一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞。本发明生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，包括如下步骤：(1)将分泌生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞于细胞培养液中进行扩大培养；(2)再接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养；(3)收获杂交瘤细胞所生成的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。本发明方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量。
【专利说明】一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及单克隆抗体生产的【技术领域】，具体涉及一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法、其制品及杂交瘤细胞。
【背景技术】
[0002]1975 年 Koehler 和 Milstein (Nature Vol.256，pp495_497)，采用细胞杂交技术，将绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，成功获得了抗SRBC的单克隆抗体。创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术，为生物技术打开了一个全新的领域。目前，该技术的应用已涉及医学、农业、食品、环境等众多领域，广泛应用于基础研究、疾病诊断、环境与食品检测、治疗、预防、蛋白提纯等方面。随着单克隆抗体在体内诊断和治疗中的应用，对单克隆抗体产品也提出了更高的要求，从而促进了体外大规模培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的技术发展。该技术也随着机械化工、计算机学科的发展而日益完善，为生物医学(包括人类和兽医)的各个领域，尤其在病毒感染的预防和治疗的基础研究和临床应用领域，发挥其重要的作用。
[0003]犬痕热(CanineDistemper, CD)是由犬痕热病毒(Canine Distemper virus, CDV)引起的，感染肉食兽中的犬科(尤其是幼犬)、鼬科及一部分浣熊科动物的高度接触传染性、致死性传染病。以早期表现双相热型、急性鼻卡他，及随后的以支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。少数病例出现鼻部和脚垫的高度角化。该病传染性强、发病率高，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，致死率30%?80%，雪豹高达100%。另外，该病毒感染还威胁到实验用犬。目前临床上对该病毒感染的治疗主要是对症治疗，配合高免血清和单克隆抗体治疗。制备治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的传统方法是体内生产法。此方法将融合产生的犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞接种于小鼠(非同系动物)腹腔中，在小鼠腹腔内生长杂交瘤,诱导产生大量.腹水，同时,犬瘟热病毒单克隆杂交瘤细胞分泌抗体于腹水中，而得到大量的腹水单抗。一般而言，该类腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括Ig)，因此要提纯后才能使用；另外，这种方法的产量低，生产周期长、批间差异大，不适合进行批量化的治疗性单抗的生产。
[0004]目前，亟需能生产出具有纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法。
【发明内容】
[0005]根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，本发明还提供由该方法直接获得的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。本发明方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量。另外，本发明还提供分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0006]本发明的技术方案如下:[0007]—种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0008](I)将分泌生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞于细胞培养液中进行扩大培养；
[0009](2)再接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养；
[0010](3)收获杂交瘤细胞所生成的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。
[0011]所述细胞培养液的配方是:85%DMEM液、15%犊牛血清、添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素；或无血清杂交瘤细胞培养基,添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。
[0012]接种密度是IX 105 ?IX 106/ml。
[0013]接种密度是2X105?8X105/ml，其中步骤(2)中采用批式、连续灌流或换液收取方式在生物反应器中培养所述杂交瘤细胞。
[0014]接种密度是4 X 105? 5 X 105/ml，培养所述杂交瘤细胞的培养温度在36?37°C之间，所述细胞培养液的PH值为7.0?7.2，所述生物反应器的溶氧范围设为50%?90%。
[0015]当采用连续灌流方式培养杂交瘤细胞时，流加体积为每天I?5罐体积。
[0016]上述方法的特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏号为=CGMCC N0.7613。
[0017]还包括如下步骤:将步骤(3)收获的生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体进行浓缩与纯化，再无菌、定量分装到灭菌的容器中。
[0018]上述方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。
[0019]一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC N0.7613。
[0020]在本发明中，“生物反应器”是指为培养生长的和非固定化的细胞提供良好封闭环境的生物反应装置，通常又称为细胞发酵罐。有多种生物反应器可以适用于本发明中，包括例如搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器和流化床生物反应器等。
[0021]生物反应器培养细胞主要有批式(Batch)、流加式(Fed-batch)和灌流式(Perfusion)三种。在简单的批式培养中，随着营养物的消耗和副产物的积累，细胞停止生长并开始死亡,产物也停止产生,生产效率很低。流加式培养，即在培养过程中，根据细胞代谢需求，连续或间隔地向反应器内加入特定的流加培养基，补充新的营养物质，减少副产物。整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止，回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。灌流式培养是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞生长和产物形成过程中，不断地将消耗过的培养基排出，同时又连续不断地灌注新的培养基的方法。
[0022]本发明用生物反应器生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法中，细胞的培养方式可以是批式、流加式或灌流式中的任意一种，这三种细胞培养方式均能满足本发明的要求，实现本发明的发明目的，考虑到实验条件等其他方面的问题，本发明实施例中使用的是灌流式的细胞培养方式，这并不代表另外两种方式就不能实现本发明的发明目的。
[0023]具体而言，使用生物反应器培养的步骤可以是:
[0024]从工作细胞库中取出杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37 °C水浴复苏，以85%DMEM液、15%犊牛血清培养液，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素；或无血清杂交瘤细胞培养液，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素进行细胞扩大培养。[0025]同时，将生物反应器彻底清洗、消毒后开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四气体供气装置，设定生物反应器培养条件:温度，PH值，溶氧，搅拌速度等备用。
[0026]当生产细胞种子增殖达到合适总量，按细胞终浓度的合理范围接种到生物反应器中进行培养，其中接种浓度范围为I X IO5?IXiofVml能满足本发明基本的接种要求，而接种浓度范围为2X IO5?8X 105/ml，该范围的接种浓度效果较佳，而接种浓度范围为4X IO5?5X 105/ml效果最好，该范围的接种浓度即可保证细胞充分适应从静态培养到动态培养，又能缩短从接种到收获的时间。当细胞密度达到IXlO6Ail以上时，即可设定并开启蠕动泵开始以灌注的方式收获培养上清液。根据细胞密度和效价，调整蠕动泵转速，改变灌注体积。优选在细胞密度达到2X106/ml以上时，尤其是当细胞密度达到5X106/ml以上时，则检测的效价所对应的细胞浓度在该密度达到合格要求，逐步提升设定转速，然后以连续灌流或换液收取方式获得细胞培养上清即为治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。本发明可以以任何合适的浓度将杂交瘤种子细胞接种到生物反应器中。在本发明中，接种到生物反应器中的种子细胞的浓度只要在105/ml以上即可。在本发明的一个实施例中，接种到生物反应器中的种子细胞的浓度优选为2X 105/ml以上。在另两个实施例中，接种到生物反应器中的种子细胞的浓度分别优选为5X 105/ml或8X105/ml以上。当然，普通技术人员可以容易地确定种子细胞接种浓度的合理范围如上述范围。
[0027]在上述方法中可以采用任何合适的分泌治疗性单克隆抗体的杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞可以来源于已有的保藏物例如来源于保藏机构的保藏物，或者从商业途径购得，或者自行制备。普通技术·人员知晓构建分泌治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，例如可以用犬瘟热病毒CDV MD-77株免疫小鼠，应用SPA-HRP免疫组织化学技术检测免疫小鼠血清效价，当其达到1:640后，取血清效价最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清液做ELISA筛选阳性融合株，I次或数次(例如3次)克隆后获得杂交瘤细胞株。另外，所述杂交瘤细胞分泌治疗性单克隆抗体的免疫组化效价在1:32?1:128范围内。优选抗体效价1:64以上的杂交瘤细胞作为生产用治疗性单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明的【具体实施方式】中，采用自行制备的于2013年5月17日以保藏号为CGMCC N0.7613保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的小鼠杂交瘤细胞系。
[0028]在本发明中，可以采用任何适合于杂交瘤细胞生长的液体培养基。本发明实施例中优选的培养液配方是:85%DMEM液、15%犊牛血清，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。在另一个实施方式中，所用的培养基是无血清杂交瘤细胞培养基，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。
[0029]本发明可以在任何合适的温度下培养种子细胞，温度在20?38°C能满足基本培养要求，优选30?37°C，更优选是33?37°C。在一个具体的实施方式中，培养种子细胞的温度为36?37°C之间效果最佳。优选所用生物培养器的溶氧范围设在50%?90%之间。本发明中，在生物反应器培养过程中，培养种子细胞的培养液的pH值控制在7.0?7.2之间。可以通过在培养过程中添加合适酸或碱而将培养液PH控制在合适的范围内，例如二氧化碳和碳酸氢钠等。
[0030]优选的，生物反应器培养温度设在36?37°C之间，生物反应器培养时的流加体积在每天I?5罐体积之间。[0031]当生物反应器中的细胞生长至合适的密度后，收获培养上清液本发明中优选，当细胞密度达到IO6Ail以上时，即可收获培养上清液。更优选在细胞密度达到2X 106/ml以上时，尤其是达到5X106/ml以上时，该点值的细胞浓度是产品效价评价的一个基础标准，收获培养上清液。可以通过多种合适的方法收获上清液，例如离心、过滤、沉淀等方法，这是本领域普通技术人员所熟知的。
[0032]本发明的方法进一步包括将收获的治疗性单克隆抗体进行过滤和浓缩的步骤。具体采用如下方法:取无菌检验呈阴性，效价检测合格的单克隆抗体上清液，将蠕动泵连接到单克隆抗体收集瓶，利用0.45 μ m预滤系统过滤除去细胞碎片等杂质，然后连接平板膜包超滤系统(截留分子量为30kDa)，开启蠕动泵进行单克隆抗体的超滤浓缩，调节进料口和出料口压力在20?30psig，当达到超滤浓缩的倍数时停止超滤浓缩系统。
[0033]本发明的方法还包括将浓缩的单克隆抗体无菌、定量分装到灭菌的容器中。
[0034]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0035]1、本发明中用生物反应器替代了利用小鼠制造治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体注射液，可解决鼠源外源病源污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体注射液纯粹，确保治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体注射液的安全性；
[0036]2、采用本发明方法生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体产量高，成本低，可显著提高该产品经济效益；
[0037]3、本发明生产工艺简单且稳定、易操作，抗体纯度高，批间差异小，质量易控，可显著提高治疗性单克隆抗体质量；
[0038]4、本发明方法生.产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体对治疗犬瘟热病毒病有很好的疗效。
[0039]杂交瘤细胞保藏信息:
[0040]杂交瘤细胞株名称:治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞CDV1H2
[0041]菌株分类:小鼠杂交瘤细胞系
[0042]保藏编号为:CGMCCN0.7613
[0043]保藏日期:2013年5月17日
[0044]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)
[0045]保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0047]提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0048]实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0049]生物材料:
[0050]犬瘟热病毒⑶V ADV MD-77株，由农业部兽医诊断中心提供；
[0051]犬瘟热病毒98017株，由农业部兽医诊断中心提供；
[0052]犬细小病毒AMS-1株，由农业部兽医诊断中心提供；
[0053]犬传染性肝炎病毒(ICHV)，由农业部兽医诊断中心提供；
[0054]呼肠病毒3型(Reo-3)，由农业部兽医诊断中心提供；
[0055]SP2/0细胞由军事医学科学院惠赠；
[0056]Balb/c小鼠购自北京维通利华公司；
[0057] 申请人:声明，以上生物材料均在 申请人:实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。
[0058]
【权利要求】
1.一种生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将分泌生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞于细胞培养液中进行扩大培养； (2)再接种到生物反应器内的细胞培养液中进行培养； (3)收获杂交瘤细胞所生成的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液的配方是:85%DMEM液、15%犊牛血清、添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素；或无血清杂交瘤细胞培养基，添加200单位/ml青霉素钠和200单位/ml硫酸链霉素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，接种密度是IXIO5?I X 106/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，接种密度是2X IO5?8X105/ml，其中步骤(2)中采用批式、连续灌流或换液收取方式在生物反应器中培养所述杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，接种密度是4X IO5?5X 105/ml，培养所述杂交瘤细胞的培养温度在36?37°C之间，所述细胞培养液的pH值为7.0?7.2，所述生物反应器的溶氧范围设为50%?90%。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当采用连续灌流方式培养杂交瘤细胞时，流加体积为每天I?5罐体积。
7.根据权利要求1?6任一所述的方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏号为:CGMCC N0.7613。
8.根据权利要求7所述 的方法，其特征在于，还包括如下步骤:将步骤(3)收获的生产治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体进行浓缩与纯化，再无菌、定量分装到灭菌的容器中。
9.权利要求1-8任一所述的方法生产的治疗性犬瘟热病毒单克隆抗体。
10.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC N0.7613。
【文档编号】C12P21/08GK103436583SQ201310397952
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】孙明, 陈西钊, 田克恭, 曹振, 张丽 申请人:北京世纪元亨动物防疫技术有限公司