一种具有抗氧化活性文蛤多糖的提取及应用方法
【专利摘要】一种文蛤多糖的分离纯化方法，涉及生物分离纯化【技术领域】。本发明主要采用文蛤软体匀浆，加酶辅助热水浸提，悬蒸浓缩，乙醇沉淀获得文蛤多糖粗品，然后sevage法脱蛋白，再采用DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析、Superdex200凝胶过滤柱层析对文蛤多糖逐级分离纯化，纯化获得的文蛤多糖为两种单一多糖，纯度达90%以上。使获得的文蛤多糖精品能用于药品、化工、保健营养品及化妆品的原料或添加剂。也为文蛤多糖的进一步研究提供了基础。
【专利说明】一种具有抗氧化活性文蛤多糖的提取及应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属海洋生物【技术领域】，提供了一种具有抗氧化活性文蛤多糖的酶法提取和分离纯化方法，所形成的文蛤多糖可用于抗氧化功能的保健品的制备。
【背景技术】
[0002]文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)属软体动物门、双壳纲、真瓣觸目、帘蛤科、文蛤属，是我国滩涂传统养殖的主要贝类之一。文蛤多糖主要存在于文蛤内脏中，目前尚未被广泛研究和应用。现代科学研究表明，文蛤多糖具有清热利湿、化痰、散结、抗肿瘤的功效，而且还能够发挥降糖、降血脂，抗突变、抗衰老等多种生理功能。在降糖功能方面，有研究认为，文蛤多糖能够增加胰岛素的敏感性并改善胰岛素抵抗，促进外周组织对葡萄糖的利用，提高机体对胰岛素的敏感性[文蛤多糖对小鼠调节血糖和抗应激功能的影响.中国现代应用药学杂志，2007，24( 2)]。而在抑制癌细胞方面，文蛤糖肽MGP0501对体外培养的人肺癌细胞株(A549)、卵巢癌细胞株(H08910)、宫颈癌细胞株(Hela)、鼻咽癌细胞株(KB)、肝癌细胞株(SMMC-7721)生长均有很强的抑制作用[抗肿瘤文蛤糖肽(MGP0405)的分离纯化及性质研究.中国天然药物，2006，4 (3)]。
[0003]自20世纪60年代起，从海洋中寻找天然活性物质成为研究热点。本发明以文蛤作为研究对象，开展了文蛤多糖的提取和分离研究，为系统开展文蛤多糖的活性研究奠定基础。
[0004]根据相关研究，文蛤中粗多糖含量一般在5~8%，但受品种、产地、大小、季节以及原料的新鲜程度影响，其多糖含量相差较大。文蛤多糖一般采取水提法，利用超声波辅助可以提高收率，减少提取时间， 尹华等对此进行了研究，先将文蛤软体破碎后，加入I:20的水，然后超声波提取2次，每次30分钟，其多糖得率在1.0~4.7%[文蛤提取物中多糖的含量测定.中国海洋药物杂志，2006，25 (I)]。由于文蛤多糖与在组织中与蛋白、脂肪等成分紧密结合，仅仅依靠物理方法进行提取还不能够充分使多糖溶出，而且提取的多糖纯度低，含有大分子蛋白质等杂质，使后续分离较为困难。基于上述原因，本发明提出了文蛤多糖的酶法提取工艺，旨在利用蛋白酶的水解作用使与多糖紧密结合的蛋白分开，形成较低分子量的肽类，避免在后续醇沉操作中与多糖共沉淀。
[0005]文蛤多糖具有复杂的的生物活性与功能，但对其抗氧化作用尚没有进行深入研究。机体在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基(ROS )，在正常情况下，机体内的处于动态平衡中，但是一旦该平衡被打破，就会对机体造成损害，从而引发一系列相关疾病，目前研究认为，ROS易损伤组织，引起各种疾病，包括肿瘤、衰老、心脑系统损伤，与神经系统及糖尿病并发症等很多疾病的发生有密切的关系。外源性补充抗氧化物质，能够部分消除体内产生的R0S，起到抗衰老、提高免疫、预防疾病的效果。因而具有抗氧化作用的生物活性物质的研究日益受到关注。大量研究表明多糖具有清除多种活性氧(Reactive oxygen species, ROS )的抗氧化作用，其可能的机制在于多糖具有捕捉脂质过氧化链式反应中产生的ROS作用，减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进程。也有研究认为，多糖分子能够促进体内抗氧化酶(如SOD、CAT、GSH- Px等)的生成、释放，或直接可作用于抗氧化酶，提高体内原有抗氧化酶的活性，间接发挥抗氧化作用。
[0006]本发明在获得纯化文蛤多糖的基础上，研究发现文蛤多糖具有较强的外源抗氧化活性，这也是文蛤多糖具有降糖、提升免疫等活性的一个重要理论依据。而同时，在应用研究领域，可以利用文蛤多糖或者含有文蛤多糖的提取物、产物开发成为具有抗氧化活性的功能产品。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种文蛤多糖的提取分离方法及产品应用开发的方向。为提高文蛤多糖的提取、分离效率，本发明提出了酶法辅助提取工艺，利用蛋白酶的水解作用，分离出粗多糖，在此基础上，通过乙醇沉淀、离子交换、凝胶过滤进行文蛤多糖的纯化。纯化的文蛤多糖可用于药品、保健食品及化妆品的原料或添加剂。本发明还利用抗氧化模型，发现了文蛤多糖具有体外抗氧化活性，可作为抗氧化功能食品、药品进行开发。
[0008]本发明通过如下的技术方案实现:
1.打浆:取新鲜的文蛤软体加3-5倍质量的去离子水，利用高速组织破碎机等均质设备进行打浆，使软体得到充分破碎。
[0009]2.酶法提取:加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶或者中的一种或几种，加酶量0.5~2.5 % (以新鲜文蛤软体质量计)，在40-60°C，或商品蛋白酶推荐的适宜水解温度下，搅拌水解2-6 h，离心取上清液。
[0010]3.浓缩:通过超滤浓缩，使用陶瓷膜或卷式膜组件(截留分子量在5000Da-15000Da)进行截留，截留相为文蛤多糖组分，分离出的低分子组分含有大量的肽类、氨基酸等组分，可作为副产物文蛤多肽进行开发。截留液进行真空旋转蒸发浓缩，浓缩至原料液的1/8~1/15。也可以不进行膜过滤，直接进行真空旋转蒸发浓缩。
[0011]4.醇沉:取浓缩液，加入3-5倍体积的乙醇(乙醇终浓度在85%以上)，4 °C静置4-10 h，离心收集沉淀物，用无水乙醇洗涤2-3次，挥干乙醇，得到文蛤多糖粗品。
[0012]5.脱蛋白:将多糖粗品用适量的去离子水复溶,按体积比1:1加入sevage试剂(正丁醇:氯仿=1:4)，剧烈振荡I h，静置或离心，取上层清液，然后减压浓缩去除溶剂，再离心获得文蛤多糖溶液。
[0013]6.离子交换柱层析:使用DEAE-52纤维素柱对上述文蛤多糖粗品进行纯化，上样后先采用去离子水平衡，再分别用0.1,0.3 mol/L NaCl洗脱2_3个柱体积，收集0.lmol/LNaCl的洗脱峰，为文蛤多糖的目标组分。对收集的组分进行减压浓缩，供进一步纯化。
[0014]7.凝胶过滤:上述组分浓缩后，采用Superdex 200凝胶过滤柱纯化，上样后用2_3倍柱体积的去离子水进行洗脱，得到两个多糖峰D21和D22组分，分别予以收集、浓缩、干燥，获得文蛤纯化多糖。
[0015]本发明工艺具有以下优点:(1)采用高压均质进行软体预处理，有利于文蛤多糖的溶出。(2)利用酶法进行辅助提取，可以显著提高多糖收率，提高粗多糖的纯度，并可以降低后续脱除蛋白的工作强度。(3)本发明在提取多糖的同时，可以回收蛤类软体中的蛋白成分，获得副产物文蛤多肽。(4)本发明工艺提供了一种相对操作简单的蛋白纯化方法，其纯化的蛋白为后续的活性评价提供了基础，也为文蛤多糖用于药品、功能食品、日化产品创造了条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1文蛤多糖酶法提取及纯化示意图。
[0017]图2文蛤多糖的DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析图谱。
[0018]图3文蛤多糖的Superdex 200凝胶过滤柱层析图谱。
[0019]图4文蛤多糖的抗氧化活性。
【具体实施方式】
[0020]实施例1文蛤多糖的酶法提取
一、方案一
1.打浆:取新鲜的文蛤软体加5倍质量的去离子水，利用高速组织破碎机等均质设备进行打浆，使软体得到充分破碎。
[0021]2.酶法提取:加入胰蛋白酶，加酶量2.5 %，在40°C下搅拌水解5 h，离心取上清液。
[0022]3.浓缩:将离心上清液用真空旋转蒸发的方式浓缩至原体积的1/10。
[0023]4.醇沉:取浓缩液，加入3倍体积的无水乙醇，4 °C静置8 h，离心收集沉淀物，用无水乙醇洗涤2次，挥干乙醇，得到文蛤多糖粗品。多糖得率为90 mg/g干重。
[0024]二、方案二
1.打浆:取新鲜的文蛤软体加3倍质量的去离子水，利用高速组织破碎机等均质设备进行打浆，使软体得到充分破碎。
[0025]2.酶法提取:加入木瓜蛋白酶，加酶量0.5 %，在60°C下搅拌水解2 h，离心取上清液。
[0026]3.浓缩:将离心上清液用真空旋转蒸发的方式浓缩至原体积的1/15。
[0027]4.醇沉:取浓缩液，加入4倍体积的95%乙醇，4 °C静置6 h，离心收集沉淀物，用无水乙醇洗涤3次，挥干乙醇，得到文蛤多糖粗品。多糖得率为85 mg/g干重。
[0028]实施例2柱层析分离纯化文蛤多糖
采用DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析阶段洗脱文蛤粗多糖
以0，0.1和0.3mol/L NaCl为洗脱液进行阶段洗脱，上样30 mg/mL的文蛤粗多糖溶液
4mL，流速2 mL/min，各浓度NaCl溶液各洗脱3个柱体积，收集糖含量最多的用0.lmol/LNaCl洗脱的洗脱组分D2，收集组分D2。
[0029]采用Superdex 200凝胶过滤柱层析阶段洗脱文蛤粗多糖
将收集的组分D2浓缩至浓度约15 mg/mL,以去离子水作为洗脱液，上样量0.5 mL,流速0.3 mL/min,用Superdex 200凝胶过滤柱进行进一步分离纯化,得到两个多糖峰D21和D22组分，分别经过色谱柱法检测为单一峰，为文蛤多糖纯品。
[0030]实施例3文蛤多糖的抗氧化活性
对分离得到的文蛤多糖进行体外抗氧化活性检测，将文蛤多糖配成5、4、2、1、0.5、
0.25,0.125 mg/ml的浓度，然后利用抗氧化模型进行体外抗氧化活性检测，检测指标有DPPH清除率、超氧离子清除率 、羟自由基清除率、总还原能力。[0031]实施例4文蛤多糖抗氧化口服液的制备
对得到的文蛤多糖组分D21、D22进行酵母脱腥法脱腥，加入酵母量为2 %，发酵30min。最终以多糖浓度lmg/ml，蜂蜜7%，柠檬酸0.15%—起121 °C灭菌15 min得到文蛤多糖口服液。该口服液具有良好`的抗氧化能力。
【权利要求】
1.一种文蛤多糖的提取方法，其特征在于该方法以文蛤软体为原料匀浆，加酶辅助热水浸提、浓缩、乙醇沉淀得到文蛤多糖粗品，再经过Sevage法脱去蛋白后，依次通过阴离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化，最终得到文蛤多糖精品，其纯度达到90%以上；具体步骤为: ①加酶辅助水浸提:将文蛤软体匀浆，加5倍质量的去离子水混合，加入胰蛋白酶，加酶量为底物质量的2%，50-55 °C浸提4-5 h，离心分离取上清； ②浓缩、醇沉:将上清液浓缩至原来的1/10，加入3倍体积的无水乙醇，4°C静置过夜，离心收集沉淀物，用无水乙醇洗涤，挥干乙醇； ③Sevage法脱蛋白，冻干:将上述(2)中得到的多糖粗品用水复溶，按体积比1:1加入sevage试剂，振荡I h，用分液漏斗静置去除上层有机试剂及中间固体，然后旋转蒸发去除残余有机试剂，冻干得文蛤多糖粗品； ④阴离子交换柱纯化:将文蛤多糖粗品溶于水，过0.22 μ m滤膜，然后用DEAE-52纤维素柱对文蛤多糖粗品进行纯化，采用去离子水进行平衡，分别用0、0.1,0.3mol/L NaCl进行阶段洗脱，每个浓度溶液洗脱2-3个柱体积，流速2 mL/min，每个浓度各洗脱得到一个峰，收集D2组分； ⑤凝胶过滤柱纯化:将收 集的D2组分浓缩,采用Superdex200凝胶过滤柱进行进一步纯化，用去离子水2.5倍柱体积进行洗脱，流速为0.3 mL/min,得到两个多糖峰D21和D22组分，为文蛤多糖纯品； ⑥冷冻干燥:将D21和D22组分进行冷冻干燥，制备文蛤多糖精品，D21组分呈白色疏松絮状，D22组分呈白色粉末状。
2.根据权利要求1所述的方法取得的文蛤多糖精品在保健品方面的应用方法，其特征为:添加文蛤多糖精品D21、D22中的一种或两种至终浓度为l-10mg/ml，配以蜂蜜、柠檬酸中的一种或两种作为辅料，即可得具有抗氧化作用的文蛤多糖口服液。
【文档编号】A23L1/09GK103694367SQ201310694648
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】史劲松 申请人:江南大学