容】
·[0004]本发明的第一个目的是提供一种能单独或/和同时检测⑶V和CPIV、且灵敏度高的专用引物；所述CDV为犬瘟热病毒，CPIV为犬副流感病毒。
[0005]本发明提供的专用引物，包括引物对Α和/或引物对Β，
所述引物对A包括引物1和引物2，
所述引物对B包括引物3和引物4，
所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列
3、序列4。
[0006]上述专用引物，所述引物对A能检测检测⑶V，所述引物对B能检测CPIV ;引物对A和引物对B同时使用能单独或同时检测CDV和CPIV。
[0007]上述专用引物，可以是引物对A ;也可以是引物对B ;还可以是，由引物对A和引物对B组成；
所述引物对A由引物1和引物2组成，
所述引物对B由引物3和引物4组成；
所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。
[0008]所述引物对A和所述引物对B可独立包装。
[0009]本发明的第二个目的是提供一种能单独或同时检测⑶V和CPIV的RT-PCR试剂。
[0010]本发明的RT-PCR试剂，包含上述专用引物。
[0011]上述RT-PCR试剂，可以是，由上述专用引物、dNTP、DNA聚合酶、M-MLV、RNaseInhibitor和PCR缓冲液组成。
[0012]所述dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸，M-MLV为一种鼠白血病逆转录酶，RNaseInhibitor为RNA酶抑制剂。 [0013]上述RT-PCR试剂中，
所述专用引物中各引物的终浓度均为0.4μΜ ；
所述dNTP的终浓度均为0.4mM ；
所述DNA聚合酶的终浓度均0.05 υ/μ?;
所述M-MLV的终浓度为2U/^L ；
所述 RNase Inhibitor 的终浓度为 3.2U/KL。
[0014]所述终浓度是指在25PL RT-PCR反应体系中的最终浓度。
[0015]所述dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液购自天根生化科技有限公司，产品目录号为ET101。
[0016]所述M-MLV、RNase Inhibitor购自宝生物工程有限公司，产品目录号为2641A、2313A。
[0017]上述RT-PCR试剂，能单独或同时检测⑶V和CPIV。
[0018]本发明的第三个目的是提供一种能单独或同时检测⑶V和CPIV的RT-PCR试剂盒。
[0019]一种RT-PCR试剂盒，含有上述RT-PCR试剂。
[0020]上述RT-PCR试剂盒能单独或同时检测⑶V和CPIV。
[0021]所述专用引物、RT-PCR试剂或RT-PCR试剂盒在检测病毒或制备检测病毒产品中的应用；所述病毒具体为如下2种病毒中的至少一种:犬瘟热病毒和犬副流感病毒。
[0022]本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法。
[0023]一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法，包括如下步骤:
用所述专用引物、RT-PCR试剂或RT-PCR试剂盒中的引物对A和引物对B对待测样本进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物，若得到大小为593bp的RT-PCR产物，则样本中含有或候选含有犬瘟热病毒；
若得到大小为1530bp的RT-PCR产物，则样本中含有或候选含有犬副流感病毒；
本方法用于非诊断和治疗目的。
[0024]上述方法中，若同时得到大小为593bp的RT-PCR产物和大小为1530bp的RT-PCR产物，则样本中含有或候选含有犬瘟热病毒和犬副流感病毒。
[0025]所述593bp的RT-PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；
所述1530bp的RT-PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；
所述RT-PCR扩增中，以待测样本的基因组RNA为模板。
[0026]所述RT-PCR扩增的退火温度为53°C -58°C，所述RT-PCR扩增的退火温度具体为55。。。
[0027]有益效果
本发明的实验证明，采用本发明提供的专用引物、RT-PCR试剂、RT-PCR试剂盒或检测方法，一次反应能同时检测出CDV和CPIV两种病毒；SCDV和CPIV两种病毒的检测提供了新的检测方法。所用2对引物特异性较好，引物相互之间有较低的同源性及互补性；所述引物敏感性好最低能检测到RNA含量约为1 X 10_3ng/uL，其灵敏度远远高于目前最低能检测到RNA含量约为lng/^L的灵敏度。所述的双重RT-PCR方法简便、快速、经济、高效，而且还大大节约了检测成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为CDV、CPIV双重RT-PCR以及单项RT-PCR电泳图结果；
图 1 中，M:2000bp DNA Marker 1_3:CDV+CPIV CDV CPIV ；
图2为CDV、CPIV双重RT-PCR特异性电泳图结果；
图 2 中，M:2000bp DNA Marker 1-5:CDV CSFV PRRSV BVDV CPIV，7-11:CPIV CSFVPRRSV BVDV CDV , 12-16:CDV CPIV CSFV PRRSV BVDV ;
图3，图4为CDV、CPIV双重RT-PCR敏感性电泳图结果;
图 3 中，M:2000bp DNA Marker 1-6:CDV+CPIV 浓度 10'10'10'10'10'10-6 ；7:阴性对照；
图 4 中，M:2000bp DNA Marker 1-6:CPIV 浓度 10'10'10'10'10'10-6 ；
8-13:CDV 浓度 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 ；7 和 14:阴性对照。
【具体实施方式】
[0029]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031]实施例1
犬瘟热病毒(⑶V)和犬副流感病毒(CPIV)的双重RT-PCR检测方法构建
1、引物设计
在 GenBank 中查出 CDV (Genbank 号 AF112189)、CPIV (Genbank 号 EF543648)
的部分已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析，分别选取CDV的Η基因，CPIV的ΝΡ基因为各病毒扩增的靶序列。利用Primer Premier 5对上述保守区进行引物设计，对设计出来的2种病毒引物利用DNAstar进行引物二聚体分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为⑶V(593bp)、CPIV(1530bp)的如下2对引物，并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性，从而确定2种病毒的双重RT-PCR引物如下:
引物对A:
引物 1:5’ -GGATTATTATGAAAGCCCACT-3’(序列 1)；
引物 2:5’ -GGTTTAATTCAATCGTCGGTA-3’(序列 2)；
引物对B:
引物 3:5’ -AAATGTCA TCCGTGCTTAAAGC-3’ (序列 3)引物 4: 5’ -TGTCTAGATGTCAAGATCACCCAGT-3’(序列 4)；
2、RT-PCR反应条件优化
分别提取犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感病毒(CPIV)的基因组RNA。
[0032]犬痕热病毒(CDV,Canine distemper virus)记载在 Sequence analysis andexpression of the attachment and fusion proteins of canine distemper viruswild-type strain A75/17, Cherpillod, P., Beck, K., Zurbriggen, A.and ffittek, R.,《J.Virol.)), 1999年，第73期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；
犬副流感病毒(CPIV, Canine parainfluenza virus)记载在RT-PCR检测CPIV方法的建立与应用，简子健，马素贞，刘腾飞，翟少华，赵森，《新疆农业科学》，2011年，第48期，新疆农业大学，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；
分别以⑶V基因组RNA、CPIV基因组RNA和⑶V+CPIV混合基因组RNA (体积比为1:1)为模板，均以引物对A和引物对B混合作为引物，按照如下体系和程序进行RT-PCR扩增:RT-PCR扩增体系25yL: 10 X PCR Buffer (Mg2+ Plus) 2.5μ?(天根生化科技有限公司，产品目录号为ΕΤ101)，上下游混合引物:引物对分别为引物对A 0.5μ? (引物1和引物2浓度均为20μΜ，终浓度各为0.4μΜ)、引物对Β 0.5μ? (引物3和引物4浓度均为20μΜ，终浓度各为
0.4μΜ), RNA 模板 2μ?，dNTPs (各 10 mM) 1 μ? (终浓度 0.4 mM), Taq 酶(5U/^L) 0.25μ?或(2.5U/>L) 0.5μ? (终浓度 0.05 V/μ?), M-MLV (10000U) 0.5μ? (终浓度 2υ/μ?)，RNaseInhibitor (40U/>L) 2μ?(终浓度 3.2U/^L)，最后用水补充至 25μ?。
[0033]优化后的程序为:50°C，反转录30min，；94°C，预变性2min ;94°C变性45s，55°C退火lmin,72°C延伸lmin,32个循环；72°C延伸10min,4°C保存。
[0034]结果如图1所示，其中1为CDV+CPIV基因组RNA的RT-PCR产物(1530bp和593bp), 2为CDV基因组RNA的RT-PCR产物(593bp)，3为CPIV基因组RNA的RT-PCR产物(1530bp)；-为阴性对照(即模板为ddH20)，没有得到任何产物。
[0035]分别将上述RT-PCR产物送去测序，结果为:
593bp的RT-PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列5(CDV的Genbank号的AF112189的第1328-1922位核苷酸)；
1530bp的RT-PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列6(CPIV的Genbank号EF543648第60-1589位核苷酸)。
[0036]因此，RT-PCR产物通过测序，其序列与GenBank中查出⑶V和CPIV的已知序列比较，证实是目的基因。
[0037]3、特异性检测
分别检测上述 涉及的RT-PCR反应的引物对A、引物对B的特异性，方法如下:
1)引物对A特异性
分别提取PRRSV (猪繁殖与呼吸综合征病毒)、CSFV(猪瘟病毒)、BVDV(牛病毒性腹泻病毒)的RNA ；
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV, Porcine r印roductive and respiratory syndromevirus)记载在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析，童光志，周艳君，郝晓芳，田志军，仇华吉，彭金美，安同庆，中国预防兽医学报，2007年05，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；猪瘟病毒(CSFV, Classic swine fever virus)记载在猪瘟病毒GSLZ株的分离与鉴定，何小兵，贾怀杰，陈国华，房永祥，李玩生，曾爽，景志忠，《中国兽医科学》，2011年，第2期，中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；
牛病毒性腹?写病毒(BVDV, Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus)记载在牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定，张淑琴，郭利，冷雪，张亭亭，吴永旺，武华，《中国预防兽医学报》，2011年03期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；
分别以PRRSV的RNA、CSFV的RNA、BVDV的RNA、CDV基因组RNA、CPIV基因组RNA为模板，以引物对A为引物，按照上述步骤2中的RT-PCR体系和程序进行扩增，结果如图2的1-5所示，其中1为CDV，2为PRRSV，3为CSFV，4为BVDV，5为CPIV，-为阴性对照(即模板为ddH20);可以看出，只有CDV有593bp目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对A特异性高。
[0038]分别以PRRSV 的 RNA、CSFV 的 RNA、BVDV 的 RNA、CDV 基因组 RNA、CPIV 基因组 RNA为模板，以引物对B为引物，按照上述步骤2中的RT-PCR体系和程序进行扩增，结果如图2的7-11所示，其中7为CPIV，8为PRRSV，9为CSFV，10为BVDV, 11为CDV，-为阴性对照(即模板为ddH20);可以看出，只有CPIV有1530bp目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对B特异性高。
[0039]分别以PRRSV 的 RNA、CSFV 的 RNA、BVDV 的 RNA、CDV 基因组 RNA、CPIV 基因组 RNA为模板，以引物对A和引物对B为引物，按照上述步骤2中的RT-PCR体系和程序进行扩增，结果如图 2 的 12-16 所示，其中 12 为 CDV，13 为 CPIV，14 为 PRRSV，15 为 CSFV，16 为 BVDV，-为阴性对照(即模板为ddH20);可以看出，只有⑶V有593bp目的条带、CPIV有1530bp目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对A和引物对B同时作用时，其特异性高。
[0040]4、敏感性检测
通过分光光度计测浓度，测得由步骤2得到的CDV基因RNA的浓度为12ng/^L，由步骤2得到的CPIV基因RNA的浓度为15ng/^L。
[0041]分别将⑶V基因RNA和CPIV基因RNA进行10倍系列稀释后分别作为模板，以引物对A、B为引物，按照步骤2的体系和程序进行扩增。
[0042]结果见图4所示，1-7分别为PCV II基因DNA的1(^-107倍稀释的模板；8_14分别为PPV基因DNA的lO1-lO7倍稀释的模板；15-21分别为PRV基因DNA的1(^-107倍稀释的模板；可以看出，无论哪种模板，浓度稀释至10_4的模板有比较清晰地目的条带，浓度稀释至10_5的模板有比较弱的目的条带，浓度稀释至10_6及以上的模板已完全看不到目的条带。
[0043]将由步骤2得到的⑶V基因RNA和CPIV基因RNA混合(体积比为1:1 )，将混合后RNA进行10倍系列稀释后分别作为模板，以引物对A、B为引物，按照步骤2的体系和程序进行扩增。
[0044]结果见图3所示，其中1-9分别为混合后的DNA的1(^-109倍稀释的模板，可以看出，浓度稀释至10_4的模板有比较清晰地目的条带，浓度稀释至10_5的模板有比较弱的目的条带，浓度稀释至10_6及以上的模板已完全看不到目的条带。
[0045]实验证明本发明的双重RT-PCR可以检测到⑶V基因RNA的最小浓度为1.2X l(T3ng/>L，CPIV基因RNA的最小浓度为1.5X l(T3ng/>L。而双重RT-PCR的敏感性与单项RT-PCR的敏感性无明显差别。
[0046]5、重复性
对⑶V、CPIV双重RT-PCR方法进行多次重复试验实验结果稳定。
[0047]6、样本检测
对106份临床疑似病料(山东省动物疫病预防与控制中心附设兽医院门诊送检的病死毛皮动物肝、肺、脑组织混合样品(质量比约为1:1:1)进行检测，具体如下:
提取106份临床疑似病料的基因组RNA (编号为1-106)，用引物对A和B作为引物，按照步骤2的体系和程序进行RT-PCR扩增，
得到593bp的RT-PCR产物(序列表中的序列5)为⑶V阳性；
得到1530bp的RT-PCR产物(序列表中的序列6)为CPIV阳性；
得到593bp和1530bp的为CDV和CPIV阳性；
均没有593bp和1530bp的为CDV和CPIV阴性；
结果如下:
编号为1-87的得到593bp的RT-PCR产物(序列表中的序列5)为CDV阳性(共87份)；编号为88-95的得到1530bp的RT-PCR产物(序列表中的序列6)为CPIV阳性(共8
`份)；
编号为96-99的得到593bp和1530bp的为CDV和CPIV阳性(共4份)；
编号为100-106的均没有593bp或1530bp的扩增，说明没有感染⑶V和CPIV中的任一种。
[0048]采用商品CDV检测试剂盒(北京世纪元亨)对上述106份样品进行⑶V单项RT-PCR，结果与本发明上述的结果一致，比对结果符合率为100%。
【权利要求】
1.一种专用引物，其特征在于，包括引物对A和/或引物对B;所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。
2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于，所述引物对A能检测检测CDV，所述引物对B能检测CPIV。
3.根据权利要求1或2所述的专用引物，其特征在于，为引物对A;或者为引物对B。
4.根据权利要求1或2所述的专用引物，其特征在于，由引物对A和引物对B组成。
5.—种RT-PCR试剂，其特征在于，包含权利要求1-4中任意一项所述的专用引物。
6.根据权利要求5所述的RT-PCR试剂，其特征在于，还包含dNTP、DNA聚合酶、M-MLV、RNase Inhibitor 和 PCR 缓冲液。
7.根据权利要求5或6所述的RT-PCR试剂，其特征在于RT-PCR试剂中，所述专用引物中各引物的终浓度均为0.4μΜ ；所述dNTP的终 浓度均为0.4mM ；所述DNA聚合酶的终浓度均0.05 υ/μ?;所述M-MLV的终浓度为2U/^L ；所述 RNase Inhibitor 的终浓度为 3.2U/M-L ；所述终浓度是指在25PL RT-PCR反应体系中的最终浓度。
8.一种RT-PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求5-7中任意一项所述的RT-PCR试剂。
9.一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法，包括如下步骤:用权利要求1-3中任意一项所述的专用引物、权利要求4-6中任意一项所述的RT-PCR试剂或权利要求7所述的RT-PCR试剂盒中的引物对A和引物对B对待测样本进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物；扩增产物大小为593bp，则样本中含有或候选含有犬瘟热病毒；扩增产物大小为1530bp，则样本中含有或候选含有犬副流感病毒；本方法用于非诊断和治疗目的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，RT-PCR扩增的退火温度为53°C-58°C。
【文档编号】C12Q1/70GK103667537SQ201310694619
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】王贵升, 田夫林, 王金宝, 尹斐斐, 陈静, 徐鸿, 李玉杰 申请人:山东省动物疫病预防与控制中心