专利名称：：一种从紫花地丁提取芹菜素的方法
技术领域：
：本发明涉及-种紫花地丁等药用植物的综合利用，更具体地说本发明提供了从紫花地丁中提取芹菜素的方法，大大地提高芹菜素得率和纯度，因此本发明属于从紫花地丁等药用植物提取生物制品的领域。
背景技术：
：芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，有"植物雌激素"之称，具有较强的生物学活性。芹菜素以植物黄色素的形式存在于多种植物中，纯品外观为黄色粉末，无嗅无味。是天然抗氧化剂。化学名为5，7，4'一三羟基黄酮，分子式及分子量为d5Hi。05和270.25，熔点347.5'C，几乎不溶于水，微溶于热酒精，溶于稀K0H溶液。研究表明，芹菜素具有神经保护、抗氧化、自由基清除剂、抗肿瘤、抗炎、碳水化合物代谢促进因子、免疫调节剂等作用，并且与其它黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比具有低毒、无诱变性等特点。它可以通过抑制肿瘤细胞生长、侵袭、转移和新生血管形成等多种途径发挥抗肿瘤作用。因此，芹菜素有望成为治疗肿瘤的一种新的药物，同时也增强了人们从天然植物中制备抗肿瘤化学药物的信心。在国外其肿瘤的化学预防作用及其机制已得到较为深入的研究，而近年来斧菜素的其他药理药效作用也得到日益广泛的关注和研究。目前，国内对芹菜素抗炎症、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物学活性研究较多。由此可见芹菜素具有广阔的应用前景。目前，斧菜素也可以采用半合成的方式获得，但是合成的芹菜素经药理实验发现效果不佳，这可能是芹菜素有四种类型，合成只能是其中的一种类型而已，所以市场上采用半合成的芹菜素很少见。因此，芹菜素和芹菜甙一般是从芹菜中提取，例如，传统的芹菜素制备工艺为①芹菜甙(Apiin)，用酸煮沸、水解；②以芹菜素7-0-葡萄糖甙(Apigenin7-O-glucoside)，用苦杏仁酶进行水解或以15%H2S04水解(TheMerkIndex.l3rd，2001年.P123)。由于芹菜中芹菜素和芹菜甙的含量低，因而提取率低，成本高，难以满足日益增长的市场需求，目前不宜工业化生产。因此，从芹菜的替代物中寻找合适的提取方法，成为迫在眉睫的需求。中国专利号为CN1284492提出了用石崖茶中提取开菜素和齐菜武混合物，虽然石崖茶中芹菜素含量高，但是其药理活性不高，这可能与不同植物中芥菜素类型不同有关。紫花地丁(ViolaPhilippicaCav.ssp.mudaw.Beck.)，又名光萼堇菜、地丁菜、独行虎、紫地丁、二月兰、山茄子，为堇菜科堇菜属植物，多年生莲座状草本，高714厘米，无地上茎，地下茎很短，主根较粗，全株被短白毛。《本草正义》誉其为痈肿疔毒通用之药。目前，紫花地丁作为中草药被广泛应用，而对其所含有效成分的开发利用很少。紫花地丁中含有机酸、黄酮及甙类、酚性成分、糖类、氨基酸、多肽及蛋白质、皂甙、植物甾醇、鞣质等多种有效成分，其中有效成分芹菜素具有多种药理学作用。民间广泛用于痈疽疮毒、毒蛇咬伤、狗咬伤、丹毒、蜂窝组织炎、黄疸、尿路感染，说明它们具有较好的抗菌、消炎、解毒作用。借鉴民间经验和现代研究，堇菜属植物可用于治疗风热咳嗽、肺痨、哮喘及鼻炎、角膜炎、咽炎、乳腺炎、风湿病、疔痈疮疖、丹毒、蜂窝组织炎、毒蛇咬伤、黄疸、尿路感染等。由于紫花地丁本身作为一种中草药，从以前研究文献报道其药理活性很高，与芹菜的药理活性相当，其资源丰富、采收方便，利用其进行齐菜素等生物活性成分的提取、纯化具有很好的开发前景。因此，本发明的目的是提供一种以天然的紫花地丁植物为原料，研发一种成本低，药理活性高，适于工业化生产的芹菜素的方法。
发明内容本发明采用的技术方案包括干燥过后的紫花地丁经用甲醇溶液提取、过滤、减压浓缩，然后用树脂吸附、乙醇洗脱、将洗脱液浓缩，结晶制得芥菜素纯品。因此，本发明提供一种从紫花地丁提取芹菜素的方法，步骤包括1)粉碎紫花地丁，加入甲醇或乙醇进行超声处理，离心，保留上清液；2)再用甲醇或乙醇抽提一次沉淀物，合并两次上清液并进行浓縮；3)加入石油醚进行萃取后，再加入乙酸乙酯进行萃取并进行浓缩，得浓縮液；4)用大孔吸附树脂LSA-IO、硅胶层析柱依次进行吸附分离，并将洗脱物减压浓縮干燥，其中LSA-10层析柱的洗脱液为甲醇或乙醇溶液，硅胶层析柱的洗脱液为氯仿-甲醇溶液，并且在硅胶层析柱进行2次上柱洗脱；5)在干燥物中加入丙酮加热并使之充分溶解，趁热过滤；6)将滤液低温过夜结晶，得到黄色晶体，抽滤，得到芹菜素初品，重结晶得到纯品。在一个实施方案中，步骤l中为70%的甲醇或乙醇，优选在50。C下进行超声波处理。在另一个实施方案中，将步骤2得到的两次上清液浓縮50倍后，在步骤3中加入1.5倍体积的石油醚进行萃取，其中优选萃取3-5次。其中，在一个具体实施方案中，步骤3中石油醚或乙酸乙酯的萃取过程可以互换。在另一个实施方案中，其中步骤4中，LSA-10层析柱的洗脱液为30-80%的甲醇或乙醇溶液；第i次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25:10)的氯仿-甲醇，第2次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25:25)的氯仿-甲醇。还在另一个实施方案中，步骤5中优选在56t:下加热回流2h，并乘热过滤。在一个具体实施方案中，步骤6的结晶温度是4'C直至室温。技术效果1、整个分离过程中对环境条件要求不高，分离时间短，纯度高。2、本纯化过程中采用的分离材料是大孔吸附树脂LSA-10和硅胶，其分离操作过程简单，易得便宜，易控制。3，采用结晶和重结晶进行纯化，工艺简单，易于操作，纯化效率高。4、本方法涉及的所有工业制剂均可回收利用，既节约了成本，又避免了环境污染。图1:从紫花地丁中提取的芹菜素的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。图2:从石崖茶中提取的开菜素的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例1:称取紫花地丁粉末500kg，加入70%的甲醇4000L在50。C下超声处理10min，提取30min后离心1(|min(3000r/min),沉淀物再用70%的甲醇1000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓縮，浓縮至约100L，向浓縮液中加入石油醚40L进行萃取，取下层，对浓縮液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共160L，再用乙酸乙酯40L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共160L，对萃取液进行浓縮，得乙酸乙酯浓縮液，在通风柜中于60X:下烘干。用40。C的50。/。乙醇IOL完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70%乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓縮得浓縮液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:10)IOOL洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:25)200L洗脱得到洗脱物，并减压浓縮至干，加入丙酮1L在56'C下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共106g，重结晶一次，得96g。所得芹菜素样品进行纯度，其检测仪器为LC-9A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，色谱柱为KromasiLU柱(250X4.6mmi.d，5um)，流动相为1.92%乙酸、38.46%甲醇、19.23乙腈、1.92%磷酸的水溶液，检测波长350nm;柱温30'C;流速0.6mL/min;上样量为5uL。检测所得到芹菜素的纯度为95.80%,结果如表l和图l所示。其中，图1可知，从紫花地丁中提取的齐菜素，其HPLC具有两个明显的特征峰值1893、2484，表明从紫花地丁提取的芹菜素纯度高，区分度好。对照实施例称取石崖茶粉末500kg，按照实施例1的方法提取并检测开菜素，其纯度为94.70%，结果如表1和图2所示。由图2可知，其HPLC特征峰值也很明显1812、2476，表明从石崖茶提取的芹菜素纯度高。但是将图1与图2比较，图2少了两个峰，也就是说在石崖茶中只有两种类型的芹菜素，而另外两种芹菜素在石崖茶可能没有，这可能是造成从石崖茶中提取出的芹菜素药理活性不高的根本原因。因为余杰在石崖茶抗氧化、抑菌作用和毒理试验的研究结果表明:石崖茶类黄酮(开菜素)只具有较强的抗氧化作用。从芹菜和紫花地丁提取的芹菜素是具有降压、安神、降血脂、保护血管和增强免疫力等功能(TsiD,TanBK.Effectsofceleryextractand3-N-bu-tylphthalideonlipidlevelingeneticallyhypercho-lesterolaemic(RICO)rats.ClinExpPharmacolPhysiol,1996,23(3):214217.)。实施例2:称取紫花地丁粉末1000kg，加入70%的甲醇8000L在50'C下超声处理10min，提取30min后离心10min(3000r/min)，沉淀物再用70%的甲醇2000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓縮，浓縮至约200L，向浓縮液中加入石油醚80L进行萃取，取下层，对浓縮液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共320L，再用乙酸乙酯80L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共320L，对萃取液进行浓縮，得乙酸乙酯浓縮液，在通风柜中于60。C下烘干。用40。C的50。/。乙醇20L完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70%乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓縮得浓缩液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:10)200L洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:25)400L洗脱得到洗脱物，并减压浓縮至干，加入丙酮1L在56"C下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共205g，重结晶一次，得195g。按照实施例1的方法进行纯度检测，得到芹菜素的纯度为96.20%，结果如表l所示。实施例3:称取紫花地丁粉末300kg，加入70%的乙醇2000L在50。C下超声处理10min，提取30min后离心10min(3000r/min)，沉淀物再用70%的乙醇1000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓縮，浓縮至约50L，向浓縮液中加入石油醚30L进行萃取，取下层，对浓縮液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共120L，再用乙酸乙酯30L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共120L，对萃取液进行浓縮，得乙酸乙酯浓縮液，在通风柜中于60'C下烘干。用40X:的50。/。乙醇IOL完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70%乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓縮得浓縮液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:10)80L洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:25)160L洗脱得到洗脱物，并减压浓縮至干，加入丙酮1L在56'C下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共90.5g，重结晶一次，得80g。按照实施例1的方法进行纯度检测，得到芹菜素的纯度为96.45%，结果如表1所示。实施例4:称取紫花地丁粉末1500kg，加入70%的甲醇10000L在50。C下超声处理10min，提取30min后离心10min(3000r/min)，沉淀物再用70%的甲醇5000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓縮，浓縮至约200L，向浓缩液中加入石油醚100L进行萃取，取下层，对浓縮液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共400L，再用乙酸乙酯100L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共400L，对萃取液进行浓縮，得乙酸乙酯浓縮液，在通风柜中于60。C下烘干。用40。C的50。/o乙醇40L完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70%乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓縮得浓縮液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:10)400L洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25:25)800L洗脱得到洗脱物，并减压浓縮至干，加入丙酮5L在56T下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共338g，重结晶一次，得314g。按照实施例1的方法进行纯度检测，得到芹菜素的纯度为98.65%，结果如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1一种从紫花地丁提取芹菜素的方法，步骤包括1)粉碎紫花地丁，加入甲醇或乙醇进行超声处理，离心，保留上清液；2)再用甲醇或乙醇抽提一次沉淀物，合并两次上清液并进行浓缩；3)加入石油醚进行萃取后，再加入乙酸乙酯进行萃取并进行浓缩，得浓缩液；4)用大孔吸附树脂LSA-10、硅胶层析柱依次进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中LSA-10层析柱的洗脱液为甲醇或乙醇溶液，硅胶层析柱的洗脱液为氯仿-甲醇溶液，并且在硅胶层析柱进行2次上柱洗脱；5)在干燥物中加入丙酮加热并使之充分溶解，趁热过滤；6)将滤液低温过夜结晶，得到黄色晶体，抽滤，得到芹菜素初品，重结晶得到纯品。2.权利要求1的方法，其中步骤1中为70%的甲醇或乙醇，优选在5(TC下进行超声波处理。3.权利要求1或2的方法，其中将步骤2得到的两次上清液浓縮50-80倍后，在步骤3中加入1.5-3倍体积的石油醚进行萃取，其中优选萃取3-5次。4.权利要求3的方法，其中步骤3中石油醚或乙酸乙酯的萃取过程可以互换。5.权利要求1-4任一项的方法，其中在步骤4中，LSA-10层析柱的洗脱液为30-80%的甲醇或乙醇溶液；第1次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25:10)的氯仿-甲醇，第2次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25:25)的氯仿-甲醇。6.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤5中优选在56'C下加热回流2h，并乘热过滤。7.权利要求1-6任一项的方法，其中步骤6的结晶温度是4'C直至室温。全文摘要本发明提供了一种从紫花地丁中提取芹菜素的方法，大大地提高芹菜素得率和纯度。提出了一整套从紫花地丁分离提取得到高纯度的芹菜素，采用醇提超声处理，离心，浓缩，萃取，大孔吸附树脂LSA-10与层析柱硅胶吸附层析，连续分离，浓缩，丙酮结晶，得到芹菜素纯品。整个分离过程中对环境条件要求不高，分离时间较短，纯度高。分离材料易得便宜，分离操作过程简单，易控制，采用结晶和重结晶，纯化效率高。文档编号C07D311/00GK101648935SQ200910170069公开日2010年2月17日申请日期2009年9月2日优先权日2009年9月2日发明者董爱文申请人:董爱文