脂肪分解酶及其在食品工业中的应用的制作方法

专利名称：：脂肪分解酶及其在食品工业中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的脂肪分解酶，特别是新的脂肪分解酶，和编码它的核苷酸序列。本发明还涉及新的脂肪分解酶的制备方法及其应用。本发明还涉及脂肪分解酶的方法及应用。
背景技术：
：EP1193314中教导了对糖脂有活性的脂肪分解酶在面包制作中的有益应用。教导了，发现部分水解产物溶血糖脂具有很高的乳化剂功用。可是，也发现EP1193314中教导的酶对甘油三酯具有显著的非选择性活性，会造成不必要的高游离脂肪酸。EP0869167中教导了来自尖镰孢(Fusariumoxysporum)的具有磷脂酶活性的脂肪分解酶。该脂肪分解酶具有高的三酰基甘油酯水解(脂肪酶)活性。该酶现在由NovozymesA/S(丹麦)以LipopanF来销售。W002/00852披露了五种脂肪酶和它们的编码多核苷酸，它们分离自Fusariumvenenatum、F.sulphureum、Aspergillusberkeleyanum、黄色键抱(F.culmorum)禾口腐皮键孢(F.solani)。所有五种酶据说具有三酰甘油水解活性、磷脂酶和半乳糖脂酶活性。已经生成了带有特定氨基酸替代和融合的脂肪分解酶变体；其中一些与野生型亲本酶相比，对极性脂质具有增强的活性。W001/39602记载了这样一种变体，其称为SP979，是ThermomycesIanuginosus脂肪酶和EPO869167中记载的尖镰孢脂肪酶的融合物。已经发现该变体对磷脂和糖脂具有与甘油三酯相比显著高比率的活性。W002/094123中发现了，通过选择对生面团中的极性脂质(糖脂和磷脂)有活性但对甘油三酯或ι-单-甘油酯基本上无活性的脂肪分解酶，可获得改良的功用。在共同未决的PCT申请PCT/IB2005/000875中教导了，与甘油三酯相比，对极性脂质具有更高比率活性的野生型脂肪分解酶。可是，该文献没有教导来自链霉菌属(Str印tomyces)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或棒杆菌属(Corynebacterium)物种的月旨肪分解酶。在本发明之前，没有公开过来自链霉菌属菌种的对糖脂具有活性或显著活性的脂肪分解酶。同样，没有公开过来自喜热裂孢菌属物种或棒杆菌属物种的对糖脂具有活性或显著活性的脂肪分解酶。尽管已经从链霉菌属菌种中分离到了脂肪酶，即三酰甘油水解酶(参见例如Vujaklija等，ArchMicrobiol(2002)178124-130)，这些酶从未鉴定为具有糖脂水解活性。
发明内容本发明依据来自链霉菌属的具有显著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大发现。具体而言，来自链霉菌属的脂肪分解酶具有显著的半乳糖脂水解活性和/或显著的半乳糖脂酰基转移酶活性，特别是在应用于根据本发明的方法和用途时。另外，本发明依据来自喜热裂孢菌属或棒杆菌属的具有显著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大发现。具体而言，来自喜热裂孢菌属或棒杆菌属的脂肪分解酶具有显著的半乳糖脂水解活性和/或显著的半乳糖脂酰基转移酶活性，特别是在应用于本发明的方法和用途时。在一个广的方面，本发明涉及至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从链霉菌属菌种得到的。在另一方面，本发明涉及至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码a)包含SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遗传密码简并而与SEQIDNo.3的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。本发明还进一步提供包含SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在另一方面，本发明提供至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供编码脂肪分解酶的核酸，该脂肪分解酶包含SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列。SEQIDNo.3如图3所示，而SEQIDNo.4如图4所示。本发明还进一步提供编码脂肪分解酶的核酸，该核酸选自下组a)包含SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遗传密码简并而与SEQIDNo.3的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。本发明还进一步提供根据本发明的脂肪分解酶在用于制备溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油单酯(DGMG)或单半乳糖苷甘油单酯(MGMG))的底物(优选食品)中的应用，其用根据本发明的脂肪分解酶处理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或单半乳糖苷甘油二酯(MGDG))来产生部分水解产物，即溶血糖脂。在另一方面，本发明提供根据本发明的脂肪分解酶在用于制备溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的底物(优选食品)中的应用，其用根据本发明的酶处理磷脂(如卵磷脂)来产生部分水解产物，即溶血磷脂。在一个广的方面，本发明涉及制备食品的方法，该方法包括将本发明的脂肪分解酶与食品的一种或多种成分混合。本发明的另一个广的方面涉及由生面团制备焙烤品的方法，该方法包括将本发明的脂肪分解酶与生面团混合。在另一方面，本发明涉及制备乳制品的方法，该方法包括将本发明的脂肪分解酶与乳制品的一种或多种成分混合。在另一方面，本发明涉及本发明的脂肪分解酶在制备乳制品中的应用，以降低一种或多种以下有害效应臭味和/或异味和/或油腻口味。在本发明的另一方面，提供根据本发明的脂肪分解酶在处理蛋或基于蛋的产品中的应用，以产生溶血磷脂。在本发明的另一方面，提供根据本发明的脂肪分解酶在处理蛋或基于蛋的产品中的应用，以产生溶血糖脂。本发明的另一方面提供植物或食用油的酶促脱胶方法，其包括用根据本发明的脂肪分解酶处理所述食用或植物油，从而水解极性脂质(如磷脂和/或糖脂)的主要部分。在另一方面，本发明提供根据本发明的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用。在另一方面，本发明提供根据本发明的脂肪分解酶在用于降低食用油中磷脂含量的方法中的应用，其包括用根据本发明的脂肪分解酶处理所述油，从而水解磷脂的主要部分，并将含水解磷脂的水相与油分开。还提供了制备根据本发明的脂肪分解酶的方法，该方法包括用包含编码脂肪分解酶的核苷酸序列的重组核酸转化宿主细胞，该宿主细胞能表达编码脂肪分解酶多肽的核苷酸序列，在核酸表达的条件下培养经转化宿主细胞并收获脂肪分解酶。在另一方面，本发明涉及根据本发明的脂肪分解酶在生物转化极性脂质(优选糖脂)以制造高价值产品，诸如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟酸酯中的应用。本发明的另一方面涉及根据本发明的脂肪分解酶在植物或食用油的酶促脱胶方法中的应用，其包括用所述脂肪分解酶处理所述食用或植物油，从而水解极性脂质的主要部分。本发明的另一方面涉及根据本发明的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用。本发明还进一步涉及根据本发明的固定化的脂肪分解酶。本发明的另一方面涉及制备溶血糖脂的方法，其包括用至少一种脂肪分解酶处理含糖脂的底物来产生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明的另一方面涉及制备溶血磷脂的方法，其包括用至少一种脂肪分解酶处理含磷脂的底物来产生所述溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明的另一方面涉及植物或食用油的酶促脱胶方法，其包括用可从以下属之一得到的能水解极性脂质主要部分的脂肪分解酶处理所述食用或植物油链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明还涉及生物转化极性脂质以制造高价值产品的方法，其包括用可从以下属之一得到的脂肪分解酶处理所述极性脂质来产生所述高价值产品链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质。本发明的另一方面涉及制备食品的方法，其包括将至少一种脂肪分解酶与食品的一种或多种成分混合，其中所述脂肪分解酶能将存在的糖脂和/或磷脂水解进或成至少一种所述成分，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明的另一方面涉及脂肪分解酶在用于制备溶血磷脂的底物中的应用，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明另外涉及可从以下属之一得到的脂肪分解酶用于植物或食用油的酶促脱胶从而水解极性脂质主要部分的应用链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明的另一方面涉及可从以下属之一得到的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明的另一方面涉及脂肪分解酶在生物转化极性脂质以制造高价值产品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明的另一方面涉及可从以下属之一得到的脂肪分解酶在制备食品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂和/或磷脂链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。本发明的各方面出现在权利要求中以及以下注释中。关注可用于本发明的核苷酸序列的其它方面包括包含本发明的序列的构建物；包含本发明中应用的序列的载体；包含本发明中应用的序列的质粒；包含本发明中应用的序列的转化细胞；包含本发明中应用的序列的转化组织；包含本发明中应用的序列的转化器官；包含本发明中应用的序列的转化宿主；包含本发明中应用的序列的转化生物体。本发明还涵盖利用本发明中应用的核苷酸序列来表达它的方法，诸如在宿主细胞中表达；包括转移它的方法。本发明进一步涵盖分离核苷酸序列的方法，诸如从宿主细胞分离。关注可用于本发明的氨基酸序列的其它方面包括编码本发明中应用的氨基酸序列的构建物；编码本发明中应用的氨基酸序列的载体；编码本发明中应用的氨基酸序列的质粒；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化细胞；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化组织；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化器官；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化宿主；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化生物体。本发明还涵盖利用本发明中应用的氨基酸序列来纯化它的方法，诸如在宿主细胞中表达；包括转移它且然后纯化所述序列的方法。为了便于参考，现在在合适的小节标题下论述本发明的这些和其它方面。可是，每个小节下的教导不必局限于每个特定的小节。具体实施例方式适宜地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQIDNo.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码的脂肪分解酶。优选地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从链霉菌属菌种得到的。在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶优选是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码a)包含SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遗传密码简并而与SEQIDNo.3的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶优选是包含SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶优选是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列。优选地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从喜热裂孢菌属物种，优选褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)得到的。优选地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从棒杆菌属物种，优选Corynebacteriumefficiens得到的。在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQIDNo.3、6、9、13,15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码的脂肪分解酶。在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQIDNo.5、7、8、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQID似.5、7或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。更优选地，在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ.ID.No.16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ.ID.No.12或14所示的氨基酸序列或与其具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%或98%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQIDNo.8所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码a)包含SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遗传密码简并而与SEQIDNo.3的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，根据本发明的脂肪分解酶可以是可从，优选就是从链霉菌属菌株L130或L131得到的，根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约，它们于2004年6月23日由DaniscoA/S(Langebrogade1,DK-1001CopenhagenK，丹麦)保藏于国家工业、海洋和食品细菌保藏中心(NCIMB)(23StMacharStreet,AberdeenScotland，GB)，编号分别为NCIMB41226和NCIMB41227。优选地，根据本发明的脂肪分解酶至少作用于糖脂，诸如例如二半乳糖苷甘油二酯(D⑶G)。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶还可作用于一种或多种其它极性脂质底物，诸如磷脂，例如卵磷脂，如磷脂酰胆碱。本文中所用的术语“能水解糖脂”的可选表述方式可以说成脂肪分解酶具有糖脂水解活性。优选地，根据本发明的脂肪分解酶水解糖脂，诸如例如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)，而且也水解磷脂，诸如卵磷脂，如磷脂酰胆碱。优选地，根据本发明的脂肪分解酶作用于糖脂，诸如D⑶G或MGDG。在一个方面，根据本发明的脂肪分解酶将DGDG水解成DGMG和/或将MGDG水解成MGMG。在一个方面，根据本发明的脂肪分解酶将卵磷脂水解成溶血卵磷脂。在脂肪分解酶至少能将酰基从糖脂转移至供体底物的情况中，极性脂质底物在本文中可称为“脂质酰基供体”。在一个实施方案中，根据本发明的酶既具有磷脂酶和/或糖脂酶活性(根据国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会的酶命名法建议(1992)，通常归入E.C.3.1.1.26；E.C.3.1.1.4或E.C.3.1.1.32)，又具有酰基转移酶活性(通常归入E.C.2.3.1.χ)，由此该酶能将酰基从脂质酰基供体转移至一种或多种受体底物，诸如以下一种或多种留醇；甾烷醇(stanol)；碳水化合物；蛋白质；蛋白质亚基；甘油。共同未决的国际专利申请PCT/IB2004/000655中教导了脂质酰基转移酶及其应用。将该文件引入本文作为参考。可是，PCT/IB2004/000655中没有教导根据本发明来自链霉菌属的脂肪分解酶。在有些方面，应用于本发明的方法和/或应用中的脂肪分解酶可能能将酰基从极性脂质(如本文所定义的)转移至一种或多种以下酰基受体底物留醇、留烷醇、碳水化合物、蛋白质或其亚基、或甘油。对于有些方面，根据本发明的“酰基受体”可以是包含羟基(-0H)的任何化合物，诸如例如多元醇，包括甘油；留醇；留烷醇；碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚基，诸如例如氨基酸、蛋白质水解产物和肽(部分水解的蛋白质)；及其混合物和衍生物。在有些方面，根据本发明的“酰基受体”可优选不是水。在一个实施方案中，酰基受体优选不是甘油单酯和/或甘油二酯。在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至留醇和/或留烷醇。在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至碳水化合物。在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至蛋白质或其亚基。适宜地，蛋白质亚基可以是以下一种或多种氨基酸、蛋白质水解产物、肽、二肽、寡肽、多肽。适宜地，在蛋白质或蛋白质亚基中，酰基受体可以是一种或多种以下蛋白质或蛋白质亚基成分丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸。当蛋白质亚基是氨基酸时，适宜地，氨基酸可以是任何合适的氨基酸。适宜地，氨基酸可以是例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸中的一种或多种。在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至甘油。在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至羟酸。在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至多元醇。在一个方面，脂肪分解酶可能既能将酰基从脂质转移至留醇和/或留烷醇，又能将酰基从脂质转移至以下一种或多种碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚基、甘油。本文中所用的术语卵磷脂涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。对于有些方面，优选脂质底物至少是糖脂，诸如例如D⑶G。对于有些方面，优选脂质底物也可以是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。根据本发明的其它磷脂底物可以是N酰基磷脂酰乙醇胺(APE)或N酰基溶血磷脂酰乙醇胺(ALPE)中的一种或多种。优选脂质底物是食物脂质，也就是说是食品的脂质成分。对于有些方面，优选根据本发明的脂肪分解酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。在一个实施方案中，根据本发明的脂肪分解酶对甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯无活性或无显著活性。适宜地，脂质底物或脂质酰基供体可以是一种或多种以下底物中存在的一种或多种脂质脂肪，包括猪油、牛脂和黄油脂肪；油，包括提取自或衍生自棕榈油、向日葵油、大豆油、红花油、棉籽油、落花生油、玉米油、橄榄油、花生油、椰子油和油菜籽油的油。来自大豆、油菜籽或蛋黄的卵磷脂也是合适的脂质底物。脂质底物可以是燕麦脂质或其它基于植物的含半乳糖脂的材料。在一个方面，脂质底物或脂质酰基供体优选是蛋黄中的卵磷脂(诸如磷脂酰胆碱)。对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有8至22个碳的脂肪酸链长度的脂质。对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有16至22个碳的脂肪酸链长度的脂质，更优选16至20个碳。对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有不超过14个碳的脂肪酸链长度的脂质，适宜地选自具有4至14个碳的脂肪酸链长度的脂质，适宜地4至10个碳，适宜地4至8个碳。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶至少展现糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶也可展现磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶Al活性(E.C.3.1.1.32)。对于有些方面，根据本发明的脂肪分解酶可只具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。对于有些方面，根据本发明的脂肪分解酶是半乳糖脂酶(E.C.3.1.1.26)。可是，酶定为半乳糖脂酶的事实并不妨碍其具有其它附带活性，诸如针对例如其它极性脂质的活性。本文中所用的术语“糖脂酶活性”和“半乳糖脂酶活性”可互换使用。适宜地，对于有些方面，根据本发明的脂肪分解酶可能能将酰基从糖脂和/或磷脂转移至一种或多种受体底物。适宜地，受体底物可以是一种或多种以下底物留醇、留烷醇、碳水化合物、蛋白质、甘油。本文中所用的术语“极性脂质”指磷脂和/或糖脂。在有些方面，术语极性脂质优选至少指糖脂。酶的糖脂酶活性；磷脂酶活性和/或三酰甘油脂肪酶活性可用下文介绍的测定法来测定。半乳糖脂酶活性的测定(糖脂酶活性测定法(GLU-7))底物将0.6%二半乳糖苷甘油二酯(SigmaD4651),0.4%Triton-XIOO(SigmaX-IOO)和5mMCaCl2溶于pH7的0.05MHEPES缓冲液。测定流程将400μL底物加到1.5mLEppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37°C放置5分钟。在时间t=0分钟时，加入50yL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37°C以IOxlOOrpm混合10分钟。在时间t=10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99°C放置10分钟，以终止反应。使用WAKOGmbH的NEFAC试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH7的酶活性GLU。磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性测定法(PLU-7))底物将0.6%L-α磷脂酰胆碱，95%植物(Avanti#441601)、0.4%Triton-X100(SigmaX-100)和5mMCaCl2散布于pH7的0.05MHEPES缓冲液。测定流程将400μL底物加到1.5mLEppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37°C放置5分钟。在时间t=0分钟时，加入50yL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37°C以IOxlOOrpm混合10分钟。在时间t=10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99°C放置10分钟，以终止反应。使用WAKOGmbH的NEFAC试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH7的酶活性PLU-7。三酰甘油酯脂肪酶活性的测定基于甘油三酯(三丁精)作为底物的的测定法(LIPU)基于三丁精的脂肪酶活性根据FoodChemicalCodex(第四版，NationalAcademyPress,1996,ρ803)来测量。其中的改变是，将样品溶于去离子水来代替甘氨酸缓冲液，而PH计设置点为5.5来代替7。ILIPU定义为在测定条件下每分钟能释放出1微摩尔丁酸的酶量。在一个实施方案中，优选根据本发明的脂肪分解酶是野生型脂肪分解酶。本文中所用的术语“天然”和“野生型”指天然存在的酶。也就是说是，由内源遗传密码表达和从其内源宿主生物体中分离的酶，和/或与内源产生的成熟蛋白质序列(在共翻译和翻译后切割事件之后)相比尚未突变(即不含氨基酸删除、添加或替代)的异源产生的酶。本发明的天然和野生型蛋白质可由为了异源表达而优化了密码子的多核苷酸编码，而且也可包含为了在该宿主中表达而选择的非内源信号肽。本文中所用的术语“变体”指由非内源遗传密码表达的蛋白质，其造成与天然或野生型序列相比成熟蛋白质序列内的一个或多个氨基酸改变(即氨基酸删除、添加或替代)。优选地，根据本发明的脂肪分解酶是可从(适宜地，可以是从)细菌得到的。优选地，根据本发明的脂肪分解酶可以是可从(优选从)链霉菌属菌种得到的。优选地，根据本发明的脂肪分解酶可以是可从(优选从)链霉菌属菌株L131或链霉菌属菌株L130得到的。优选地，根据本发明的脂肪分解酶包含与SEQIDNo.4所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少90%、优选至少95%、优选至少98%、优选至少99%同一性的氨基酸序列。优选地，编码根据本发明的脂肪分解酶的核酸包含与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、优选至少95%、优选至少98%、优选至少99%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，酶对半乳糖脂底物的最优pH适宜地是约6-8，优选约6.5-7.5，更优选约7。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶可不受小麦粉中存在的脂肪酶抑制剂的抑制或显著抑制。本文中所用的术语“不受显著抑制”指根据本文中定义的标准磷脂酶(PUU-T)测定法，与Lip0panFTM(N0V0ZymeSA/S，丹麦)的等效剂量(PLU)相比，酶对小麦粉中存在的脂肪酶抑制剂较不敏感。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶能将底物(即例如食品如生面团中的)中的至少10%半乳糖脂二酯水解成单酯。优选地，酶能将至少20%、更优选至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%半乳糖脂二酯水解成单酯。适宜地，半乳糖脂二酯可以是MGDG或D⑶G中的一种或多种，而单酯可以分别是MGMG或DGMG中的一种或多种。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶可分离自链霉菌属菌株L131或链霉菌属菌株L130的发酵液。适宜地，酶可通过液相色谱来纯化。纯化的脂肪分解酶的氨基酸序列可通过Edman降解、LC-MS和MALDI-T0F分析来测定。适宜地，本文中所定义的酶可催化一种或多种以下反应酯交换(interesterification)、酉旨转移(transesterification)、醇角军、/K角军。术语“酯交换”指酶促催化的酰基在脂质供体和脂质受体间的转移，其中脂质供体不是游离酰基。本文中所用的术语“酯转移”指酶促催化的酰基从脂质供体(除了游离脂肪酸)至酰基受体(除了水)的转移。本文中所用的术语“醇解”指通过与醇ROH反应来酶促切割酸衍生物的共价键，使得产物之一与醇的H结合而另一种产物与醇的OR基团结合。本文中所用的术语“醇”指含羟基的烃基化合物。本文中所用的术语“水解”指酶促催化酰基从脂质至水分子OH基团的转移。水解造成的酰基转移需要解离水分子。本文中所用的术语“食品”指适合人和/或动物消费的物质。适宜地，本文中所用的术语“食品”可指做好消费准备的形式的食品。可是，或者/另外，本文中所用的的术语食品可指用于制备食品的一种或多种食物材料。仅作为示例，术语食品涵盖由生面团产生的焙烤品以及用于制备所述焙烤品的生面团。在一个优选的方面，本发明提供上文定义的食品，其中所述食品选自以下一种或多种蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面团(sweetdough)产品，叠层面团产品(laminateddough)，液态奶蛋糊，松饼，油炸圈饼，饼干，薄脆饼干和曲奇饼；糖果，包括巧克力，糖果，饴糖，halawa，胶皮糖(gum)，包括无糖和加糖胶皮糖，泡泡糖，软泡泡糖，口香糖和布丁；冷冻产品，包括冰糕，优选冷冻乳制品，包括冰激凌和牛奶冻；乳制品，包括奶酪，黄油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳饮料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括经加工的肉制品；食用油和脂肪，搅打起泡和不起泡的产品，水包油乳状液，油包水乳状液，人造黄油，起酥油和涂抹物，包括低脂肪的和极低脂肪的涂抹物；调味品，蛋黄酱，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的汤，饮料，香料乳状液和沙司。适宜地，根据本发明的食品可以是“精制食物”，包括蛋糕、面粉糕饼、糖果、巧克力、奶油软糖等。在一个方面，根据本发明的食品可以是生面团产品或焙烤产品，诸如面包、油炸产品、小吃、蛋糕、馅饼、核仁巧克力饼、小甜饼、面条、零食诸如薄脆饼干、全麦薄脆饼干、椒盐脆饼干、和薯片、和意大利面制品。在另一方面，根据本发明的食品可以是植物衍生的食物产品，诸如面粉、预混合料、油、脂肪、可可油、人造稀奶油、色拉调味品、人造黄油、涂抹物、花生酱、起酥油、冰激凌、烹调油。在另一方面，根据本发明的食品可以是乳制品，包括黄油，牛奶，奶油，奶酪诸如各种形式的(包括切碎的、整块的、切片的或搓碎的)天然的、经加工的、和人造的干酪，奶油干酪，冰激凌，冷冻甜品，酸奶，酸奶饮料，黄油脂肪，脱水乳脂肪，其它乳制品。根据本发明的酶可提高乳制品中的脂肪稳定性。在奶酪中使用根据本发明的酶是特别有益的。所以，根据本发明的脂肪分解酶可有利地用于生产奶酪。脂肪分解酶催化牛奶中磷脂的水解，这有助于增加奶酪产量。优选地，在奶酪生产过程前或期间，可将根据本发明的脂肪分解酶加到牛奶(称为干酪用乳)中。在另一方面，根据本发明的食品可以是含有动物衍生成分的食物产品，诸如经加工的肉制品、烹调油、起酥油。在另一方面，根据本发明的食品可以是饮料、水果、水果什锦、蔬菜或葡萄酒。在有些情况中，饮料可含多达20g/l外加的植物甾醇。在另一方面，根据本发明的食品可以是动物饲料。动物饲料可强化了植物留醇和/或植物留烷醇，优选强化了谷留醇/留烷醇。适宜地，动物饲料可以是家禽饲料。当食品是家禽饲料时，本发明可用于降低以根据本发明的食品喂养的家禽所产蛋的胆固醇含量。在一个方面，优选食品选自以下一种或多种蛋，基于蛋的产品，包括蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品。优选地，根据本发明的食品是含水食品。适宜地，食品可包含10-98%的水，适宜地14-98%，适宜地18-98%的水，适宜地20-98%，适宜地40-98%，适宜地50-98%，适宜地70-98%，适宜地75-98%。对于有些方面，根据本发明的食品可以不是纯的植物衍生油，诸如例如橄榄油、向日葵油、花生油、油菜籽油。为了免除猜疑，在本发明的有些方面，根据本发明的食品可包含油，但该食品不是主要由油或油混合物构成的。对于有些方面，优选食品包含少于95%的脂质，优选少于90%的脂质，优选少于85%，优选少于80%的脂质。所以，对于本发明的有些方面，油可以是食品的成分，但优选食品本身不是油。专利申请W02004/064987，W02004/064537，PCT/IB2004/004374和GB0513859.9中教导了在食物应用中使用能转移酰基的脂肪分解酶的优势，将它们引入本文作为参考。游离脂肪酸的产生对食品可能是有害的。在食品中，游离脂肪酸与臭味和/或异味以及其他有害效应(包括诸如例如奶酪的乳制品中的油腻口味)有关。适宜地，在本发明的有些实施方案中，脂肪分解酶能将脂肪酸从脂质转移至酰基受体，例如留醇和/或甾烷醇。因此，食品中游离脂肪酸的整体水平不增加或仅仅增加到不显著的程度。所以，在奶酪生产中，根据本发明的能转移酰基的脂肪分解酶可提供一种或多种以下出乎预料的技术效果减少奶酪中的溢油(oiling-ofT)效应；增加奶酪产量；增强香味；降低恶臭；降低“油腻”口味。本文教导的能将酰基转移至碳水化合物以及留醇和/或留烷醇的脂肪分解酶的应用对于含蛋食品是特别有益的。具体而言，在蛋和蛋制品中，糖，特别是葡萄糖的存在常常视为是不利的。蛋黄可包含多达的葡萄糖。根据本发明，该不想要的糖可方便地通过“酯化”糖以形成糖酯来去除。食用油中存在甘油二酯是不利的。具体而言，食用油(特别是棕榈油)中的甘油二酯可导致油的品质低。适宜地，在本发明的有些实施方案中，本文教导的脂肪分解酶能将脂肪酸从脂质转移至酰基受体，这降低油中甘油二酯的水平，而不增加或显著增加游离脂肪酸的水平。本文教导的脂肪分解酶能水解食用或植物油中的磷脂的主要部分。这在植物或食用油的酶促脱胶中是高度有益的。适宜地，在本发明的有些实施方案中，脂肪分解酶可能能将脂肪酸从脂质转移至酰基受体。因此，有利的是，油中的游离脂肪酸的整体水平不增加或仅仅增加到不显著的程度。游离脂肪酸的产生对食用油可能是有害的。优选地，根据本发明的方法导致食用油脱胶，其中游离脂肪酸的积聚降低和/或消除。本发明的权利要求将解释为包括上文所列每种食品。在本文提及的有些应用中，特别是食物应用，诸如面包房应用，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种常规乳化剂一起使用，包括例如甘油单酯、脂肪酸甘油单酯和二酯的二酰基酒石酸酯、糖酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)和卵磷脂。另外/或者，根据本发明的酶可以与一种或多种其它合适的食用级酶一起使用。所以，除了本发明的脂肪分解酶，可将至少一种其它酶加到焙烤品和/或生面团中，这在本发明的范围之内。这样的其它酶包括淀粉降解酶诸如内切或外切淀粉酶，支链淀粉酶，脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶，纤维素酶，氧化还原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶诸如氧化麦芽糖的，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和酰基转移酶(诸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。本发明涵盖食物酶组合物，包括包含根据本发明的酶的面包和/或生面团改良组合物，且任选还包含其它酶，诸如一种或多种其它合适的食用级酶，包括淀粉降解酶诸如内切或外切淀粉酶，支链淀粉酶，脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶，纤维素酶，氧化还原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶诸如氧化麦芽糖的，例如己糖氧化酶(Η0Χ)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和酰基转移酶(诸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。在本文提交的有些应用中，特别是食物应用，诸如面包房应用，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种酶底物联合或顺序加入。仅作为示例，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种极性脂质底物和/或一种或多种酰基受体底物一起加入。在本文提及的有些应用中，特别是食物应用，诸如面包房应用，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种羟酸一起使用，包括例如酒石酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸或抗坏血酸。本文中所用的术语“改良的特性”指可通过本发明脂肪分解酶的作用改良的任何性质。具体而言，根据本发明的脂肪分解酶的应用导致一种或多种以下特征增加焙烤品体积；改善焙烤品团粒结构(crumbstructure)；焙烤品中的抗走味(anti-staling)特性；对生面团增加强度、增加稳定性、减少粘性和/或改善切削加工性。通过与不添加根据本发明的脂肪分解酶而制备的生面团和/或焙烤品进行比较，评估了改良的特性。本文中所用的术语“焙烤品”包括由生面团制备的产品。可通过本发明有利地制备的焙烤品(无论是白色、浅色或深色类型的)的例子包括以下一种或多种典型地块或卷形式的面包(包括白、粗面粉和黑面包)，蒸汽小圆面包，法国棍子面包，比塔饼，玉米面豆卷，玉米粉圆饼，小麦粉圆饼，蛋糕，薄烤饼，饼干，脆面包，意大利面制品，面条等。根据本发明的生面团可以是经过发酵的生面团或将进行发酵的生面团。生面团可以以各种方式发酵，诸如通过加入碳酸氢钠等，或通过加入合适的酵母培养物，诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(面包酵母)培养物。本发明还涉及根据本发明的脂肪分解酶用于生产意大利面制品生面团的应用，优选由硬质小麦粉或相当品质的面粉制备而来。根据本发明的脂肪分解酶适合用于植物或食用油的酶促脱胶。在加工植物或食用油中，用根据本发明的脂肪分解酶处理食用或植物油，从而水解极性脂质(如磷脂)的主要部分。优选由极性脂质水解得到脂肪酰基。由于水解了极性脂质，如磷脂的主要部分(即超过50%)，脱胶过程通常导致食用油中极性脂质，特别是磷脂的含量降低。典型地，将含水解极性脂质(如磷脂)的水相与油分离。适宜地，食用或植物油可最初(用根据本发明的酶处理前)具有50-250ppm的磷含量。在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的脂肪分解酶在生物转化极性脂质(优选糖脂)以制造高价值产品，诸如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟酸酯中的应用。PCT/IB2004/004374中详述了脂肪分解酶，特别是能将酰基从极性脂质底物(优选糖脂)转移至酰基受体的脂肪分解酶在生物转化极性脂质中的应用及其优势，引入本文作为参考。在一个实施方案中，用于本发明方法中的脂肪分解酶可以是固定化的。在酶是固定化的情况中，可使包含酰基供体、任选的酰基受体、和任选的水的混合物通过柱子，例如包含固定化酶的柱子。通过固定酶，有可能容易地重新使用它。适宜地，固定化酶可用在流动反应器或间歇反应器中，其装有包含溶于水中的脂质酰基供体和任选的酰基受体的反应混合物。当存在酰基受体时，供体和受体处在两相系统或乳状液中。反应混合物可任选经搅拌或经超声波处理。例如，一旦反应达到平衡，可以分离反应混合物和固定化酶。适宜地，可以分馏反应产物，例如通过疏水相互作用层析、结晶或高真空度蒸馏。固定化脂质酰基转移酶可利用本领域已知的固定技术来制备。有许多制备固定化酶的方法，这对于本领域技术人员来说是显然的(例如EPO746608；或BalcaoV.M.等，EnzymeMicrobTechnol.1996年5月1日，18(6):392_416；或Retz等，ChemPhysLipids,1998$6^,93(1-2)3-14；Bornscheuer等，TrendsBiotechnol.2002年10月，20(10)433-7；Plou等，Biotechnology,92(2002)55-66；Warmuth等，1992，BioForum9282-283；Ferrer^,2000,J.Chem.Technol.Biotechnol.751-8；■Christensen等，1998,NachwachsendeRohstoff10:98_105；Petersen禾口Christenen,2000,AppliedBiocatalysis,HarwoodAcademicPublishers,Amsterdam中提至丨J的技术，将每篇文献引入本文作为参考)。可用于本文的技术包括例如与EupergitC共价偶联、吸附到聚丙烯上和硅造粒。根据本发明的脂肪分解酶用于根据本发明的应用和/或本文所述方法的脂肪分解酶优选是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码a)包含SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遗传密码简并而与SEQIDNo.3的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。优选用于根据本发明的应用和/或本文所述方法的脂肪分解酶是包含SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。可是，用于根据本发明的应用和/或本发明方法的脂肪分解酶可以是可从链霉菌属菌种得到的任何脂肪分解酶，其至少能水解半乳糖脂和/或能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物。用于根据本发明的应用和/或本发明方法的具有半乳糖脂酶活性的合适脂肪分解酶可包含以下氨基酸序列之任一和/或由以下核苷酸序列编码ThermobifidaXfuscaGDSx548aaSEQIDNo.5ZP000587171mlphpagergevgaffallvgtpqdrrlrlechetrplrgrcgcgerrvppltlpgdgvl61cttsstrdaetvwrkhlqprpdggfrphlgvgcllagqgspgvlwcgregcrfevcrrdt121pglsrtrngdssppfragwslppkcgeisqsarktpavprysllrtdrpdgprgrfvgsg181praatrrrlflgipalvlvtaltlvlavptgretlwrmwceatqdwclgvpvdsrgqpae241dgeflllspvqaatwgnyyalgdsyssgdgardyypgtavkggcwrsanaypelvaeayd301faghlsflacsgqrgyamldaidevgsqldwnsphtslvtigiggndlgfstvlktcmvr361vplldskactdqedairkrmakfettfeelisevrtrapdarilvvgyprifpeeptgay421ytltasnqrwlnetiqefnqqlaeavavhdeeiaasggvgsvefvdvyhaldgheigsde481pwvngvqlrdlatgvtvdrstfhpnaaghravgervieqietgpgrplyatfavvagatv541dtlagevgSEQIDNo.61ggtggtgaaccagaacacccggtcgtcggcgtgggcgtccaggtgcaggtgcaggttctt61caactgctccagcaggatgccgccgtggccgtgcacgatggccttgggcaggcctgtggt121ccccgacgagtacagcacccatagcggatggtcgaacggcagcggggtgaactccagttc181cgcgccttcgcccgcggcttcgaactccgcccaggacagggtgtcggcgacagggccgca241gcccaggtacggcaggacgacggtgtgctgcaggctgggcatgccgtcgcgcagggcttt301gagcacgtcacggcggtcgaagtccttaccgccgtagcggtagccgtccacggccagcag361cactttcggttcgatctgcgcgaaccggtcgaggacgctgcgcaccccgaagtcggggga421acaggacgaccaggtcgcaccgatcgcggcgcaggcgaggaatgcggccgtcgcctcggc481gatgttcggcaggtaggccacgacccggtcgccggggcccaccccgaggctgcggagggc541cgcagcgatcgcggcggtgcgggtccgcagttctccccaggtccactcggtcaacggccg601gagttcggacgcgtgccggatcgccacggctgatgggtcacggtcgcggaagatgtgctc661ggcgtagttgagggtggcgccggggaaccagacggcgccgggcatggcgtcggaggcgag721cactgtggtgtacggggtggcggcgcgcacccggtagtactcccagatcgcggaccagaa781tccttcgaggtcggttaccgaccagcgccacagtgcctcgtagtccggtgcgtccacacc841gcggtgctcccgcacccagcgggtgaacgcggtgaggttggcgcgttctttgcgctcctc901gtcgggactccacaggatcggcggctgcggcttgagtgtcatgaaacgcgaccccttcgt961ggacggtgcggatgcggtgagcgtcgggtgcctcccctaacgctccccggtgacggagtg1021ttgtgcaccacatctagcacgcgggacgcggaaaccgtatggagaaaacacctacaaccc1081cggccggacggtgggtttcggccacacttaggggtcgggtgcctgcttgccgggcagggc1141agtcccggggtgctgtggtgcgggcgggagggctgtcgcttcgaggtgtgccggcgggac1201actccgggcctcagccgtacccgcaacggggacagttctcctcccttccgggctggatgg1261tcccttcccccgaaatgcggcgagatctcccagtcagcccggaaaacacccgctgtgccc1321aggtactctttgcttcgaacagacaggccggacggtccacgggggaggtttgtgggcagc1381ggaccacgtgcggcgaccagacgacggttgttcctcggtatccccgctcttgtacttgtg1441acagcgctcacgctggtcttggctgtcccgacggggcgcgagacgctgtggcgcatgtgg1501tgtgaggccacccaggactggtgcctgggggtgccggtcgactcccgcggacagcctgcg1561gaggacggcgagtttctgctgctttctccggtccaggcagcgacctgggggaactattac1621gcgctcggggattcgtactcttcgggggacggggcccgcgactactatcccggcaccgcg1681gtgaagggcggttgctggcggtccgctaacgcctatccggagctggtcgccgaagcctac1741gacttcgccggacacttgtcgttcctggcctgcagcggccagcgcggctacgccatgctt1801gacgctatcgacgaggtcggctcgcagctggactggaactcccctcacacgtcgctggtg1861acgatcgggatcggcggcaacgatctggggttctccacggttttgaagacctgcatggtg1921cgggtgccgctgctggacagcaaggcgtgcacggaccaggaggacgctatccgcaagcgg1981atggcgaaattcgagacgacgtttgaagagctcatcagcgaagtgcgcacccgcgcgccg2041gacgcccggatccttgtcgtgggctacccccggatttttccggaggaaccgaccggcgcc2101tactacacgctgaccgcgagcaaccagcggtggctcaacgaaaccattcaggagttcaac2161cagcagctcgccgaggctgtcgcggtccacgacgaggagattgccgcgtcgggcggggtg2221ggcagcgtggagttcgtggacgtctaccacgcgttggacggccacgagatcggctcggac2281gagccgtgggtgaacggggtgcagttgcgggacctcgccaccggggtgactgtggaccgc2341agtaccttccaccccaacgccgctgggcaccgggcggtcggtgagcgggtcatcgagcag2401atcgaaaccggcccgggccgtccgctctatgccactttcgcggtggtggcgggggcgacc2461gtggacactctcgcgggcgaggtggggtgacccggcttaccgtccggcccgcaggtctgc2521gagcactgcggcgatctggtccactgcccagtgcagttcgtcttcggtgatgaccagcgg2581cggggagagccggatcgttgagccgtgcgtgtctttgacgagcacaccccgctgcaggag2641ccgttcgcacagttctcttccggtggccagagtcgggtcgacgtcgatcccagcccacag2701gccgatgctgcgggccgcgaccacgccgttgccgaccagttggtcgaggcgggcgcgcag2761cacgggggcgagggcgcggacatggtccaggtaagggccgtcgcggacgaggctcaccac2821ggcagtgccgaccgcgcaggcgagggcgttgccgccgaaggtgctgccgtgctggccggg2881gcggatcacgtcgaagacttccgcgtcgcctaccgccgccgccacgggcaggatgccgcc2941gcccagcgctttgccgaacaggtagatatcggcgtcgactccgctgtggtcgcaggcccg//Thermobifida\fusca\-GDSxSEQIDNo.71vgsgpraatrrrlflgipalvlvtaltlvlavptgretlwrmwceatqdwclgvpvdsrg61qpaedgef11lspvqaatwgnyyalgdsyssgdgardyypgtavkggcwrsanaypelva121eaydfaghlsflacsgqrgyamldaidevgsqldwnsphtslvtigiggndlgfstvlkt181cmvrvplldskactdqedairkrmakfettfeelisevrtrapdarilvvgyprifpeep241tgayytltasnqrwlnetiqefnqqlaeavavhdeeiaasggvgsvefvdvyhaldghei301gsdepwvngvqlrdlatgvtvdrstfhpnaaghravgervieqietgpgrplyatfavva361gatvdtlagevgCorynebacteriurn\effciens\GDSx300aaSEQIDNo.81mrttviaasallllagcadgareetagappgessggireegaeastsitdvyialgdsya61amggrdqplrgepfclrssgnypellhaevtdltcqgavtgdlleprtlgertlpaqvda121ltedttlvtlsiggndlgfgevagcireriagenaddcvdllgetigeqldqlppqldrv181heairdragdaqvvvtgylplvsagdcpelgdvseadrrwaveltgqinetvreaaerhd241alfvlpddadehtscappqqrwadiqgqqtdayplhptsagheamaaavrdalglepvqp//SEQIDNo.91ttctggggtgttatggggttgttatcggctcgtcctgggtggatcccgccaggtggggta61ttcacgggggacttttgtgtccaacagccgagaatgagtgccctgagcggtgggaatgag121gtgggcggggctgtgtcgccatgagggggcggcgggctctgtggtgccccgcgacccccg181gccccggtgagcggtgaatgaaatccggctgtaatcagcatcccgtgcccaccccgtcgg241ggaggtcagcgcccggagtgtctacgcagtcggatcctctcggactcggccatgctgtcg301gcagcatcgcgctcccgggtcttggcgtccctcggctgttctgcctgctgtccctggaag361gcgaaatgatcaccggggagtgatacaccggtggtctcatcccggatgcccacttcggcg421ccatccggcaattcgggcagctccgggtggaagtaggtggcatccgatgcgtcggtgacg481ccatagtgggcgaagatctcatcctgctcgagggtgctcaggccactctccggatcgata541tcgggggcgtccttgatggcgtccttgctgaaaccgaggtgcagcttgtgggcttccaat601ttcgcaccacggagcgggacgaggctggaatgacggccgaagagcccgtggtggacctca661acgaaggtgggtagtcccgtgtcatcattgaggaacacgccctccaccgcacccagcttg721tggccggagttgtcgtaggcgctggcatccagaagggaaacgatctcatatttgtcggtg781tgctcagacatgatcttcctttgctgtcggtgtctggtactaccacggtagggctgaatg841caactgttatttttctgttattttaggaattggtccatatcccacaggctggctgtggtc901aaatcgtcatcaagtaatccctgtcacacaaaatgggtggtgggagccctggtcgcggtt961ccgtgggaggcgccgtgccccgcaggatcgtcggcatcggcggatctggccggtaccccg1021cggtgaataaaatcattctgtaaccttcatcacggttggttttaggtatccgcccctttc1081gtcctgaccccgtccccggcgcgcgggagcccgcgggttgcggtagacaggggagacgtg1141gacaccatgaggacaacggtcatcgcagcaagcgcattactccttctcgccggatgcgcg1201gatggggcccgggaggagaccgccggtgcaccgccgggtgagtcctccgggggcatccgg1261gaggagggggcggaggcgtcgacaagcatcaccgacgtctacatcgccctcggggattcc1321tatgcggcgatgggcgggcgggatcagccgttacggggtgagccgttctgcctgcgctcg1381tccggtaattacccggaactcctccacgcagaggtcaccgatctcacctgccagggggcg1441gtgaccggggatctgctcgaacccaggacgctgggggagcgcacgctgccggcgcaggtg1501gatgcgctgacggaggacaccaccctggtcaccctctccatcgggggcaatgacctcgga1561ttcggggaggtggcgggatgcatccgggaacggatcgccggggagaacgctgatgattgc1621gtggacctgctgggggaaaccatcggggagcagctcgatcagcttcccccgcagctggac1681cgcgtgcacgaggctatccgggaccgcgccggggacgcgcaggttgtggtcaccggttac1741ctgccgctcgtgtctgccggggactgccccgaactgggggatgtctccgaggcggatcgt1801cgttgggcggttgagctgaccgggcagatcaacgagaccgtgcgcgaggcggccgaacga1861cacgatgccctctttgtcctgcccgacgatgccgatgagcacaccagttgtgcaccccca1921cagcagcgctgggcggatatccagggccaacagaccgatgcctatccgctgcacccgacc1981tccgccggccatgaggcgatggccgccgccgtccgggacgcgctgggcctggaaccggtc2041cagccgtagcgccgggcgcgcgcttgtcgacgaccaacccatgccaggctgcagtcacat2101ccgcacatagcgcgcgcgggcgatggagtacgcaccatagaggatgagcccgatgccgac2161gatgatgagcagcacactgccgaagggttgttccccgagggtgcgcagagccgagtccag2221acctgcggcctgctccggatcatgggcccaaccggcgatgacgatcaacacccccaggat2281cccgaaggcgataccacgggcgacataaccggctgttccggtgatgatgatcgcggtccc2341gacctgccctgaccccgcacccgcctccagatcctcccggaaatcccgggtggccccctt2401ccagaggttgtagacacccgcccccagtaccaccagcccggcgaccacaaccagcaccac2461accccagggttgggataggacggtggcggtgacatcggtggcggtctccccatcggaggt2521gctgccgccccgggcgaaggtggaggtggtcaccgccagggagaagtagaccatggccat2581gaccgcccccttggccctttccttgaggtcctcgcccgccagcagctggctcaattgcca2641gagtcccagggccgccagggcgatgacggcaacccacaggaggaactgcccacccggagc2701ctccgcgatggtggccagggcacctgaattcgaggcctcatcacccgaaccgccggatcc2761agtggcgatgcgcaccgcgatccacccgatgaggatgtgcagtatgcccaggacaatgaa2821accacctctggccagggtggtcagcgcggggtggtcctcggcctggtcggcagcccgttc2881gatcgtccgtttcgcggatctggtgtcgcccttatccatagctcccattgaaccgccttg2941aggggtgggcggccactgtcagggcggattgtgatctgaactgtgatgttccatcaaccc//S.coelicolor\GDSx268aaSEQIDNo.12NP625998.1mrrfrlvgf1sslvlaagaaltgaataqaaqpaaadgyvalgdsyssgvgagsyisssgd61ckrstkahpylwaaahspstfdftacsgartgdvlsgqlgplssgtglvsisiggndagf121adtmttcvlqsessclsriataeayvdstlpgkldgvysaisdkapnahvvvigyprfyk181lgttciglsetkrtainkasdhlntvlaqraaahgftfgdvrttftghelcsgspwlhsv241nwlnigesyhptaagqsggylpvlngaa//SEQIDNo.131cccggcggcccgtgcaggagcagcagccggcccgcgatgtcctcgggcgtcgtcttcatc61aggccgtccatcgcgtcggcgaccggcgccgtgtagttggcccggacctcgtcccaggtg121cccgcggcgatctggcgggtggtgcggtgcgggccgcgccgaggggagacgtaccagaag181cccatcgtcacgttctccggctgcggttcgggctcgtccgccgctccgtccgtcgcctcg241ccgagcaccttctcggcgaggtcggcgctggtcgccgtcaccgtgacgtcggcgccccgg301ctccagcgcgagatcagcagcgtccagccgtcgccctccgccagcgtcgcgctgcggtcg361tcgtcgcgggcgatccgcagcacgcgcgcgccgggcggcagcagcgtggcgccggaccgt421acgcggtcgatgttcgccgcgtgcgagtacggctgctcacccgtggcgaaacggccgagg481aacagcgcgtcgacgacgtcggacggggagtcgctgtcgtccacgttgagccggatcggc541agggcttcgtgcgggttcacggacatgtcgccatgatcgggcacccggccgccgcgtgca601cccgctttcccgggcacgcacgacaggggctttctcgccgtcttccgtccgaacttgaac661gagtgtcagccatttcttggcatggacacttccagtcaacgcgcgtagctgctaccacgg721ttgtggcagcaatcctgctaagggaggttccatgagacgtttccgacttgtcggcttcct781gagttcgctcgtcctcgccgccggcgccgccctcaccggggcagcgaccgcccaggcggc841ccaacccgccgccgccgacggctatgtggccctcggcgactcctactcctccggggtcgg901agcgggcagctacatcagctcgagcggcgactgcaagcgcagcacgaaggcccatcccta961cctgtgggcggccgcccactcgccctccacgttcgacttcaccgcctgttccggcgcccg1021tacgggtgatgttctctccggacagctcggcccgctcagctccggcaccggcctcgtctc1081gatcagcatcggcggcaacgacgccggtttcgccgacaccatgacgacctgtgtgctcca1141gtccgagagctcctgcctgtcgcggatcgccaccgccgaggcgtacgtcgactcgacgct1201gcccggcaagctcgacggcgtctactcggcaatcagcgacaaggcgccgaacgcccacgt1261cgtcgtcatcggctacccgcgcttctacaagctcggcaccacctgcatcggcctgtccga1321gaccaagcggacggcgatcaacaaggcctccgaccacctcaacaccgtcctcgcccagcg1381cgccgccgcccacggcttcaccttcggcgacgtacgcaccaccttcaccggccacgagct1441gtgctccggcagcccctggctgcacagcgtcaactggctgaacatcggcgagtcgtacca1501ccccaccgcggccggccagtccggtggctacctgccggtcctcaacggcgccgcctgacc1561tcaggcggaaggagaagaagaaggagcggagggagacgaggagtgggaggccccgcccga1621cggggtccccgtccccgtctccgtctccgtcccggtcccgcaagtcaccgagaacgccac1681cgcgtcggacgtggcccgcaccggactccgcacctccacgcgcacggcactctcgaacgc1741gccggtgtcgtcgtgcgtcgtcaccaccacgccgtcctggcgcgagcgctcgccgcccga1801cgggaaggacagcgtccgccaccccggatcggagaccgacccgtccgcggtcacccaccg1861gtagccgacctccgcgggcagccgcccgaccgtgaacgtcgccgtgaacgcgggtgcccg1921gtcgtgcggcggcggacaggcccccgagtagtgggtgcgcgagcccaccacggtcacctc1981caccgactgcgctgcggggc//S.avermitilis\GDSx269aaSEQIDNo.14NP827753.1mrrsritayvtslllavgcaltgaataqaspaaaatgyvalgdsyssgvgagsylsssgd61ckrsskaypylwqaahspssfsfmacsgartgdvlanqlgtlnsstglvsltiggndagf121sdvmttcvlasdsaclsrintakayvdstlpgqldsvytaistkapsahvavlgyprfyk181lggsclaglsetkrsaindaadylnsaiakraadhgftfgdvkstftgheicssstwlhs241ldllnigqsyhptaagqsggylpvmnsva//SEQIDNo.151ccaccgccgggtcggcggcgagtctcctggcctcggtcgcggagaggttggccgtgtagc61cgttcagcgcggcgccgaacgtcttcttcaccgtgccgccgtactcgttgatcaggccct121tgcccttgctcgacgcggccttgaagccggtgcccttcttgagcgtgacgatgtagctgc181ccttgatcgcggtgggggagccggcggcgagcaccgtgccctcggccggggtggcctggg241cgggcagtgcggtgaatccgcccacgagggcgccggtcgccacggcggttatcgcggcga301tccggatcttcttgctacgcagctgtgccatacgagggagtcctcctctgggcagcggcg361cgcctgggtggggcgcacggctgtggggggtgcgcgcgtcatcacgcacacggccctgga421gcgtcgtgttccgccctgggttgagtaaagcctcggccatctacgggggtggctcaaggg481agttgagaccctgtcatgagtctgacatgagcacgcaatcaacggggccgtgagcacccc541ggggcgaccccggaaagtgccgagaagtcttggcatggacacttcctgtcaacacgcgta601gctggtacgacggttacggcagagatcctgctaaagggaggttccatgagacgttcccga661attacggcatacgtgacctcactcctcctcgccgtcggctgcgccctcaccggggcagcg721acggcgcaggcgtccccagccgccgcggccacgggctatgtggccctcggcgactcgtac781tcgtccggtgtcggcgccggcagctacctcagctccagcggcgactgcaagcgcagttcg841aaggcctatccgtacctctggcaggccgcgcattcaccctcgtcgttcagtttcatggct901tgctcgggcgctcgtacgggtgatgtcctggccaatcagctcggcaccctgaactcgtcc961accggcctggtctccctcaccatcggaggcaacgacgcgggcttctccgacgtcatgacg1021acctgtgtgctccagtccgacagcgcctgcctctcccgcatcaacacggcgaaggcgtac1081gtcgactccaccctgcccggccaactcgacagcgtgtacacggcgatcagcacgaaggcc1141ccgtcggcccatgtggccgtgctgggctacccccgcttctacaaactgggcggctcctgc1201ctcgcgggcctctcggagaccaagcggtccgccatcaacgacgcggccgactatctgaac1261agcgccatcgccaagcgcgccgccgaccacggcttcaccttcggcgacgtcaagagcacc1321ttcaccggccatgagatctgctccagcagcacctggctgcacagtctcgacctgctgaac1381atcggccagtcctaccacccgaccgcggccggccagtccggcggctatctgccggtcatg1441aacagcgtggcctgagctcccacggcctgaatttttaaggcctgaatttttaaggcgaag1501gtgaaccggaagcggaggccccgtccgtcggggtctccgtcgcacaggtcaccgagaacg1561gcacggagttggacgtcgtgcgcaccgggtcgcgcacctcgacggcgatctcgttcgaga1621tcgttccgctcgtgtcgtacgtggtgacgaacacctgcttctgctgggtctttccgccgc1681tcgccgggaaggacagcgtcttccagcccggatccgggacctcgcccttcttggtcaccc1741agcggtactccacctcgaccggcacccggcccaccgtgaaggtcgccgtgaacgtgggcg1801cctgggcggtgggcggcgggcaggcaccggagtagtcggtgtgcacgccggtgaccgtca1861ccttcacggactgggccggcggggtcgtcgtaccgccgccgccaccgccgcctcccggag1921tggagcccgagctgtggtcgcccccgccgtcggcgttgtcgtcctcgggggttttcgaac//Thermobifida\fusca\-GDSxSEQIDNo.161mgsgpraatrrrlflgipalvlvtaltlvlavptgretlwrmwceatqdwclgvpvdsrg61qpaedgef11lspvqaatwgnyyalgdsyssgdgardyypgtavkggcwrsanaypelva121eaydfaghlsflacsgqrgyamldaidevgsqldwnsphtslvtigiggndlgfstvlkt181cmvrvplldskactdqedairkrmakfettfeelisevrtrapdarilvvgyprifpeep241tgayytltasnqrwlnetiqefnqqlaeavavhdeeiaasggvgsvefvdvyhaldghei301gsdepwvngvqlrdlatgvtvdrstfhpnaaghravgervieqietgpgrplyatfavva361gatvdtlagevg//Thermobifida\fusca\-GDSxSEQIDNo.171ctgcagacacccgccccgccttctcccggatcgtcatgttcggcgactccctcagcgaca61ccggcaagatgtactccaagatgcgcggctacctgccgtcctccccgccgtactacgagg121gccgcttctcgaacggcccggtctggctggagcagctgacgaagcagttccccggcctga181cgatcgccaacgaggccgaggggggcgcgaccgcagtcgcctacaacaagatctcctgga241acccgaagtaccaggtcattaacaacctcgactacgaggtcacccagttcttgcagaagg301actcgttcaagcccgacgacctggtcatcctgtgggtgggcgccaacgactacctggcct361acggttggaacacggagcaggacgccaagcgggtgcgcgacgccatctcggacgcggcaa421accgcatggtcctgaacggcgcgaagcagatcctgctgttcaacctgcccgacctgggcc481agaacccgtccgcccgctcccagaaggtcgtcgaggccgtctcgcacgtgtccgcctacc541acaacaagctgctcctcaacctcgcccggcagctcgccccgacgggcatggtcaagctgt601tcgagatcgacaagcagttcgcggagatgctgcgcgacccccagaacttcggcctgagcg661acgtggagaacccgtgctacgacggcggctacgtgtggaagccgttcgccacccggtccg721tctcgaccgaccggcagctgtcggccttctcgccccaggagcgcctggcgatcgctggca781acccgctcctggcacaggcggtagcttcgccgatggcccgccgctcggcctcgcccctca841actgcgagggcaagatgttctgggaccaggtccaccccaccaccgtggtccacgccgccc901tctcggagcgcgccgccaccttcatcgagacccagtacgagttcctcgcccactagtcta961gaggatcc所以，在另一方面，本发明提供了脂肪分解酶在食品中用于制备溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油单酯(DGMG)或单半乳糖苷甘油单酯(MGMG))的应用，其通过用根据本发明的脂肪分解酶处理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或单半乳糖苷甘油二酯(MGDG))来产生部分水解产物，即溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQIDNo.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在另一方面，本发明还进一步提供了脂肪分解酶在食品中用于制备溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的应用，其通过用酶处理磷脂(如卵磷脂)来产生部分水解产物，即溶血磷月旨，其中所述脂肪分解酶包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQIDNo.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在另一方面，本发明还进一步提供了脂肪分解酶在蛋或基于蛋的产品中用于水解磷脂和/或糖脂的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQIDNo.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在另一方面，本发明提供了脂肪分解酶在底物(优选食品)中用于水解脂肪酰基的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQIDNo.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在另一方面，本发明提供了脂肪分解酶在食用油中用于降低磷脂含量的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQID似.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在另一方面，本发明涉及脂肪分解酶在底物(优选含极性脂质(优选糖脂)的生物转化混合物)中用于生产高价值产品，诸如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟酸酯的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQIDNo.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQIDNo.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在一个优选的方面，本发明涉及用于本文中所述用途的包含SEQIDNo.8、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。更优选地，本发明涉及包含SEQIDNo.16所示的氨基酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶的应用。在一个广的方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从喜热裂孢菌属(Thermobifida)物种，优选褐色喜热裂孢菌(T.fusca)得到的。在另一个广的方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从棒杆菌属(Corynebacterium)物种，优选C.efficiens得到的。在另一个广的方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)得到的。在另一方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQIDNo.5、7、8、12、或16或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，或该酶由SEQIDNo.6、9、13、或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在另一方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQIDNo.14或与其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，或该酶由SEQIDNo.15所示的核苷酸序列或与其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在另一方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQIDNo.16或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，或该酶由SEQIDNo.17所示的核苷酸序列或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一编码。在本发明的一个实施方案中，优选可从中(或就是从中)得到脂肪分解酶的链霉菌属菌种不是龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)。在本发明的一个实施方案中，优选可从中(或就是从中)得到脂肪分解酶的链霉菌属菌种不是天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)。优点本发明的一个优点是脂肪分解酶具有显著的糖脂水解活性。对于来自链霉菌属菌种的脂肪分解酶来说，这是令人惊讶的。另外，对于来自喜热裂孢菌属和棒杆菌属物种的脂肪分解酶来说，这是令人惊讶的。本发明的另一优点是脂肪分解酶不具有三酰甘油水解活性或具有不显著的三酰甘油水解活性。分离的在一个方面，优选序列是分离形式的。术语“分离的”指序列至少基本上不含至少一种在自然界中找到时和在自然界中与该序列天然相连的其它成分。纯化的在一个方面，优选序列是纯化形式的。术语“纯化的”指序列处于相对纯的状态_如至少约90%纯、或至少约95%纯或至少约98%纯。核苷酸序列本发明的范围涵盖编码具有本文定义的特定特性的酶的核苷酸序列。本文中所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的，它可以是双链的或单链的，无论代表有义或反义链。本发明涉及的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNAjPRNA。优选它指DNA，更优选编码本发明的cDNA序列。在一个优选的实施方案中，本发明实质范围所涉及和涵盖的核苷酸序列不包括在其天然环境中以及与其天然相连序列连接时的根据本发明的天然核苷酸序列，其中天然相连序列也在其天然环境中。为了便于提及，我们称这种优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。在这点上，术语“天然核苷酸序列”指在其天然环境中且与其天然相连的完整启动子可操作连接时的完整核苷酸序列，其中启动子也在其天然环境中。可是，在其天然生物体中的核苷酸序列表达之后，可以分离和/或纯化本发明范围所涵盖的氨基酸序列。可是优选本发明范围所涵盖的氨基酸序列可由其天然生物体中的核苷酸序列表达，但其中核苷酸序列不受该生物体中与之天然相连的启动子的控制。核苷酸序列的制备典型地，利用重组DNA技术(即重组DNA)来制备本发明范围所涵盖的核苷酸序列。可是，在本发明的一个可选实施方案中，利用本领域众所周知的化学方法(参见CaruthersMH等，(1980)NucAcidsResSympSer215_23和HornT等，(1980)NucAcidsResSympSer225-232)，可完整或部分合成核苷酸序列。可以从产生所述酶的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化编码具有本文定义的特定特性的酶的核苷酸序列。本领域众所周知用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的多种方法。举例来说，一旦鉴定和/或分离和/或纯化到合适的序列，则可通过PCR扩增技术来制备更多序列。进一步举例来说，可以使用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果知道酶的氨基酸序列或酶的部分氨基酸序列，则可以合成带标记的寡核苷酸探针，并用于从由生物体制备的基因组文库鉴定编码酶的克隆。或者，可使用含有与其它已知酶基因同源的序列的带标记寡核苷酸探针来鉴定编码酶的克隆。在后一种情况中，使用较低严谨度的杂交和洗涤条件。或者，可如下鉴定编码酶的克隆，将基因组DNA片段插入表达载体，诸如质粒，用得到的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂布到含酶底物(如葡糖苷酶(麦芽糖酶)生成酶用麦芽糖)的琼脂平板上，从而可鉴定表达酶的克隆，由此可鉴定编码酶的克隆。又或者，可通过已确定的标准方法来合成制备编码酶的核苷酸序列，如BeucageS.L.等，(1981)TetrahedronLetters22，ρ1859-1869所述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，(1984)EMBOJ.3,ρ801-805所述的方法。在亚磷酰胺法中，合成寡核苷酸，如在自动DNA合成仪中，纯化，退火，连接并克隆到合适的载体中。核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源的、混合的合成和cDNA来源的，或混合的基因组和cDNA来源的，其按照标准技术通过连接合成、基因组或cDNA来源的(如果合适)的片段来制备。每个连接的片段对应于完整核苷酸序列的各部分。也可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA序列，例如US4，683，202或SaikiRK等，Science(1988)239，pp487_491中所述。由于遗传密码的简并性，可以方便地制备如下核苷酸序列，其中对于由原始核苷酸序列编码的有些或所有氨基酸，三联体密码子的使用率已经改变，从而产生与原始核苷酸序列具有低同源性但编码如原始核苷酸序列所编码的相同或变体氨基酸序列的核苷酸序列。例如，对于大多数氨基酸，遗传密码的简并性位于三联体密码子中的第三位(摆动位)(参见Stryer,Lubert,Biochemistry,第三版,FreemanPress,ISBN0-7167-1920-7),因此，其中所有三联体密码子在第三位都“摆动”的核苷酸序列与原始核苷酸序列将具有约66%的同一性，可是改变后的核苷酸序列将编码如原始核苷酸序列所编码的相同、或变体一级氨基酸序列。因此，本发明还涉及如下任何核苷酸序列，对于至少一种编码氨基酸的三联体密码子，具有可变的三联体密码子使用率，但编码如原始核苷酸序列所编码多肽序列的相同、或变体多肽序列。另外，特定生物体通常对使用哪些三联体密码子来编码氨基酸具有偏好。优选的密码子使用率表可广泛获得，并可用于制备密码子优化基因。这样的密码子优化技术常规用于优化异源宿主中转基因的表达。分子进化一旦分离得到编码酶的核苷酸序列，或者鉴定得到推定的编码酶的核苷酸序列，可能希望更改选择的核苷酸序列，例如可能希望对序列进行突变，从而制备根据本发明的酶。可以使用合成寡核苷酸来导入突变。这些寡核苷酸含有期望突变位点侧翼的核苷酸序列。Morinaga等，Biotechnology，1984，2:646_649中公开了一种合适的方法。Nelson和Long,AnalyticalBiochemistry,1989，180147-151中描述了将突变导入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。除了定点诱变，诸如上文所述，可以随机导入突变，例如使用商品化试剂盒，诸如Stratagene的GeneMorphPCR诱变试剂盒或Clontech的DiversifyPCR随机诱变试剂盒。EPO583265涉及优化基于PCR的诱变的方法，它也可以联合使用诱变性DNA类似物，诸如EPO866796中所述。错误倾向PCR技术适于生成具有优选特征的脂肪分解酶变体。WO02/06457涉及脂肪酶的分子进化。获取新序列的第三种方法是使用任何数目的限制酶或诸如DNA酶I等酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新装配成编码功能性蛋白质的全长核苷酸序列。或者，可以使用一种或多种不同的核苷酸序列，并在重新装配全长核苷酸序列的过程中导入突变。DNA改组和家族改组技术适于生成具有优选特征的脂质酰基转移酶变体。EPO752008、EP1138763、EP1103606中可找到适于进行“改组”的方法。改组还可以联合其它形式的DNA诱变，正如US6，180，406和WO01/34835中所述。由此，有可能在体内或在体外在核苷酸序列中生成大量的定点或随机诱变，并随后通过多种手段对所编码多肽筛选改进的功能性。可以使用例如inSilico(计算机芯片)和exo介导的重组方法(见WO00/58517、US6,344，328、US6，361，974)来进行分子进化，其中所生成的变体保留与已知酶或蛋白质的很低同源性。由此获得的此类变体可能具有与已知脂肪分解酶的显著结构类似性，但是它们具有很低的氨基酸序列同源性。作为一个非限制性实例，还可以将多核苷酸序列的突变或天然变体与野生型或其它突变或天然变体重组以生成新的变体。也可以对此类新变体筛选所编码多肽的改进的功能性。上述和类似分子进化方法的应用容许在没有关于蛋白质结构或功能的任何现有知识的条件下鉴定和选择具有优选特征的本发明酶变体，且容许生成不可预测的但有利的突变或变体。分子进化在本领域中用于优化或改变酶活性的应用有许多例子，这样的例子包括但不限于以下一种或多种优化在宿主细胞中或在体外的表达和/或活性、提高酶活性、改变底物和/或产物特异性、提高或降低酶或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、PH、底物)中的酶活性/特异性。正如本领域技术人员清楚知道的，使用分子进化工具，可以改变酶以改进酶的功能性。适宜地，本发明所使用的脂肪分解酶可以是变体，即与亲本酶相比可包含至少一处氨基酸替代、删除或添加。酶变体保留与亲本酶的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%,80%,90%,95%,97%,99%同源性。合适的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶对得上pfam00657共有序列。在一个优选的实施方案中，脂肪分解酶变体保留或掺入在⑶Sx、GANDY和HPT模块中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。可以使用分子进化工具对酶诸如在水性环境中没有或具有低半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性的脂肪酶进行突变以导入或增强半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性，由此生成适用于本发明组合物和方法的具有显著半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性的脂肪分解酶。适宜地，酶变体对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯可以不具有活性。或者，本发明所使用的酶变体对甘油三酯可以具有升高的活性，和/或对以下一种或多种也可以具有升高的活性极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖苷甘油单酯、单半乳糖苷甘油单酯。氨基酸序列本发明的范围还涵盖具有本文定义的特定特性的酶的氨基酸序列。本文中所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。可以由合适的来源制备/分离氨基酸序列，或者可以人工合成，或是可以使用重组DNA技术来制备。本发明所涵盖的酶可与其它酶联合使用。因此，本发明还覆盖酶的组合，其中该组合包含本发明的酶和其它酶，它可以是根据本发明的其它酶。这方面在以后的节中讨论。优选地，本发明实质范围所涉及和涵盖的氨基酸序列不是天然的酶。在这点上，术语“天然的酶”指在其天然环境中且由其天然核苷酸序列表达的完整的酶。同一性/同源性本发明还涵盖酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列的同源物的应用。在本文中，术语“同源物”指与氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的实体。在本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。这些术语在本文中可互换使用。在本文的背景中，认为同源氨基酸序列包括与序列可以是至少87或90%相同的氨基酸序列，优选与序列至少95、96、97、98或99%相同。典型地，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的例如活性位点等。尽管同源性也可认为是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的背景中，优选以序列同一性来表示同源性。在本文的背景中，认为同源核苷酸序列包括与编码本发明酶的核苷酸序列(主题序列)可以是至少85或90%相同的核苷酸序列，优选至少95、96、97、98或99%相同。典型地，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可认为是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的背景中，优选以序列同一性来表示同源性。对于氨基酸序列和核苷酸序列，可以目测进行同源性比较，或者更常用的是借助易于获得的序列比较程序。这些商业性计算机程序能计算两种或多种序列之间的％同源性。可以对毗邻序列计算％同源性，即将一种序列与其它序列进行对比，并将一种序列中的每一个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接进行比较，每次一个残基。这称为“无缺口，，对比。通常，只对较短数目的残基进行这种无缺口对比。尽管这是一种非常简单且可靠的方法，然而它未能考虑例如在其它方面相同的成对序列中一处插入或删除将引起后面的氨基酸残基无法进行对比，由此可能导致在进行整体对比时％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法设计成在考虑到可能的插入和删除的条件下生成最佳对比，不过度处罚整体同源性得分。这是通过在序列对比中插入“缺口”以设法使局部同源性最大化而实现的。可是，这些更加复杂的方法给对比中发生的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的缺口的序列对比-反应了两种比较序列之间的较高相关性_将获得比具有更多缺口的其它序列对比更高的得分。通常使用“仿射缺口代价(affinegapcosts)”，即对缺口的存在处以较高代价，而对缺口中的每一个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然将以较少缺口生成优化对比。大多数对比程序容许更改缺口罚分。可是，在使用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值。例如在使用GCGWisconsinBestfit软件包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是缺口-12且每个延伸_4。因此，最大％同源性的计算首先需要生成最佳对比，其中要考虑缺口罚分。适用于进行这种对比的一种计算机程序是GCGWisconsinBestfit软件包(Devereux等，1984，Nuc.AcidsResearch,12:387)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等，l999，ShortProtocolsinMolecularBiology，第4版，第I8章)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.403-410)、和GENEW0RKS比较工具套。BLAST和FASTA都能进行离线和在线搜索(见Ausubel等，1999，ShortProtocolsinMolecularBiology,7.58-7.60)。可是，对于有些应用，优选使用GCGBestfit程序。还可以使用称为BLAST2Sequences的一种新工具来比较蛋白质和核苷酸序列(见FEMSMicrobiolLett1999，174(2):247-50；及FEMSMicrobiolLett1999，177(1)187-8)。尽管最终的％同源性可以根据同一性进行测量，然而对比过程自身通常不是基于“全是或全非”成对比较。而是，通常使用尺度相似性评分矩阵根据化学相似性或进化距离给每对比较赋予得分。常用的此类矩阵的一个实例是BL0SUM62矩阵-BLAST程序套的缺省矩阵。GCGWisconsin程序通常使用公开的缺省值或定制的符号比较表，如果提供的话(进一步的细节见用户手册)。对于有些应用，优选使用GCG软件包的公开缺省值，或者在其它软件的情况中，使用缺省矩阵，诸如BL0SUM62。或者，可以使用以与CLUSTAL(HigginsDG和SharpPM,1988,Gene73(l)237-244)类似的算法为基础的DNASISTM(HitachiSoftware)中的多重对比特色来计算百分比同源性。一旦软件生成了最佳对比，就有可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常作为序列比较的一部分来执行它，并生成一个数值结果。在本发明的一个优选方面，使用以下软件和设置来计算百分比序列同源性/同一'性。对于氨基酸序列，使用AlignXVectorNTI(VectorNTIAdvance9.1,InvitrogenCorporation，Carlsbad，California，美国)为每个可能的氨基酸序列对来计算同一性(同源性)或“正数”百分比。设置是缺省参数(缺口开始罚分-10，缺口延伸罚分0.1)。对于核酸序列，使用InformaxInc.(美国)的AlignXVectorNTI程序为每个可能的核酸序列对计算同一性(同源性)或“正数”百分比。设置是缺省设置，对于DNA为缺口开始罚分15和缺口延伸罚分6.66(对于多重对比，使用相同设置)。优选地，横跨全长氨基酸序列(如SEQIDNo.4、5、7、8、10、12和14)计算氨基酸同一性(同源性)，或对于核酸，则是编码各自全长氨基酸序列的相应多核苷酸。优选的是，可以通过对成熟多肽，即经过共翻译或翻译后加工，例如N-末端信号肽切割、或C-末端切割事件的多肽序列比较同源性/同一性来计算氨基酸或核酸同一性(同源性)。序列还可以具有生成沉默改变并导致功能等同物的氨基酸残基删除、插入或替代。可以根据氨基酸特性(诸如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性本质)的相似性进行审慎的氨基酸替代，因此以功能组形式将氨基酸在一起分组是有用的。可仅仅根据氨基酸侧链的性质将它们在一起分组。可是，另外包括突变数据是更有用的。如此衍生的氨基酸组出于结构原因可能是保守的。这些组可以范氏(Verm)图的形式描述(LivingstoneC.D.禾口BartonG.J.,1993,“Proteinsequencealignments-.astrategyforthehierarchicalanalysisofredisueconservation"，Comput.Appl.Biosci.,9745-756；TaylorW.R.,1986,"Theclassificationofaminoacidconservation",J.Theor.Biol.,119=205-218)0例如根据下表所描述的普遍接受的氨基酸范氏图分组，可进行保守替代。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>本发明还涵盖可以发生的同源替代(替代和替换在本文中都用于指用可选氨基酸残基交换现有残基)，即相似替代，诸如碱性替代碱性、酸性替代酸性、极性替代极性等。也可以发生非同源替代，即由一类残基变成另一类，或者牵涉非天然氨基酸，诸如鸟氨酸(下文称为ζ)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为0)、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。还可以用非天然氨基酸进行替换。氨基酸序列变体可以包含合适的间隔基团，它可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，除了氨基酸间隔物诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基以外，还包括烃基，诸如甲基、乙基或丙基。变异的另一种形式牵涉类肽(P印toid)形式的一个或多个氨基酸残基的存在，这是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指氨基酸残基变体，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而非α-碳原子。本领域知道用于制备类肽形式的肽的方法，例如SimonRJ等，PNAS，1992，89(20):9367_9371；及HorwellDC,TrendsBiotechnol.1995,13(4)132-134。本发明所使用的核苷酸序列可以在其中包含合成的或修饰的核苷酸。本领域知道对寡核苷酸的许多不同类型修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯(methylphosphonate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解可以通过本领域可利用的任何方法来修饰本文所述核苷酸序列。可以为了增强本发明核苷酸序列的体内活性或寿命而进行这些修饰。本发明还涵盖与本文所述序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，那么该序列可作为探针用于在其它生物体中鉴定相似编码序列等。可以以多种方式获得与本发明序列不是100%同源但属于本发明范围内的多核苷酸。可以通过例如探查由一群个体例如来自不同人群的个体制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。另外，可以获得其它同源物，而且这些同源物及其片段一般能与本文序列表中所示序列发生选择性杂交。可以通过由其它物种制备cDNA文库或基因组DNA文库并在中等至高严谨度条件下用包含所附序列表中任一序列的完整或部分序列的探针探查这些文库来获得这些序列。类似考虑应用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。还可以使用简并PCR获得变体和株系/物种同源物，其中所用引物设计成靶向变体和同源物中编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列。可以通过例如对比来自几个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域知道的计算机软件来进行序列对比。例如广泛使用GCGWisconsinPileUp程序。简并PCR所使用的引物将包含一个或多个简并位置，而且将在比用针对已知序列的单一序列引物来克隆序列时更低的严谨条件使用。或者，可以通过已鉴定序列的定点诱变来获得这些多核苷酸。这在例如为了对多核苷酸序列将要在其中表达的特定宿主细胞优化密码子偏爱性而需要沉默密码子序列改变时可能是有用的。为了导入限制酶识别位点或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能，可能还需要其它序列改变。本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于生成引物，例如PCR引物，用于进行可选扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用显现标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆到载体中。这些引物、探针和其它片段的长度将是至少15个、优选至少20个、例如至少25个、30个或40个核苷酸，而且同样由本文所使用的术语本发明多核苷酸所涵盖。可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何手段来生成根据本发明的多核苷酸，诸如DNA多核苷酸和探针。还可以通过标准技术来克隆它们。一般而言，将通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制造期望的核酸序列，每次一个核苷酸。使用自动化技术实现这一目的的技术在本领域是易于获得的。通常将使用重组手段例如PCR(聚合酶链反应)克隆技术来生成较长的多核苷酸。弓丨物可以设计成包含合适的限制酶识别位点，从而能够将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。有生物学活性的优选地，变体序列等至少与本文所示序列一样有生物学活性。本文中所用的“有生物学活性的”指具有与天然存在序列相似的结构功能(但不必是相同程度)、和/或相似的调节功能(但不必是相同程度)、和/或相似的生化功能(但不必是相同程度)的序列。杂交本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或是能与本发明的序列或其互补序列发生杂交的序列。本文中所用的术语“杂交”应当包括“一条核酸链与一条互补链通过碱基配对而结合的过程”，以及在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。本发明还涵盖能与本文所示序列或其任何衍生物、片段或衍生物的互补序列发生杂交的核苷酸序列的用途。术语“变体”还涵盖能与本文所示核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。优选地，术语“变体”涵盖能在严谨条件(如50°C和0.2xSSC{lxSSC=0.15MNaCl2、0.015M柠檬酸三钠pH7.0})下与本文所示核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。更优选地，术语“变体”涵盖能在高严谨条件(如65°C和0.IxSSC{lxSSC=0.15MNaCl2、0.015M柠檬酸三钠pH7.0})下与本文所示核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。本发明还涉及能与本发明核苷酸序列(包括本文所示那些的互补序列)发生杂交的核苷酸序列。本发明还涉及能与本发明核苷酸序列(包括本文所示那些的互补序列)发生杂交的序列的互补核苷酸序列。本发明的范围还包括能在中度至最高严谨条件下与本文所示核苷酸序列发生杂交的多核苷酸序列。在一个优选的方面，本发明覆盖能在严谨条件(如50°C和0.2xSSC)下与本发明核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。在一个更优选的方面，本发明覆盖能在高严谨条件(如65°C和0.IxSSC)下与本发明核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。重组的在一个方面，用于本发明的序列是重组序列_即利用重组DNA技术制备的序列。这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围内。文献中阐明了这些技术，例如，J.SambrookiE.F.FritschfBT.Maniatis，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual，^!二片反，1—3■，ColdSpringHarborLaboratoryPress0合成的在一个方面，用于本发明的序列是合成的序列_即通过体外化学或酶促合成制备的序列。它包括但不限于用宿主生物体的最优密码子使用率而得到的序列-诸如甲基营养型酵母毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)。酶的表达可以将本发明所使用的核苷酸序列掺入重组可复制载体。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或由相容宿主细胞复制和表达所述核苷酸序列(以酶的形式)。可以使用控制序列，如调节序列来控制表达。根据所使用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列而生成的酶可以是分泌的，或者可以是包含在细胞内的。编码序列可以设计成含有信号序列，它指导序列所编码物质穿过特定原核或真核细胞膜的分泌。表达载体术语“表达载体”指能够在体内或在体外进行表达的构建物。优选地，将表达载体掺入合适宿主生物体的基因组。术语“掺入”优选覆盖稳定的掺入基因组。本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接调节序列，该调控序列能够通过合适的宿主生物体提供核苷酸序列的表达。可以如下文所述将本发明所使用的载体转化到合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。载体的选择，例如质粒、粘粒或噬菌体载体，常常取决于它将要导入的宿主细胞。本发明所使用的载体可以含有一种或多种选择标记基因，诸如赋予抗生素抗性的基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，可以通过共转化来进行选择(如WO91/17243中所述)。可以在体外使用载体，例如用于生成RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。由此，在另一个实施方案中，通过将本发明的核苷酸序列导入可复制载体，将载体导入相容宿主细胞，并在促使载体复制的条件下培养宿主细胞，本发明提供了制备本发明的核苷酸序列的方法。载体还可以包含使得载体能够在所讨论宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。这些序列的实例有质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的复制起点。调节序列在有些应用中，本发明所使用的核苷酸序列可操作连接调节序列，它能够通过诸如选择的宿主细胞提供核苷酸序列的表达。举例来说，本发明覆盖包含本发明核苷酸序列且其与这种调节序列可操作连接的载体，即载体是表达载体。术语“可操作连接”指位置毗邻，其中所述组件的相互关系容许它们以其预期方式发挥功能。与编码序列可操作连接的调节序列的连接方式使得能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。术语“启动子”采用本领域常用含义，例如RNA聚合酶结合位点。还可以通过选择异源调节区，例如启动子、分泌前导序列、和终止子区，来实现编码本发明酶的核苷酸序列的表达增强。优选地，根据本发明的核苷酸序列可操作连接至少一个启动子。适于指导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的实例在本领域是众所周知的。构建物术语“构建物”-与诸如“缀合物”、“盒”和“杂合物”等术语同义_包含根据本发明使用的核苷酸序列且其直接或间接与启动子相连。间接相连的实例在本发明的启动子和核苷酸序列之间提供合适的间隔区，诸如内含子序列，诸如Shl内含子或ADH内含子。术语“融合”在本发明中也是如此，包括直接或间接相连。在有些情况中，该术语不覆盖编码蛋白质的核苷酸序列与通常相连的野生型基因启动子的天然组合，且它们都处于其天然环境中。构建物甚至可以包含或表达容许选择基因构建物的标记。对于有些应用，优选的是，本发明的构建物包含至少一种本发明的核苷酸序列且其可操作连接启动子。宿主细胞术语“宿主细胞”在涉及本发明时包括包含上文所述核苷酸序列或表达载体且用于重组生产具有本文定义的特定特性之酶的任何细胞。由此，本发明的另一个实施方案提供了经核苷酸序列转化或转染而表达本发明酶的宿主细胞。将要选择与所述载体相容的细胞，而且可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选地，宿主细胞不是人类细胞。合适的细菌宿主生物体的实例有革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。根据编码本发明酶的核苷酸序列的本质和/或进一步加工所表达蛋白质的愿望，真核宿主可能是优选的，诸如酵母或其它真菌。一般而言，酵母细胞比真菌细胞更加优选，因为它们易于操作。可是，有些蛋白质或是难以由酵母细胞分泌，或是在有些情况中难以正确加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况中，应当选择不同的真菌宿主生物体。使用合适的宿主细胞，诸如酵母、真菌和植物宿主细胞，可以提供翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、Iapidation以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是赋予本发明重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶减除的菌株。可修改宿主细胞的基因型以改善表达。宿主细胞修饰的例子包括蛋白酶缺陷、补充罕见的tRNA、和修改细胞质中的还原势(reductivepotential)以增强二硫键形成。例如，如Kane，CurrOpinBiotechnol，1995，6:494_500，“Effectsofrarecodonclustersonhigh-levelexpressionofheterologousproteinsinE.coli“中所示例/描述的，宿主细胞大肠杆菌可过度表达罕见的tRNA以改善异源蛋白质的表达。如Bessette，ProcNatlAcadSciUSA,1999,9613703-13708,“EfficientfoldingofproteinswithmultipledisulphidebondsintheEscherichiacolicytoplasm"中所示例/描述的，宿主细胞可以是许多还原酶缺陷的，由此适宜形成稳定的二硫键。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌，优选革兰氏阳性细菌，优选宿主细胞选自放线细菌(Actinobacteria)，诸如双歧杆菌属(Biofidobacteria)和气单胞菌属(Aeromonas)，特别优选杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)。仍更优选放线菌目(Actinomicetales)，诸如棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和诺卡氏菌属(Nocardia)。特别优选链霉菌科(Str印tomycetaceae)，诸如链霉菌属，特别是浅青紫链霉菌(S.Iividans)。微生物宿主可用于表达半乳糖脂酶基因，如真细菌、古细菌或真菌，包括酵母。优选真细菌，例如后壁菌门(Firmicutes)(低GC的革兰氏阳性细菌)，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其它芽孢杆菌属物种，乳酸细菌，诸如乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)的物种。也优选革兰氏阴性的变形菌(Proteobacteria)，特别是伽马变形菌(Gammaproteobacteria),诸如属于假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和埃希氏杆菌属(Escherichia)的宿主物种，尤其是大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)。在另一个实施方案中，宿主细胞与天然宿主物种是同一个属的，即在与分离得到重组基因的物种同一属的物种中重新引入并表达重组基因。在另一个实施方案中，宿主细胞是天然宿主物种，即在与分离得到重组基因的同一物种中重新引入并表达重组基因。生物体术语“生物体”在涉及本发明时包括能够包含编码根据本发明的酶的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子在存在于生物体中时能够容许根据本发明的核苷酸序列表达的任何生物体。合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。术语“转基因生物体”在涉及本发明时包括包含编码根据本发明的酶的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子能够容许编码本发明酶的核苷酸序列在生物体内表达的任何生物体。优选地，将核苷酸序列掺入生物体的基因组。术语“转基因生物体”不覆盖处于其天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时它们处于其天然启动子的控制之下，而后者同样处于其天然环境中。因此，本发明的转基因生物体包括包含编码根据本发明的酶的核苷酸序列、根据本发明的构建物、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织、或其产物中的任何一种或组合的生物体。例如，转基因生物体还可以包含编码本发明酶的核苷酸序列且其处于异源启动子的控制之下。宿主细胞/生物体的转化如上所述，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草杆菌。关于原核宿主转化的讲授在本领域有很好的记录，例如见Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2片反，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行合适的修改，诸如清除内含子。可以使用本领域知道的多种方法转化丝状真菌细胞，诸如牵涉以已知方式形成原生质体，转化原生质体，随后再生细胞壁的过程。EPO238023中描述了使用曲霉(Aspergillus)作为宿主微生物。另一种宿主生物体可以是植物。关于转化植物的一般技术的综述见Potrykus，AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol,1991,42205-225；RChristou,Agro-Food-IndustryHi-Tech，1994年3月/4月，17-27。关于植物转化的其它讲授见EP-A-0449375。下面的节介绍了关于转化真菌、酵母和植物的一般教导。转化的真菌宿主生物体可以是真菌，诸如丝状真菌。合适的这种宿主的实例包括属于嗜热霉属(Thermomyces)、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等的任何成员。讲授丝状真菌转化的综述见US-A-5741665，它声明用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术在本领域是众所周知的。关于应用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的综述见例如DavisfPdeSerres,MethodsEnzymol，1971，17A:79_143。关于转化丝状真菌的其它技术的综述见US-A-5674707。在一个方面，宿主生物体可以是曲霉属的，诸如黑曲霉(Aspergillusniger)。还可以通过遵循例如MartinelliS.D.、KinghornJ.R.编的《Aspergillus50yearsonProgressinindustrialmicrobiology〉〉，第29卷，ElsevierAmsterdaml944,P641-666中TurnerG(1944)著的“Vectorsforgeneticmanipulation”的讲授来制备根据本发明的转基因曲霉。关于丝状真菌中的基因表达的综述见Punt等，2002，TrendsBiotechnol，2002年5月，20(5)200-6；Archer和Peberdy，CritRevBiotechnol，1997，17(4):273_306。转化的酵母在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。关于异源基因在酵母中表达的原理的综述见例如MethodsMolBiol,1995,49341-54及CurrOpinBiotechnol，1997年10月，8(5):554_60。在这个方面，可以使用酵母作为异源基因表达的媒介，诸如物种啤酒糖酵母(Saccharomycescereviseae)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)(见FEMSMicrobiolRev,2000,24(1):45_66)。关于在啤酒糖酵母中表达异源基因和分泌基因产物的原理的综述见EHinchcliffe禾口EKenny,1993，“Yeastasavehiclefortheexpressionofheterologousgenes，，，Yeast，Vol.5，AnthonyHRose禾口JStuartHarrison编，第2片反，AcademicPressLtd.0关于酵母的转化，已经开发了数种转化方案。例如，可以通过遵循Hirmen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUSA,751929；Beggs，JD,1978,Nature,London,275104；及Ito,H等，1983，JBacteriology,153163-168的讲授来制备根据本发明的转基因糖酵母。可以使用多种选择标记来选择经过转化的酵母细胞，诸如营养缺陷标记和显性抗生素抗性标记。转化的植物/植物细胞适于本发明的宿主生物体可以是植物。关于一般技术的综述可以见Potrykus,AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol,1991,42205-225RChristou,Agro-Food-IndustryHi-Tech，1994年3月/4月，17-27的论文。培养和生产可以在有益于生成所编码酶且易于从细胞和/或培养基中回收酶的条件下培养经过本发明核苷酸序列转化的宿主细胞。用于培养细胞的培养基可以是适于培养所讨论宿主细胞且使得酶表达的任何常规培养基。由重组细胞生成的蛋白质可以展示在细胞表面上。可利用公知的方法，从宿主细胞分泌酶并方便地从培养基中回收。分泌通常希望表达宿主将酶分泌到培养基中，由此可以更加容易地回收酶。根据本发明，可以根据期望的表达宿主来选择分泌前导序列。杂合信号序列也可用于本发明的背景。异源分泌前导序列的典型实例有来自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸的两种形式，例如来自曲霉属)、α-因子基因(酵母，例如糖酵母属、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、和汉逊氏酵母)、或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的分泌前导序列。举例来说，关于大肠杆菌中异源蛋白质分泌的综述见MethodsEnzymol,1990,182:132-43。检测本领域知道用于检测和测量氨基酸序列表达的多个方案。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、和荧光激活细胞分拣术(FACS)。本领域技术人员知道多种标记物和缀合技术，它们可用于多种核酸和氨基酸测定法。许多公司，诸如PharmaciaBiotech(Piscataway,NJ)、Promega(Madison,WI)、禾口USBiochemicalCorp(Cleveland，OH)，供应用于这些流程的商品化试剂盒和方案。合适的报道分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光、或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等。讲授这些标记物的用途的专利包括US-A-3，817，837、US-A-3,850，752、US-A-3,939，350、US-A-3,996，345、US-A-4,277，437、US-A-4,275，149和US-A-4,366，241。同样，可以如US-A-4，816，567中所述生成重组免疫球蛋白。融合蛋白可以以融合蛋白的形式生成根据本发明使用的氨基酸序列，例如以便于它的提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)、和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体与目的蛋白质序列之间包含蛋白水解切割位点从而能够切除融合蛋白序列也是方便的。优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白质序列的活性。关于大肠杆菌中的基因融合表达系统的综述见Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5):501-6。在本发明的另一个实施方案中，可以将氨基酸序列与异源序列连接以编码融合蛋白。例如，为了对肽库筛选能够影响物质活性的试剂，编码表达受到商品化抗体识别的异源表位的嵌合物可能是有用的。大规模应用在本发明的一个优选实施方案中，将氨基酸序列用于大规模应用。优选地，培养宿主生物体后产生的氨基酸序列的量为Ig每升至约2g每升总细胞培养液体积。优选地，培养宿主生物体后产生的氨基酸序列的量为IOOmg每升至约900mg每升总细胞培养液体积。优选地，培养宿主生物体后产生的氨基酸序列的量为250mg每升至约500mg每升总细胞培养液体积。食物本发明的组合物可用作-或用于制备-食物。本文中，术语“食物”以广义来使用，并覆盖用于人的食物以及用于动物的食物(即饲料)。在一个优选的方面，食物是用于人消费的。食物可以是溶液的形式或作为固体_这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。食物成分本发明的组合物可用作食物成分。本文中所用的术语“食物成分”包括加到或可加到功能食物或食品中的配方，并包括在需要例如酸化或乳化的极其多种产品中能以低水平使用的配方。食物成分可以是溶液的形式或作为固体_这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。食物产品本发明的组合物可用于制备诸如以下一种或多种的食物产品糖果产品、乳制品、肉制品、禽产品、鱼产品和焙烤品。本发明还提供了制备食物或食物成分的方法，该方法包括将根据本发明的脂肪分解酶与其它食物成分混合。在附带的权利要求书中和在以下附图和实施例中呈现了进一步优选的方面。附图描述图1显示了PCR片段SEQIDNo.1，其是部分非酶编码多核苷酸；该序列是广泛用于分类学比较的核糖体16SRNA基因；图2显示了PCR片段SEQIDNo.2，其是部分非酶编码多核苷酸；该序列是广泛用于分类学比较的核糖体16SRNA基因；图3显示了编码根据本发明的脂肪分解酶的多核苷酸(SEQIDNo.3)；图4显示了根据本发明的脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQIDNo.4)；图5显示了脂肪分解酶表达载体pGTK(L131)和pETll(131-51)的结构；图6显示了来自链霉菌属菌种L130的脂肪分解酶对生面团中的二半乳糖苷甘油二酯的效果图；图7显示了来自链霉菌属菌种L131的脂肪分解酶对生面团中的二半乳糖苷甘油二酯的效果图；图8显示了来自链霉菌的脂肪分解酶对生面团中的甘油三酯的效果图；图9显示了得自链霉菌属菌种L131的脂肪分解酶对半乳糖脂底物的pH图谱；图10显示了提取自经标记为#236的大肠杆菌中表达的链霉菌脂肪分解酶处理的生面团的脂质的TLC板；泳道1=对照；泳道2=#236,0.225PLU_7/g面粉；泳道3=#236，0.45PLU-7/g面粉；泳道4=#236，0.675PLU_7/g面粉；泳道5=DGDG参照材料。图11显示了由pUC18(L131R)和pIJ48构建的表达载体pRX487；图12以图的形式显示了温度对来自链霉菌属菌种L131的脂肪分解酶的稳定性和活性的影响；图13以图的形式显示了来自链霉菌属菌种L131、除虫链霉菌、Corynebacteriumefficiens、和褐色喜热裂孢菌的半乳糖脂酶的底物特异性；图14显示了用于在谷氨酸棒杆菌中表达褐色喜热裂孢菌脂肪酶的表达载体PCB5(TF)的结构；图15显示了L131与同源除虫链霉菌和褐色喜热裂孢菌的序列对比；图16显示了粗制大豆油样品的酶处理反应产物的HPTLC板。泳道1=对照，泳道2=99%粗制油和K371的10%水溶液，泳道3=98%粗制油和2%K371的10%水溶液，泳道4=97%粗制油和3%K371的10%水溶液，泳道5=99.7%粗制油和0.3%LecitaseUltra#3108的水溶液，泳道6=99%粗制油、0.3%LecitaseUltra#3108和0.7%水的水溶液。分析磷脂酰胆碱(PC)作为参照；和图17显示了粗制大豆油样品的酶处理反应产物的HPTLC板。泳道1=对照，泳道2=99%粗制油和K371的10%水溶液，泳道3=98%粗制油和2%K371的10%水溶液，泳道4=97%粗制油和3%K371的10%水溶液，泳道5=99.7%粗制油和0.3%LecitaseUltra#3108的水溶液，泳道6=99%粗制油、0.3%LecitaseUltra#3108和0.7%水的水溶液，以及胆固醇酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯和植物留醇的参考泳道。实施例1产半乳糖脂酶的细菌菌株的鉴定。从芬兰南部收集的土壤中分离得到具有相似表型的两个微生物菌株，编号为L130和L131。使用寡核苷酸引物536f(CAGCMGCCGCGGTAATffC)和1392r-引物(ACGGGCGGTGTGTRC)通过标准PCR扩增这两个菌株的16SRNA基因。对得到的PCR片段部分测序。SEQIDNo.1和2是非酶编码多核苷酸。这些序列是广泛用于分类学比较的核糖体16SRNA基因。发现SEQIDNo.1和SEQIDNo.2具有高度相似性。然后将该序列与GenBank中的16SRNA基因序列作比较。对于这两个分离株，观察到与Sti^ptomycesthermosacchari的16SRNA基因序列有最高同源性(97%)。所以，将菌株命名为链霉菌属菌种L130和链霉菌属菌种L131。实施例2链霉菌属菌种L130和L131菌株的脂肪分解酶(半乳糖脂酶)样品的制备。将链霉菌L130接种0.5升LB培养基并在旋转摇床上以200rpm和30°C培养2天。将该培养物作为接种体接种10升装有相同培养基的发酵罐。以30°C、搅拌速率600rpm和通气量0.5v/v继续培养3天。将发酵液通过离心(15分钟、5000rpm)澄清并加入TritonX-100至终浓度0.1%O用Vivaflow200超滤器(VivascienceAG,Hannover，德国)将溶液浓缩至300ml。将浓缩液用10升含2mMCaCl2和2mMMgCl2的20mMTrisHCl缓冲液pH7透析，然后用0.5升85%甘油透析。根据上文定义的测定法(GLU-7)，得到的制品含90U半乳糖脂酶活性。在相同条件下培养链霉菌L131菌株，并通过相同流程浓缩培养液。得到的半乳糖脂酶制品含70U活性。实施例3烘焙实验来自细菌分离株L130和L131的半乳糖脂酶对极性脂质底物，半乳糖脂(DGDG)和磷脂显示出高活性(半乳糖脂酶和磷脂酶活性)，与尖镰孢脂肪酶(LipopanFNovozymesA/S丹麦)相当可是，发现来自细菌分离株L130和L131的半乳糖脂酶(即根据本发明的脂肪分解酶)对甘油三酯不具有显著的活性。这与尖镰孢脂肪酶-LipopanF的活性形成极大反差。如实施例2中所述制备细菌分离株L130和L131的脂肪分解酶，并在标准测定条件中和在生面团中进行分析以表征它们对糖脂、磷脂和甘油三酯的活性。小规模进行烘焙实验和生面团模型系统。两种酶在面粉中对半乳糖脂很有活性。材料和方法如实施例3制备每种酶的三个样品。每个样品如表1所示进行标注表1<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>通过上文提到的磷脂酶活性测定法(PLU-7)和半乳糖脂酶活性测定法(GLU-7)来评估酶的磷脂酶和半乳糖脂酶活性。生面浆实验在12ml有盖离心管中称取0.8克小麦粉。加入1.5ml含酶的水。在样品在回转器(Whirley)上混合并在加热箱中于30°C放置60分钟。加入6ml91的正丁醇乙醇，再次混合样品直至面粉很好的分散到溶剂中。将试管在水浴中于95°C放置10分钟。然后再次混合并在旋转设备上以45rpm放置45分钟。然后将样品以2000g离心10分钟。将2ml上清液转移至IOml打兰杯(dramglass)0在氮气下于70°C蒸发掉溶剂。通过GLC分析分离的脂质。气相色谱PerkinElmer8420毛细管气相层析，装有WCOT熔融石英柱，12.5mxO.25mmIDχ0.1μm5%苯基-甲基-硅树脂(购自Crompack的CPSiI8CB)。载体氦。注射1·5μL，分流(withsplit)。检测仪FID.385°C。烤炉程序1234烤炉温度[°C]80200240360等温时间[分钟]2OO10升温速率[°C/分钟]201012样品制备将从0.2克面粉提取的脂质溶于2mL21的庚烷吡啶，其中含有2mg/mL内部标准十七烷。将500μL样品转移至曲颈瓶。加入100μLMSTFA(N-甲基-N-三甲基硅烷基_三氟乙酰胺)并于90°C将反应保温15分钟。计算根据这些成分的参照混合物来测定甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、游离脂肪酸和半乳糖脂的响应因子。根据这些响应因子来计算生面团中的脂质。结果。对来自链霉菌属的酶的样品分析磷脂酶和半乳糖脂酶活性，其结果如表2所示。还计算了PLU-7/GLU-7活性比率。样品的平均比率是1.4，但在有些样品中有些偏差，其可由分析偏差来解释。表2样品ID~~生物体GLU-7~~PLU-7PLU-7/GLU-7比率~180L130A095L31L4~181L130BοΓθL31L4~182L130CL21L53L3~183L131AθΓ63L29ZO~184L131BOiΛ6L4~185L131CL35Λ7O生面团实验。在如材料和方法所述的生面浆实验中测试酶对小麦脂质的活性。通过GLC分析来自生面团的分离脂质，如表3所示。表3.生面团脂质的GLC分析(以面粉重量为基准的％)。FFA=游离脂肪酸。MGMG=单半乳糖苷甘油单酯。DGMG=二半乳糖苷甘油单酯。MGDG=单半乳糖苷甘油二酯。DGDG=二半乳糖苷甘油二酯。TRI=甘油三酯。酶剂量IDPLU/g面粉FFAMGMGDGMGMGDGDGDGTRI~1850.1050.16420.00420.03800.03450.15200.5515~1850.2630.16870.01300.06700.02390.09410.5470~1850.5260.20960.01210.06640.01580.06170.5460~185Τθ50.25970.00360.05460.00680.03030.5301~1820.0970.15420.00510.05630.03130.11480.5475~1820.2440.16870.01590.07850.02000.05660.5280~1820.4880.20950.00550.06460.00980.02190.5418~1820.9760.25810.00920.04390.00430.00450.5579对照00.15290.00060.01880.04400.14430.5054<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表3的结果确认了，在链霉菌属菌种L130和L131的发酵上清液中分离出的酶对生面团中的半乳糖脂很有活性。二酯D⑶G和MGDG水解成相应的单酯DGMG和MGMG0图6和7也图示了结果。这些结果确认了，这两种酶在0-0.2单位/g面粉的低剂量很有活性并产生了相应量的单酯。在0.4-1单位/克面粉的更高剂量时，DGDG进一步降解，但也观察到一些单酯水解。这可能暗示，酶对半乳糖脂分子中的脂肪酸位置不是特异性的。如图8所示，几乎不存在酶对甘油三酯的活性。因此得出结论，所测试的酶对甘油三酯不具有显著的效果。这也与以三丁精作为底物进行的一些实验一致，其中没有观察到有活性。小结在链霉菌属菌种的发酵上清液中分离出脂肪分解酶。发现脂肪分解酶具有磷脂酶和半乳糖脂酶两种活性，但对甘油三酯无显著活性。对于所测试的样品，磷脂酶半乳糖脂酶活性的比率约为1.4。生面浆实验确认了，酶对面粉中的半乳糖脂有活性。酶在0-0.2单位/g面粉的很低剂量时在生面团中有活性。商品化的磷脂酶，像LipopanF(NovozymesA/S，丹麦)，需要高3-4倍的剂量才能获得对半乳糖脂的相同效果。生面浆实验还确认了，来自链霉菌属菌种的酶对甘油三酯不具有可测量的活性。实施例4从链霉菌属菌种L131克隆脂肪分解酶基因。利用修正的标准方法从链霉菌属菌种L131分离染色体DNA。将细菌在旋转摇床上在30°C和高通气条件下(每个0.5升带有障板的烧瓶装有IOOml培养基，200rpm)在LB培养基中培养至早期稳定期。从500ml细菌培养液离心收集细胞，并用裂解缓冲液(550mM葡萄糖、IOOmMTris、2mMEDTA，pH8.0)洗涤一次。将细胞团重悬于IOml裂解缓冲液，并加入溶菌酶至lmg/ml。将细胞于37°C保温至少15分钟。溶菌酶消化后，将细菌悬浮液的等分试样转移至SDS溶液中，并于600nm测量所得混合物的吸光度。调整溶菌酶量和保温时间，使得根据4_的降低情况所有细胞中至少70-90%得到裂解。在该时间点，向细菌悬浮液中加入SDS至和蛋白酶至0.Img/ml。将悬浮液于56°C保温30分钟，然后用苯酚和氯仿抽提。氯仿抽提后，用醋酸钠(0.5M终浓度)和异丙醇(0.6vol/vol)沉淀DNA，并用70%乙醇洗涤DNA团，真空干燥并溶于含RNA酶Α(0·0lmg/ml)的TE缓冲液(IOmMTrisUmMEDTA)。用限制性内切核酸酶Sau3A部分消化DNA，并将水解产物在0.8%琼脂糖凝胶上分离。通过电泳从琼脂糖凝胶上分离出3-10kb的Sau3A片段。使用Stratagene(LaJolla,美国)的ZAP表达/预消化载体/Gigapack克隆试剂盒(产品#239615)将该DNA制品用来构建基因文库。按照Stratagene提供的方案，进行连接、包装、扩增文库并将其转变成噬菌粒形式。在如下制备的指示板上筛选质粒形式的所得基因文库。将80ml含25mg/l卡那霉素的无菌LB琼脂置于每个15cm皮氏培养皿中并使之凝固。随后，加入IOml上层琼脂层，其含有0.5%DGDG和0.0005%番红0。以约5000个克隆每个15cm平板的密度涂布基因文库。将平板于37°C保温24小时，然后于室温保温4天。从文库中挑选在指示板上形成红晕的克隆，并通过在新的指示板上克隆来纯化。将从该克隆分离的质粒(命名为pBK(L131))用于重新转化大肠杆菌菌株XLl-BlueMRF'，使之带有卡那霉素抗性。所有这些转化子都表现出半乳糖脂酶阳性表型。pBK(L131)含有约7.5kb的插入物。对该插入物测序。发现一个测出序列的区域(SEQIDNo.3)含有可读框(SEQIDNo.4)，其编码显示出与来自龟裂链霉菌的已知脂肪酶有同源性的蛋白质。该脂肪酶，脂肪酶/酯酶/酰基转移酶的所谓GDSX家族的一个成员，仅已知能水解中性脂质和人造脂肪酶底物。构建原始插入物的一系列删除体和亚克隆，并测试半乳糖脂酶活性。发现携带原始插入物的3kbEcoRI-SacI片段的删除衍生物仍保持全部的D⑶G酶活性。该数据与部分DNA的结果高度关联。一个区域证明了与已知脂肪酶有同源性。该区域随后测得完整序列。将该序列与GenBank作比较，揭示了经过生化表征的L131半乳糖脂酶的最接近同源物(58.5%)是来自龟裂链霉菌的脂肪酶，在W004/064987和W004/064537中鉴定为脂质酰基转移酶。L131半乳糖脂酶在大肠杆菌中的表达。使用标准pET系统，其中基因在T7噬菌体启动子的控制之下，在大肠杆菌中表达L131半乳糖脂酶。L131半乳糖脂酶在浅青紫链霉菌中的表达。用于在浅青紫链霉菌中表达L131半乳糖脂酶的穿梭载体pRX487_5(图11)(衍生自pIJ4987:KieserΤ.等，PracticalStreptomycesgenetics.TheJohnInnesFoundation,Crowes,Norwich，英格兰，2000)组合了大肠杆菌质粒pUC18和浅青紫链霉菌质粒PIJ487。在pRX487-5中，pUC18的Iac启动子置于pIJ487的无启动子的卡那霉素磷酸转移酶基因的上游。事实上，经质粒转化的大肠杆菌不仅具有氨苄青霉素抗性而且具有至少低水平(5mg/l)的卡那霉素抗性。载体含有未经修饰的S.thermosacchari染色体DNA的EcoRI-XbaI片段，其包含完整的半乳糖脂酶基因编码序列，约有160bp上游非编码序列和420bp下游非编码序列。根据指示板上晕形成的判断，所有转化子显示出相似水平的半乳糖脂酶活性。相似地，在以10升水平培养携带pRX487-5的浅青紫链霉菌并在指示板上克隆时，所有克隆表现出能产生等量的半乳糖脂酶活性。在用直接来自平板的无性繁殖细胞接种的小摇瓶培养物中，转化子通常在培养3天后产生约10-20mU/ml半乳糖脂酶活性。在用重组浅青紫链霉菌的孢子接种摇瓶培养物时，与更高的生物量积累对应，测得更高的半乳糖脂酶活性(约30mU/ml)。在发酵罐中在高通气条件下以补料分批模式培养携带PRX487-5的浅青紫链霉菌(详情参见材料和方法)，在该实验中，生物量积累达到了170g/升(湿重)。因此，检测到更高的半乳糖脂酶活性_约lU/ml。L131的生化特性。测试了L131的一些生化特性。发现酶的最适pH约为6.5-7.5(图9)。酶对D⑶G在约50°C的温度展示出最大活性。在该温度以上发生失活，但不剧烈，于90°C保温20分钟后检测到约10%的剩余活性(图12)。实施例5根据本发明的链霉菌属L131脂肪分解酶基因在大肠杆菌中的表达用引物oL131-5(GGTGAATTCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG，有义引物)和oL131-3(ACTTCTAGAGCGGCGCCACCGTGACGTACA,反义引物)通过PCR扩增pBK(Li31)的可读框，其编码根据本发明的推定脂肪分解酶。用EcoRI和XbaI消化扩增的DNA片段并克隆到枯草杆菌-大肠杆菌穿梭载体PGTK44中。该载体是通过用pGT44(KerovuoJ.等，BiotechnologyLetters22，1311-1317，2000)的EcoRI-SalI片段替换含degQ36启动子的质粒PGTK44(Povelainen等，BiochemJ.371，191-197，2003)的SalI-EcoRI片段而构建的。利用指示板在用所得质粒pGTK44(L131)转化的大肠杆菌中检测到半乳糖脂酶活性(图5)。对照转化子(含亲本质粒PGTK44)是半乳糖脂酶阴性的。所以，SEQIDNo4所代表的蛋白质序列确实拥有半乳糖脂酶活性。相同的引物对从链霉菌属菌种L130的染色体DNA扩增出相同大小的片段(通过琼脂糖凝胶电泳)，进一步确认了先前关于两个分离株及其半乳糖脂酶基因密切相似的观察结果。对于在T7噬菌体启动子控制下的大肠杆菌中的表达，用链霉菌属菌种L131d染色体DNA作为模板，并用两种寡核苷酸引物(OL131-51GGTCATGCTAGCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG和oL131_31GCATGGATCCGCGGCGCCACCGTGACGTACA)通过PCR扩增推算的半乳糖脂酶编码区。用NheI和BamHI消化PCR产物并与用相同限制性内切核酸酶消化的pETlla(N0Vagen，美国)载体连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌菌株XL-BluelMRF'，分离出具有与PETll(131-51)结构对应的限制性样式的12个不同质粒克隆(图4)。将每个质粒克隆分别用于转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，并在含半乳糖脂酶活性指示层的LB-氨苄青霉素上培养所得转化子(实施例4)。大多数克隆确实表达了有活性的半乳糖脂酶。选择一个克隆(ρΕΤ11(131-51)-12)作为后续表征的重组半乳糖脂酶来源。分析了在大肠杆菌中表达的酶(标记为#236)，并在使用本文中教导的GLU-7测定法和PLU-7测定法进行分析时，发现其具有0.33GLU/ml和0.36PLU/ml。在液体培养中，大肠杆菌BL21(DE3)在LB-氨苄青霉素培养基中培养40小时后(37°C，200rpm摇动)表达约2mU/ml半乳糖脂酶活性。基本上在培养基中发现了所有活性。在用pETlla(N0Vagen，美国)转化并在相同条件下培养的大肠杆菌BL21(DE3)中没有检测到半乳糖脂酶活性。将约4升含半乳糖脂酶的培养液在旋转蒸发器上浓缩至约300ml，并在15升含2mMCaCl2和2mMMgCl2的20mMTrisHCl缓冲液pH7中进行透析。将透析后的材料在旋转蒸发器上再次浓缩至约30ml并在2升50%甘油中进行透析。得到的制品(18ml)含有约100mU/ml半乳糖脂酶活性。还在生面团中测试了在大肠杆菌中表达的酶(标记为#236)。如显示TLC板的图10所示，在生面团中观察到对半乳糖脂的高活性。实施例6来自链霉菌属菌种L131的根据本发明的脂肪分解酶基因在不同宿主中的表达。实施例5中概述了载体pGTK44(L131)的构建。除了大肠杆菌，该载体可用于在芽胞杆菌中生成根据本发明的链霉菌属L131脂肪分解酶。利用该载体仅仅是在芽胞杆菌中表达根据本发明的L131脂肪分解酶的许多可能途径之一。例如，pGTK44(L131)中采用的Pst启动子可用在芽胞杆菌中有活性的任何其它强组成性或受调节启动子替换。本领域知道许多这样的启动子。例如，degQ36启动子(YangM等，J.Bacteriol.166:113_119，1986)、cdd启动子，也称为p43(WangPZ、DoiRH,J.Biol.Chem.259:8619_8625，1984)、淀粉酶或中性蛋白酶启动子等。除了pGTK44(L131)和基于pTZ12复制子的其它芽胞杆菌载体(AokiΤ.等，Mol.Gen.Genet.208=348-352,1987)，可使用任何其它质粒载体(如pUBllO及其衍生物，GryczanTJ等，J.Bacteriol.134:318_29，1978)。用于表达根据本发明的链霉菌属L131脂肪分解酶基因的其它优选宿主是高GC的革兰氏阳性细菌，特别是链霉菌属(例如浅青紫链霉菌(S.Iividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)、纳塔尔链霉菌(S.natalensis)、锈赤链霉菌(S.rubiginosus)、橄榄链霉菌(S.olivaceus)、橄榄产色链霉菌(S.olivochromogenes)、紫红链霉菌(S.violaceoruber))，在这些宿主中，可以在多拷贝载体(如利用pIJllO衍生物，诸如pIJ486，Ward等，Mol.Gen.Genet.203=468-478,1986)上在其自身启动子之下导入根据本发明的脂肪分解酶基因，或者置于强链霉菌启动子的控制之下，例如ermE*(Schmitt-JohnT、EngelsJff,Appl.Microbiol.Biotechnol.36:493_498，1992)或硫链丝菌素可诱导的tipA启动子(KieserT等，在《PracticalStr印tomycesGenetics》中，p.386,TheJohnInnesFoundation,Norwich,英国，2000)。除了原核宿主，可以在许多合适的真菌物种之一中表达L131脂肪分解酶基因。具体而言，诸如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯德毕氏酵母(Pichiapastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)等酵母是合适的。在酵母中，可以将脂肪分解酶基因置于任何已知强酵母启动子的控制下，诸如糖酵解启动子(PGK、GDH、ENO等)、磷酸盐饥饿诱导的启动子诸如PH05、乙醇/甲醇代谢的启动子诸如酿酒酵母中的ADHl启动子、或多形汉逊酵母或巴斯德毕氏酵母中的甲醇可诱导启动子。在任何宿主中表达脂肪分解酶时，构建编码序列SEQIDNo.4的合成或半合成基因将是有益的。同样，根据可通过实施例4中所解释的计算机同源性检索得到的序列，可以设计部分或完全合成的基因。这种序列可引入野生型脂肪分解酶基因中缺乏的许多有用特征。例如，可修正密码子偏好以更好地适应表达宿主的密码子偏好。可用于所有宿主的密码子偏好修正的一个特殊例子是将SEQIDNo3的GTG起始密码子转变成ATG。对于本领域技术人员显而易见的另一项典型修正是将L131脂肪分解酶的天然链霉菌信号序列换成在所选表达宿主中天然的或已知有功能的信号序列。前面用于L131脂肪分解酶的有用表达系统的例子集中于利用质粒载体将脂肪分解酶基因导入表达宿主。这确实是实现本发明的优选模式。可是，将表达盒(包括启动子、脂肪分解酶基因编码区和任选的转录终止子)整合到染色体中的一种可选方法也是可行的。具体而言，将表达盒多拷贝的整合到宿主染色体中将是有效的。可以有益地突变表达脂肪分解酶基因的重组宿主以降低培养基中的蛋白酶活性水平。任何此类重组宿主的培养可在存在稳定酶的化合物时进行。此类化合物可以是各种蛋白质(如酪蛋白、血清清蛋白的胨)或不同的脂质、溶血脂质或洗涤剂(如半乳糖脂、单和二酰甘油或TritonX-100)。实施例7链霉菌属L131脂肪分解酶及其衍生物的酰基转移酶活性有些脂肪酶可能还具有酰基转移酶活性。具体而言，⑶SX家族的有些成员，例如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)酰基转移酶(P10480)(在共同未决的国际申请PCT/IB2004/000655中有教导)，具有高酰基转移酶活性。所以，预测链霉菌属L131脂肪分解酶可能也具有酰基转移酶活性。通过随机突变/定向进化可进一步增强该活性。另外，由于嗜水气单胞菌酰基转移酶和链霉菌属L131脂肪分解酶共享相同的整体蛋白质折叠，有可能将链霉菌属L131脂肪分解酶的底物特异性与气单胞菌属酶的高转移酶效率结合起来。可通过靶向诱变/蛋白质设计或通过基因改组的已知技术来实现该结合。实施例8来自其它链霉菌属物种的可选脂肪分解酶的鉴定。GDSX酯酶家族(UptonC、BuckleyJT,TrendsBiochem.Sic.20178-179，1995，pfam00657.11)是在活性位点丝氨酸周围共享特定序列基序(GDSX，其中X是疏水氨基酸残基)的一组酯酶/脂肪酶/酰基转移酶。该组酶也称为脂肪酶家族II(Arpigny几、JaegerK-E,Biochem.J.343177-183，1999)。尽管该家族包括许多不同类型的酯酶、脂肪酶和酰基转移酶，但是根据本发明的脂肪分解酶是GDSX酶。所以，本发明教导的链霉菌属菌种L131脂肪分解酶(半乳糖脂酶)序列可用于在计算机上鉴定来自其它链霉菌属物种的其它半乳糖脂酶。为了确定蛋白质是否具有根据本发明的GDSX基序，优选将序列与pfam数据库的隐蔽马尔科夫(Markov)模型序型(profile)(HMM序型)进行比较。pfam是蛋白质结构域家族的数据库。pfam包含排列好的每个家族的多重序列对比，以及用于在新序列中鉴定这些结构域的序型隐蔽马尔科夫模型(序型HMM)。关于pfam的介绍见BatemanA等，2002，NucleicAcidsRes.30:276_280。隐蔽马尔科夫模型在致力于蛋白质分类的许多数据库中得到采用，综述见BatemanA和HaftDH,2002,BriefBioinform3:236_245。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd=Retrieve&db=PubMed&listuids=12230032&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd=Retrieve&db=PubMed&listuids=11752314&dopt=Abstract关于隐蔽马尔科夫模型的详细解释和它们在pfam数据库中是如何应用的见DurbinR、EddyS禾口KroghA,1998,Biologicalsequenceanalysis；probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.CambridgeUniversityPress,ISBN0-521-62041-4。Hammer软件包可以从华盛顿大学(StLouis,USA)获得。或者，可以使用Hammer软件包来鉴定⑶SX基序，指令见DurbinR、EddyS和KroghA,1998,Biologicalsequenceanalysis；probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.CambridgeUniversityPress,ISBN0-521-62041-4及其参考文献，以及此说明书中提供的HMMER2序型。可以通过例如目前位于下列网站的几个服务器访问PFAM数据库。http//www.Sanger,ac.uk/Software/Pfam/index,shtmlhttp://pfam.wustl.edu/http://pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.CRb.ki.se/数据库提供了能够输入蛋白质序列的搜索工具。使用数据库的默认参数，就将对蛋白质序列分析是否存在Pfam结构域。GDSX结构域是数据库中已经确定的结构域，因此它在任何检索序列中的存在都将受到识别。数据库将对检索序列报告其与Pfam00657共有序列的对比。优选地，在与Pfam00657共有序列对比时，本发明组合物/方法所使用的脂肪分解酶具有⑶Sx模块、GANDY模块和HPT模块中的至少一个、优选超过一个、优选超过两个。适宜地，脂肪分解酶可以具有⑶Sx模块和GANDY模块。或者，酶可以具有⑶Sx模块和HPT模块。优选地，酶包含至少⑶Sx模块。pfam00657⑶SX结构域是区分具有此结构域的蛋白质与其它酶的独特鉴别物。另外/或者，通过与SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示一种或多种PCR序列片段进行序列同一性比较和/或杂交，可以从其它链霉菌属物种鉴定可选脂肪分解酶。适宜地，可以与包含SEQIDNo.1或SEQIDNo.2中超过15个核苷酸的片段，优选与包含SEQIDNo.1或SEQIDNo.2中超过20个核苷酸的片段进行比较。适宜地，可以使用SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的完整序列。优选地，在高或很高严谨条件下进行杂交。与SEQIDNo.1或SEQIDNo.2具有至少80%、优选至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核苷酸序列指示可能是根据本发明的脂肪分解酶，即半乳糖脂酶的来源的链霉菌属菌株。实施例9应用于本申请方法和用途中的半乳糖脂酶的鉴定如上所述，新的Str印tomycesthermosacchariL131序列提供了在计算机上鉴定新的家族II半乳糖脂酶的可能性。在这方面，特别感兴趣的一个特别区域是GDSX基序。GDSX基序由四个保守氨基酸构成。优选地，基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，⑶SX基序的丝氨酸可以位于与Brumlik和Buckley，JournalofBacteriology,1996年4月，Vol.178，No.7，p2060-2064中讲授的嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Ser-16对应的位置。为了确定蛋白质是否具有GDSX基序，优选将序列与pfam数据库的隐蔽马尔科夫模型序型(HMM序型)进行比较。如实施例8中所述，pfam是蛋白质结构域家族的数据库。所以，pfam数据库还可用于鉴定来自链霉菌属以外的属的合适的酶。或者，可以使用Hammer软件包来鉴定⑶SX基序，指令见DurbinR、EddyS和KroghA,1998,Biologicalsequenceanalysis；probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.CambridgeUniversityPress,ISBN0-521-62041-4及其参考文献，以及此说明书中提供的HMMER2序型。优选地，根据本发明的脂肪分解酶包含⑶SX基序。在与pfamPfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQIDNo4)对比时，i)本发明的、或应用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶，优选具有⑶Sx基序，更优选⑶SY基序。和/或ii)本发明的、或应用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶，优选具有GANDY模块，更优选GANDY模块，其包含氨基酸GGNDx，更优选GGNDA或GGNDL。和/或iii)本发明的、或应用于本发明方法中的酶，优选具有HTP模块。48并优选iv)本发明的、或应用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶，优选具有⑶SY基序和GANDY模块和HTP模块(保守的组氨酸)，所述GANDY模块包含氨基酸GGNDx，优选GGNDA或GGNDL。在这点上，本发明人鉴定了与链霉菌属L131同源但不含⑶SX基序的序列即Novosphingobiumaromaticivorans(NAL)Novosphingobium\aromaticivorans\GDSx284aaSEQIDNo.10ZP000941651mgqvklfarrcapvllalaglapaatvareaplaegaryvalgssfaagpgvgpnapgsp61ercgrgtlnyphllaealkldlvdatcsgatthhvlgpwnevppqidsvngdtrlvtlti121ggndvsfvgnifaaacekmaspdprcgkwreiteeewqadeermrsivrqiharaplarv181vvvdyitvlppsgtcaamaispdrlaqsrsaakrlaritarvareegasllkfshisrrh241hpcsakpwsnglsapaddgipvhpnrlghaeaaaalvklvklmk/SEQIDNo.111tgccggaactcaagcggcgtctagccgaactcatgcccgaaagcgcgtggcactatcccg61aagaccaggtctcggacgccagcgagcgcctgatggccgccgaaatcacgcgcgaacagc121tctaccgccagctccacgacgagctgccctatgacagtaccgtacgtcccgagaagtacc181tccatcgcaaggacggttcgatcgagatccaccagcagatcgtgattgcccgcgagacac241agcgtccgatcgtgctgggcaagggtggcgcgaagatcaaggcgatcggagaggccgcac301gcaaggaactttcgcaattgctcgacaccaaggtgcacctgttcctgcatgtgaaggtcg361acgagcgctgggccgacgccaaggaaatctacgaggaaatcggcctcgaatgggtcaagt421gaagctcttcgcgcgccgctgcgccccagtacttctcgcccttgccgggctggctccggc481ggctacggtcgcgcgggaagcaccgctggccgaaggcgcgcgttacgttgcgctgggaag541ctccttcgccgcaggtccgggcgtggggcccaacgcgcccggatcgcccgaacgctgcgg601ccggggcacgctcaactacccgcacctgctcgccgaggcgctcaagctcgatctcgtcga661tgcgacctgcagcggcgcgacgacccaccacgtgctgggcccctggaacgaggttccccc721tcagatcgacagcgtgaatggcgacacccgcctcgtcaccctgaccatcggcggaaacga781tgtgtcgttcgtcggcaacatcttcgccgccgcttgcgagaagatggcgtcgcccgatcc841gcgctgcggcaagtggcgggagatcaccgaggaagagtggcaggccgacgaggagcggat901gcgctccatcgtacgccagatccacgcccgcgcgcctctcgcccgggtggtggtggtcga961ttacatcacggtcctgccgccatcaggcacttgcgctgccatggcgatttcgccggaccg1021gctggcccagagccgcagcgccgcgaaacggcttgcccggattaccgcacgggtcgcgcg1081agaagagggtgcatcgctgctcaagttctcgcatatctcgcgccggcaccatccatgctc1141tgccaagccctggagcaacggcctttccgccccggccgacgacggcatcccggtccatcc1201gaaccggctcggacatgctgaagcggcagcggcgctggtcaagcttgtgaaattgatgaa1261gtagctactgcactgatttcaaatagtattgcctgtcagctttccagcccggattgttgc1321agcgcaacagaaacttgtccgtaatggattgatggtttatgtcgctcgcaaattgccgtc491381gaagggaacgggcgcgtcgctcgttaacgtcctgggtgcagcagtgacggagcgcgtgga1441tgagtgatactggcggtgtcatcggtgtacgcgccgccattcccatgcctgtacgcgccgII该酶包含序列“GSSF”而不是⑶SX。测试后发现该酶不包含根据本发明的糖脂酶活性。所以，在尝试鉴定其它合适的半乳糖脂酶时，GDSx基序可能是重要的。注意，已经纯化和生化鉴定并显示出与链霉菌属L131约56%序列同源性的来自龟裂链霉菌的酶(AbramicM.等，1999;VujaklijaD.等，2002)，已知水解中性脂质，诸如三油精或脂肪的硝基苯基酯。来自龟裂链霉菌的酶还可水解根据本发明的半乳糖脂酶。相似地，可得到其基因组序列数据的其它两个链霉菌属物种-天蓝色链霉菌A2(3)和除虫链霉菌可能含有具有半乳糖脂酶活性的酶，例如NP_625998和NP_827753在GenBank中现在注释为“推测的分泌型水解酶”。通过相似方法可鉴定链霉菌属L131半乳糖脂酶的许多其它有用同源物。利用AlignX、VectorNTI的ClustalW成对对比算法使用缺省设置，通过与L131序列对比，可鉴定适用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶。或者，通过与pfamPfam00657共有序列(如W004/064987中所述)对比，可鉴定适用于本发明方法中的半乳糖脂酶。图15显示了L131与来自除虫链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的序列对比。图15图示了保守的GDSx基序(在L131和除虫链霉菌和褐色喜热裂孢菌中的GDSY)、或为GGNDA或为GGNDL的GANDY盒、和HPT模块(认为是保守的催化性组氨酸)。这三个保守模块在图15中突出显示。在与pfamPfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQIDNo4)对比时，有可能鉴定出三个保守区，⑶Sx模块、GANDY模块和HTP模块(进一步详情可见W004/064987)。实施例10基因克隆和表达载体的构建使用CorynebacteriumefficiensDSM44549、褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafiisca)DSM43792和除虫链霉菌(Str印tomycesavermitilis)DSM46492来分离与S.thermosacchariL131的半乳糖脂酶基因同源的基因。符合DSM编号的菌株保藏于德国微生物和细胞培养物保藏机构(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)并可公开获得。使用大肠杆菌菌株XL-BlueMRF'、BL21(DE3)(Novagen)和S17-1(SimonR.等，1983)、枯草杆菌BD170、浅青紫链霉菌菌株1326(JohnLinesCentre)、谷氨酸棒杆菌DSM20300作为异源表达的宿主。还使用杀鲑气单胞菌菌株DSM12609作为表达宿主。我们实验室从自然环境中分离到了S.thermosacchariL131、弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)P3—42禾口超压肠杆菌(Enterobacternimipressuralis)P1—60并通过16SrRNA基因测序进行了分类学鉴定。此项研究中使用以下培养基。使用LB(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/lNaCl,pH7.0)、2xYT(10g/lNaCl、10g/l酵母提取物、16g/l胰蛋白胨)来培养大肠杆菌和其它革兰氏阴性细菌。使用营养肉汤(3g/l牛肉提取物、5g/l蛋白胨，pH7.0)来培养Cefficiens和N.aromaticivorans,使用YM肉汤(3g/l酵母提取物、3g/l麦芽提取物、5g/1蛋白胨、10g/l右旋糖，pH7.0)来培养除虫链霉菌，培养基65(4g/l葡萄糖、4g/l胰蛋白胨、10g/l麦芽提取物、2g/lCaC03,pH7.2)用于褐色喜热裂孢菌。DNA分离。通过标准碱裂解流程结合Qiagen柱纯化方法来分离质粒。从链霉菌中制备性分离质粒DNA是一个例外。在该情况中，使用CsCl梯度平衡离心作为最终的纯化步骤。用于将DNA导入微生物菌株的方法。通过电穿孔使用1mm电击杯和以下电穿孔参数设置来转化大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株1800V，25°F。200ill枯草杆菌BD170通过基于天然感受态(naturalcompetence)的“巴黎”法来转化(HarwoodC.R.和CuttingS.M.，1990)。浅青紫链霉菌通过原生质体法来转化(KieserT.等，2000)。利用Harayama等(1980)的滤器交配(filtermating)法通过与大肠杆菌的接合而将DNA导入杀鲑气单胞菌。杀鲑气单胞菌的利福平抗性突变体的构建。将来自杀鲑气单胞菌DSM12609过夜培养物的约108个细胞置于含5_30mg/l利福平的一系列LB琼脂板上。使用SpectroLinkerXL-1500设备(SpectronicsCorp.美国)用短波紫外线照射平板。照射剂量为4-6J/M2。将平板于30°C保温2天。挑选在30mg/l利福平上生长的几个克隆并在50mg/l利福平上进行额外的测试。选出了耐受50mg/l利福平的一个克隆(命名为R1)进行后续工作。用于L131半乳糖脂酶同源物的大肠杆菌表达载体的构建。通过PCR，利用染色体DNA作为模板并利用两种寡核苷酸引物oSAL_5(GGGAATTCCATATGAGACGTTCCCGAATTACG)和oSAL-3(GCATGGATCCGGTGACCTGTGCGACGG)，扩增除虫链霉菌的脂肪酶基因。对于褐色喜热裂孢菌和Corynebacteriumefficiens脂肪酶基因的扩增，所用寡核苷酸引物分别是oTFL-5(GGGAATTCCATATGGGCAGCGGACCACGTG)和oTFL-3(GCATGGATCCGACACGCACGGCTCAACG)、oCEL_5(GGGAATTCCATATGAGGACAACGGTCATCG)和oCEL-3(GCATGGATCCGGCATCGGGCTCATCC)。用Ndel和BamHI消化PCR产物并与用相同限制性内切核酸酶消化的pETlla(Novagen，美国)连接。如下构建用于浅青紫链霉菌的L131半乳糖脂酶表达载体。质粒pUC18(L131RX)含有携带L131脂肪酶基因的原始克隆DNA片段(pBK(L131))的1.37kbEcoRI-Xbal片段，用EcoRI消化该质粒并与用EcoRI消化的pIJ487(Kieser等，2000)连接。该连接导致形成了pIJ487和pUC18(L131RX)相对取向不同的两种重组质粒。为了后续工作，根据限制性分析选择其中PUC18的lac启动子位于pIJ487的无启动子ne0K基因侧翼的变体。该构建物命名为PRX487-5(图11)。除了氨苄青霉素抗性，该质粒还赋予大肠杆菌对至少3mg/l卡那霉素的抗性。用0.1-10ygPRX487-5转化浅青紫链霉菌1326的原生质体，使之带有硫链丝菌素(1.2mg/l)和卡那霉素(5mg/l)抗性。根据D⑶G-番红指示板测定法的判断，这些转化子生成活性半乳糖脂酶。将转化子置于添加有5mg/ml卡那霉素的SM板(Kieser等，2000)上，并使之形成孢子。将得到的孢子用于接种摇瓶和发酵罐培养物。用于谷氨酸棒杆菌的表达载体的构建。用于此项工作的所有表达载体都是基于质粒pCB5的，该质粒是携带质粒pSRl(Yoshihama等，1985)的谷氨酸棒杆菌复制子和大肠杆菌的ColEl复制子的穿梭载体。51该载体中所使用的启动子衍生自编码谷氨酸棒杆菌主要分泌蛋白-PS1的copl基因。酶由它们的天然基因来表达，包括未修饰的信号肽，如褐色喜热裂孢菌(图14)。发酵条件产脂肪酶的链霉菌属菌株的发酵。在摇瓶中，在含有(每升)10g蛋白胨、5g酵母提取物、2gK2HP0dP10g葡萄糖(pH7.0)并添加合适抗生素的培养基中培养产脂肪酶的重组浅青紫链霉菌菌株使用浓度硫链丝菌素为1.2mg/l、卡那霉素为20mg/l、氯霉素为1.5mg/l而红霉素为1.5mg/l。使用通过在SM板上培养转化子而产生的孢子悬浮液来起动培养。对于补料-分批发酵，使用BraimBiostatE发酵罐(10升)。初始培养基(7升)含有(每升)蛋白胨20g、酵母提取物10g、葡萄糖20g和上述合适的抗生素(除了硫链丝菌素，其不用于10升培养)。以30°C、恒定的10升/分钟通气量和600rpm搅拌速率进行培养。如前面段落中所述，在2升爱伦美氏(Erlenmeyer)烧瓶中培养接种体(每次发酵2x250ml)。发酵以分批模式进行18-20小时，然后将含30%葡萄糖和12.5%蛋白胨的溶液以0.5ml/分钟的速率投入发酵罐培养物中。每天两次无菌采集培养物样品(30ml)。重组谷氨酸棒杆菌菌株的发酵。在含50mg/l卡那霉素的LB中以30°C和200rpm摇动速率培养谷氨酸棒杆菌的摇瓶培养物。重组杀鲑气单胞菌菌株的发酵。在摇瓶中，在添加了链霉素和卡那霉素(为20mg/l)的2xYT培养基中培养重组杀鲑气单胞菌菌株。为了诱导tac启动子，向生长培养基中加入IPTG(l-5mM)或乳糖(1-10%)。以发酵罐规模测试用于在杀鲑气单胞菌中生产重组酰基转移酶的两组条件。在第一个实验中，初始培养基(7升)是添加有2%葡萄糖、50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素的2xYT，而补料溶液(3升)含有25%葡萄糖、10%胰蛋白胨和5%酵母提取物、100mg/l卡那霉素和链霉素。以10升/分钟通气量、600rpm搅拌速率和28°C进行培养。用25%NH3和10%磷酸将PH调至7.5。用0.5升杀鲑气单胞菌过夜培养物接种发酵罐，并以分批模式培养24小时。在该时间点，加入IPTG至5mM并以50ml/h的速率开始补料。在第二个实验中，修改初始培养基，即用乳糖代替葡萄糖。补料溶液为2升20%乳糖。发酵温度提高至30°C，并将培养基的pH降至7.0。如第一个实验进行接种，并在初始培养基中培养20小时后开始补料(100ml/h)。酶测定法番红板筛选方法。在番红板筛选中，底层含有培养基+添加剂，1.5%琼脂糖和0.002%番红(0.2%储存水溶液，无菌过滤)，而顶层为0.7%琼脂糖、1%D⑶G和0.002%番红。半乳糖脂酶活性的测定(糖脂酶活性测定法(GLU-7))底物将0.6%二半乳糖苷甘油二酯(SigmaD4651),0.4%Triton-X100(SigmaX-100)和5mMCaCl2溶于pH7的0.05MHEPES缓冲液。测定流程52将400uL底物加到1.5mLEppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37°C放置5分钟。在时间t=0分钟时，加入50yL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37°C以lOxlOOrpm混合10分钟。在时间t=10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99°C放置10分钟，以终止反应。使用WAK0GmbH的NEFAC试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH7的酶活性GLU。磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性测定法(PLU-7))底物将0.6%L-a磷脂酰胆碱，95%植物(Avanti#441601)、0.4%Triton-X100(SigmaX-100)和5mMCaCl2散布于pH7的0.05MHEPES缓冲液。测定流程将400uL底物加到1.5mLEppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37°C放置5分钟。在时间t=0分钟时，加入50yL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37°C以lOxlOOrpm混合10分钟。在时间t=10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99°C放置10分钟，以终止反应。使用WAK0GmbH的NEFAC试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH7的酶活性PLU-7。使用棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)进行的分光光度测定法。通过在30°C进行的分光光度测定法测量脂肪酶活性，其中以pNPP作为底物并使用含0.4%TritonX-100和0.阿拉伯树胶的50mMTris-马来酸盐缓冲液(pH6.5)。在二噁烷中制备底物储存液(100mM)。通过将酶加入反应混合物中来开始动力学测量。为了评估初始水解活性，用Spectramax读板仪每20秒测定410nm处吸收的增加达20分钟。一个单位的脂肪酶活性定义为每分钟释放出lymol对硝基酚的酶量。通过使用ImM每种底物，以相同方式测量了对其它P-NP酯的活性(AbramicM.等，1999)。pH和温度对脂肪酶活性的影响的测定。为了测定pH对酶活性的影响，通过半乳糖脂酶活性测定法对pH2-10的范围进行了测量，只是实验中所用的缓冲液如下pH2-3.5的甘氨酸-HC1；pH4-5的NaOAc；pH5.5-7.5的Tris-马来酸盐；pH7.5-9的Tris-HCl；pH10的CAPS。通过将酶的等分试样在冰上保温60分钟后在各种温度(22°C-90°C)保温20分钟，来测定温度对半乳糖脂酶稳定性的影响。通过半乳糖脂酶活性测定法来分析剩余活性。为了检测对半乳糖脂酶活性的最佳温度，在所需温度(范围为20°C-70°C)平衡常用的测定混合物，并加入2或4yl酶开始反应。通过半乳糖脂酶活性测定法来分析活性，但使用较短的时间(20分钟)。实施例11生物多样性研究中的半乳糖脂酶候选物的表征。StreptomycesthermosacchariL131半乳糖脂酶序列提供了在计算机上鉴定新的家族II半乳糖脂酶的可能性。可鉴定出链霉菌属L131半乳糖脂酶的许多其它有用同源物，例如来自褐色喜热裂孢菌的“推测的蛋白质”(ZP_00058717)和来自Corynebacteriumefficiens的“推测的蛋白质”(NP_738716)。53我们克隆并表达了链霉菌属L131半乳糖脂酶的3种同源物除虫链霉菌(SAL)、褐色喜热裂孢菌(TFL)、和Corynebacteriumefficiens(CEL)的基因。利用pET表达系统在大肠杆菌中表达所有基因。首先利用含番红的D⑶G-指示板来分析重组大肠杆菌菌株，发现除虫链霉菌、褐色喜热裂孢菌和C.efficiens的酶具有半乳糖脂酶活性。进一步检验显示半乳糖脂酶活性的酶。研究了那些半乳糖脂酶候选物的底物特异性(图13)。测试了候选酶针对DGDG、卵磷脂、橄榄油、丁酸硝基苯酯、癸酸硝基苯酯(NP-D)和棕榈酸硝基苯酯的活性。发现酶具有非常不同的底物特异性图谱。在使用NP-D作为底物的测定法中测试了酰基转移酶活性，并用NEFA试剂盒量化释放出的硝基酚和游离脂肪酸。初步数据提示，至少来自褐色喜热裂孢菌的酶具有针对甘油和葡萄糖的转移酶活性。测试了半乳糖脂酶候选物的热稳定性。发现Corynebacteriumefficiens的酶是对热最稳定的，而除虫链霉菌的酶是对热最敏感的。实施例12:StreptomycesthermosacchariL131的脱胶试验在粗制大豆油中测试来自Sti^ptomycesthermosacchariL131的磷脂酶。材料和方法K371将在浅青紫链霉菌中表达的Str印tomycesthermosacchariL131酶在淀粉上冷冻干燥。(活性108PLU_7/g)。LecitaseUltra(#3108)，来自Novozymes，丹麦胆固醇酯Fluka26950植物甾醇Generol122N，来自Henkel，德国粗制大豆油来自TheSolaeCompany,Aarhus，丹麦卵磷脂L_a磷脂酰胆碱，95%植物(Avanti#441601)磷脂酶活性磷脂酶测定法与实施例10中所用的相同。HPTLC进样仪自动TLC取样器4，CAMAGHPTLC板:20x10cm,Merckno.1.05641。使用前在160°C活化30分钟。加样利用自动TLC进样仪将1μ1含8%油的缓冲液溶液加进HPTLC板。运行缓冲液4:75254的氯仿甲醇水运行缓冲液5:70301的P-醚(P-ether)甲基-叔丁基酮醋酸加样/洗脱时间运行缓冲液4:20分钟运行缓冲液5:10分钟TLC显影将平板在烤炉中于160°C干燥10分钟，冷却，并浸入含6%乙酸铜的16%Η3Ρ04。于160°C另外干燥10分钟，并直接进行评估。脱胶实验将Str印tomycesthermosacchariL131(K371)以表4所示配方用于脱胶研究。将样品于40°C放置18小时并摇动，然后采集样品进行HPTLC分析，将样品溶于21的氯仿甲醇。表4.粗制大豆油用Sti^ptomycesthermosacchariL131禾口LecitaseUltra脱胶<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>HPTLC分析结果如图16和图17所示。图16显示了根据表4的粗制大豆油样品的酶处理反应产物的TLC板(缓冲液4)。作为参照，还分析了磷脂酰胆碱(PC)。也显示了磷脂酰乙醇胺(PE)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)。图16中的TLC结果清楚显示了磷脂酰胆碱完全被加入油中的Sti^ptomycesthermosacchariL131去除了。只有最低剂量(泳道2)未能完全水解磷脂。在有5%的水(泳道6)时，LecitaseUltra也水解油中的磷脂，但不添加额外的水(泳道5)则只有部分磷脂水解。图17显示了根据表4的粗制大豆油样品的酶处理反应产物的TLC(缓冲液5)。胆固醇酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯和植物留醇作为参照。也显示了游离脂肪酸(FFA)。图17所示的结果显示了磷脂的水解与游离脂肪酸的形成一致。结论。上述结果确证了，Sti^ptomycesthermosacchariL131有效水解粗制大豆油中的磷脂，并是对植物油脱胶的合适的可选的酶。将以上说明书中提及的所有文献引入本文作为参考。对本领域技术人员而言，在不背离本发明范围和精神的情况下，本发明所述的方法和系统的各种修改和变化将是显而易见的。尽管本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述，但是应当理解，所要求的发明不应过度局限于这些具体的实施方案。实际上，对于生化和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图包括在所附权利要求书的范围内。参考文献AbramicΜ.,LescicI.,KoricaT.,VitaleL.,SaengerW.,PigacJ.PurificationandpropertiesofextracellularlipasefromStreptomycesrimosus.EnzymeandMicrobialTechnology25,522-529(1999)HarayamaS.,MasatakaΤ.,linoT.High-frequencymobilisationofthechromosomeofEscherichiacolibyamutantofplasmidRP4temperaturesensitiveformaintenance.Mol.Gen.Genet.180,47-56(1980)。HarwoodC.R.andCuttingS.Μ.MolecularbiologicalmethodsforBacillus.JohnWiley&SonsLtd.,WestSussex,England(1990)KieserT.，BibbM.J.，ButtnerM.J.，ChaterK.F.，HopwoodD.A.PracticalStreptomycesgenetics.TheJohnInnesFoundation,Crowes,Norwich,England(2000)VujaklijaD.，SchroderW.，AbramicΜ.，ZouP.，LescicL，FrankeP.，PigacJ.Anovelstreptomycetelipase:cloning，sequencingandhigh-levelexpressionoftheStreptomycesrimosusGDS(L)-lipasegene.Arch.Microbiol.178,124-130(2002)YoshihamaM，HigashiroK，RaoEA,AkedoM，ShanabruchWG,FollettieMT,WalkerGC,SinskeyAJ.CloningvectorsystemforCorynebacteriumglutamicum.JBacteriol.162(2):591_597(1985)布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>保藏证明由本页底部所指明的国际保藏单位根据细则<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。BP/4表(只此一页)布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。3用打叉表示选定。BP/9表(第1页)<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。BP/9表(第2页且最后一页)布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格贼人的名称和地址:保藏证明DaniscoIntellectualAssetsDanise。A/S由本页底部所指明的国际保藏单位根据细则Langebrogade1.ι对初始保藏物出具DK-1001Copenhagen丹麦I.微生物的鉴定_保藏人给出的鉴定名称由国际保藏单位给出的登记号码链霉素属菌林NCIMB41227L131II.科学描述和/或建议的分类学名称_上述项I所说明的微生物被给出的□科学描述Kl建议的分类学名称(用打叉表示选定)_III.收到和接受_本国际保藏单位于2004年6月23日(即初始保藏日)1收到并接受上述项I所说明的微生物_IV.收到转移请求_本国际保藏单位于_(即初始保藏日)接受了上述项I所说明的微生物，并且接受了于(即收到转换请求的日期)将该原始保藏转为根据布达佩斯条约的保藏的请求_IV.国际保藏单位_名称NCIMBLtd.能代表国际保藏单位或被授权的官员的人的签名地址23StMacharDriveAberdeenAB243RY日期2004年6月28日Scotland,UK1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。BP/4表(只此一页)布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。3用打叉表示选定。BP/9表(第1页)<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>权利要求制备溶血糖脂的方法，所述方法包括用至少一种脂肪分解酶处理含糖脂的底物来产生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从棒杆菌属得到。2.制备溶血磷脂的方法，所述方法包括用至少一种脂肪分解酶处理含磷脂的底物来产生所述溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从棒杆菌属得到。3.植物或食用油的酶促脱胶方法，所述方法包括用可从棒杆菌属得到的能水解极性脂质主要部分的脂肪分解酶处理所述食用或植物油。4.生物转化极性脂质以制造高价值产品的方法，所述方法包括用可从棒杆菌属得到的脂肪分解酶处理所述极性脂质来产生所述高价值产品，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质。5.根据权利要求4的方法，其中所述高价值产品是以下一种或多种碳水化合物酯、蛋白质酯、蛋白质亚基酯和羟酸酯。6.制备食品的方法，所述方法包括将至少一种脂肪分解酶与食品的一种或多种成分混合，其中所述脂肪分解酶能水解存在于至少一种所述成分中的糖脂和/或磷脂或能水解作为至少一种所述成分的糖脂和/或磷脂，且其中所述脂肪分解酶可从棒杆菌属得到。7.根据权利要求1-6之任何一项的方法，其中所述脂肪分解酶能将酰基从糖脂转移至一种或多种酰基受体底物。8.根据权利要求1-6之任何一项的方法，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列，或包含SEQIDNo.9所示的核苷酸序列或与其具有至少70%同一性的核苷酸序列。9.根据权利要求8的方法，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。10.根据权利要求6的方法，其中所述食品选自以下一种或多种蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面团产品，叠层面团产品，液态奶蛋糊，松饼，油炸圈饼，饼干，薄脆饼干和曲奇饼；糖果，包括巧克力，糖果，饴糖，halawa，胶皮糖，包括无糖和加糖胶皮糖，泡泡糖，软泡泡糖，口香糖和布丁；冷冻产品，包括冰糕，优选冷冻乳制品，包括冰激凌和牛奶冻；乳制品，包括奶酪，黄油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳饮料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括经加工的肉制品；食用油和脂肪，搅打起泡和不起泡的产品，水包油乳状液，油包水乳状液，人造黄油，起酥油和涂抹食品，包括低脂肪的和极低脂肪的涂抹物；调味品，蛋黄酱，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的汤，饮料，香料乳状液和沙司。11.根据权利要求10的方法，其中所述食品是焙烤品，且至少一种所述成分是生面团。12.根据权利要求10的方法，其中所述食品是蛋或基于蛋的产品。13.根据权利要求10的方法，其中所述食品是乳制品。14.脂肪分解酶在用于制备溶血糖脂的底物中的应用，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从棒杆菌属得到。15.脂肪分解酶在用于制备溶血磷脂的底物中的应用，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从棒杆菌属得到。16.可从棒杆菌属得到的脂肪分解酶用于植物或食用油的酶促脱胶从而水解极性脂质主要部分的应用。17.可从棒杆菌属得到的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用。18.脂肪分解酶在生物转化极性脂质以制造高价值产品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质，且其中所述脂肪分解酶可从棒杆菌属得到。19.根据权利要求18的应用，其中所述高价值产品是以下一种或多种碳水化合物酯、蛋白质酯、蛋白质亚基酯和羟酸酯。20.可从棒杆菌属得到的脂肪分解酶在制备食品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂和/或磷脂。21.根据权利要求14至20之任何一项的应用，其中所述脂肪分解酶能将酰基从糖脂转移至一种或多种酰基受体底物。22.根据权利要求14至21之任何一项的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列，或包含SEQIDNo.9所示的核苷酸序列或与其具有至少70%同一性的核苷酸序列。23.根据权利要求22的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或与其具有至少70%同一性的氨基酸序列。24.根据权利要求14的应用，其中所述溶血糖脂是DGMG或MGMG。25.根据权利要求20的应用，其中所述食品是乳制品。26.根据权利要求25的应用，其中所述食品是蛋或基于蛋的产品，且其中所述脂肪分解酶能将酰基转移至一种或多种酰基受体底物以降低一种或多种以下有害效应臭味和/或异味和/或油腻口味。27.根据权利要求20的应用，其中所述食品是焙烤品。28.根据权利要求14的应用，其中所述底物是食用油。全文摘要本发明涉及可从棒杆菌属(Corynebacterium)得到的脂肪分解酶在各种方法和用途中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂或磷脂或者将酰基从糖脂或磷脂转移至酰基受体。优选地，应用于这些方法和用途中的脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，或包含SEQIDNo.9所示的核苷酸序列或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列。文档编号A21D2/26GK101818177SQ20101015111公开日2010年9月1日申请日期2005年7月18日优先权日2004年7月16日发明者乔恩·B·索,乔恩·D·米凯尔森,安德雷·米亚斯尼科夫,弗夫·皮特卡南,米拉·波夫莱南申请人:丹尼斯科公司