包含脂肪分解酶变体的组合物和方法

包含脂肪分解酶变体的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供脂肪分解酶变体。具体地讲，本发明提供与亲本脂肪分解酶相比具有一个或者多个修饰从而具有至少一种改进的性质的脂肪分解酶变体。另外，本发明提供包含本发明的脂肪分解酶变体的组合物。本发明还提供使用包含本发明的脂肪分解酶变体的组合物进行清洁的方法。
【专利说明】包含脂肪分解酶变体的组合物和方法
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求2011年8月31日提交的美国临时申请N0.61/529，811的权益，该临时申请以引用方式并入本文。
【背景技术】
[0003]包括脂肪酶和角质酶在内的脂肪分解酶已被应用于洗涤清洁组合物中以去除油性污溃。脂肪分解酶发挥作用的一个机制是将甘油三酯水解而产生脂肪酸。然而，清洁组合物中存在的表面活性剂和其它组分常常会抑制这些酶，干扰其除去油溃的能力。因此，对于可在清洁组合物的苛刻环境中起作用的脂肪分解酶存在需求。

【发明内容】

[0004]本发明提供改进的脂肪分解酶，尤其是可用于洗涤剂组合物的脂肪分解酶。具体地讲，本发明提供与亲本脂肪分解酶相比具有一个或者多个修饰(如置换)的脂肪分解酶变体。这可通过以如下方式对该酶作出改进来实现:改进洗涤性能、该酶在洗涤剂组合物中的稳定性、该酶的热稳定性、底物水解、表达和/或修饰的电荷/疏水性状况，这些方面可改进该酶在洗涤循环中的有效性。本发明提供特别适合于并可用于多种清洁应用的变体脂肪分解酶，包括但不限于变体脂肪酶脂肪分解酶。本发明还提供使用本发明的脂肪分解酶变体进行清洁的方法。
[0005]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在该脂肪分解酶变体的高产位置(productiveposition)处，其中在该高产位置处测试的修饰中的至少75%满足以下标准中的至少一项:
a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ;b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ;c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ;并且其中该高产位置选自 1、9、13、18、19、23、25、26、28、32、33、46、47、48、61、64、89、90、92、105、113、114、157、183、204、234、245、246、249和253，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO:4中所示的褐色嗜热裂孢菌 (Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0006]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在该脂肪分解酶变体的高产位置处，其中在该高产位置处测试的修饰中的至少40%但小于75%满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ；b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ;并且其中该高产位置选自3、12、24、
30、35、49、60、63、65、72、73、87、95、98、108、109、110、112、117、121、122、131、142、151、163、165、174、175、177、182、187、194、195、212、213、232、238、248 和 256，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0007]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在该脂肪分解酶变体的高产位置处，其中在该高产位置处测试的修饰中的至少15%但小于40%满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ；b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂 稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ;并且其中该高产位置选自4、5、11、
14、17、21、22、31、43、50、53、57、62、68、74、78、82、83、85、88、101、102、106、107、116、124、126、136、138、141、149、152、153、158、178、190、197、202、207、209、216、219 和 250，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0008]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在该脂肪分解酶变体的高产位置处，其中在该高产位置处测试的修饰中的至少一个修饰但小于15%满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ；b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ;并且其中该高产位置选自2、27、41、42、44、45、51、54、56、58、66、67、75、79、81、86、91、96、104、111、120、125、127、135、144、156、159、160、162、171、172、181、184、186、188、205、210、211、217、221、222、223、230、236、237、239、247、251、252和254，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0009]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在该脂肪分解酶变体的高产位置处，其中该脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ;b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指 数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5。在一个实施例中，本发明满足全部标准，并且修饰选自A001D、A001M、Y004N、N009D、N009L、N009M、N009Q、N009Y、A013F、A013Q、A013Y、S018E、S018H、S023A、S023E、S023Q、S025A、S025C、S025D、S025E、S025N、E026A、E026C、E026F、E026H、E0261、E026K、E026M、E026Q, E026R、E026S、E026T、E026V、E026W, E026Y、N0281、N028K、N028P、N028Q、N028T、N028Y、S030D、L032A、L032E、L032Q、S033Q、S035E、S0351、S035Q、S035V、Y043R、R046D、R0461、R046N、R046Q、R046T、S057C、Y060C、T061D、T061M、T061P、G062A、T063C、E064A、E064K、E064Q、E064R、A065G、A065K、A065Y、E072H、R073L、R073Y、T083V、D085E、1087L、T088D、T088E、T089A、T089C、T089D、T089E、T089G、T089L、T089P、T089V、L090E、L090Q、L090S、L090T、Q092D、Q092E、Q092G、Q092H、Q092N、Q092S、Q092Y、S095D、S095E、S095Q、N101E、N105A、N105D、N105E、N105G、N105M、N105Q、N105S、M107L、I108L、I108Y、N109T、R110H、S113C、S113D、S113E、S113H、S113P、T114D、T114E、S117Q、A125S、V126A、M131A、M131F、M131L、T136A、T136V、S141E、P151A、P151C、P1511、P151L、P151S、P151V、L1521、T153C、T153L、H156D、L157A、L157C、L157H、L1571、L157K、L157N、L157Q、L157S、L157T、L157W、L157Y、N158E、N160D、D174A、D174C、D174E、D174G、D174H、D174K、D174M、D174Q、D174R、D174S、D174T、D174V、L175C、L175D、L175E、L175G、L175N、L175Q、T177D、I178L、A182D、A182E、T183D、T183E、T183H、T183Q、T183S、H184Y、P187A、P187E、P187M、P187V、F188M、N190E、S194D、S194E、S197A、E202V、D204A、D204C、D204E、D204F、D204G、D204H、D2041、D204K、D204L、D204M、D204N、D204P、D204Q、D204R、D204S、D204T、D204V、D204W、T207D、T207G、F209C、F209E、A210T、N2121、N212L、N212M、N212T、N212V、 I213C、 I213E、 I213F、 I213H、 I213K、 I213Q、 I213R、 I213S、 I213Y、 G219A、 N232C、N232M、T234H、R245V、D246A、D246C、D246H、D246P、D246T、L2481、F249G、F249K、F249N、F249P、G250P、E253A、E253C、E253F、E253G、E253H、E2531、E253K、E253L、E253N、E253Q、E253R、E253S、E253T、E253V、E253W、E253Y、R256I 和 R256L，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。在一个实施例中，本发明满足a)和b)但不满足C)，并且修饰选自 A001E、A001F、A001G、A001H、A001K、A001L、A001N、A001R、A001S、A001T、A001V、A001W、A001Y、Y004F、E005A、E005L、N009A、N009E、N009H、N009S、N009T、N009V、TOlIN、D012A、D012H、A013C、A013D、A013E、A013K、A013L、A013M、A013S、A013T、L014F、L0141、L014M、A017G、A017K、A017M、A017Q、A017S、S018A、S018G、S0181、S018N、S018Q、S018R、S018V、S018W、S019A、S019C、S019F、S019H、S019K、S019L、S019M、S019N、S019R、S019T、S019V、S019W、P021L、F022Y、S023C、S023D、S023F、S023G、S023H、S0231、S023K、S023L、S023M、S023P、S023T、S023Y、V024F、V0241、V024L、V024M、V024T、V024W、V024Y、S025G、S025K、S025L、S025M、S025Q、S025R、S025T、S025V、E026G、E026L、E026N、N028A、N028E、N028F、N028G、N028H、N028L、N028M、N028S、N028V、N028W、S030A、S030E、S030N、S030P、S030T、R031K、L032G、L032H、L0321、L032K、L032M、L032N、L032R、L032S、L032T、L032Y、S033A、S033D、S033H、S033K、S033M、S033N、S033V、S035D、S035H、S035L、S035N、S035R、S035Y、T041K、Y044F、R046A、R046E、R046K、R046L、R046S、R046V、E047D、N048A、N048C、N048D、N048E、N048G、N048H、N0481、N048K、N048L、N048M、N048P、N048Q、N048R、N048Y、N049A、N049D、N049G、N049M、N049Q、T050L、Y051F、A053G、S057A、S057V、Y060L、Y060V、T061A、T061G、T061S、T061Y、G062T、T063D、T063H、T063K、T063N、E064M、E064V、E064W、E064Y、A065N、A065Q、A065R、A065S、S066D、S066T、1067L、A068Q、E072A、E072L、E072M、E072Q、E072S、1074V、1082F、1082M、T083C、D085N、1087C、1087M、T088N、T088S、T089H、T0891、T089K、T089N、T089Q、T089S、L090A、L090F、L090M、L090W、L090Y、Q092A、Q092L、E098Q、N101A、N101D、N101Q、A102H、L104V、N105H、H106W、I108C、I108T、I108V、N109E、N109F、N109H、N109K、N109M、N109S、N109Y、RllOA、R110C、R110E、R110F、R110G、R110L、R110M、R110N、R110Q、R110S、A111T、S113A、S113F、S113G、S113K、S113L、S113N、S113Q、S113T、S113V、S113Y、T114A、T114C、T114H、T1141、T114K、T114M、T114N、T114Q、T114R、T114S、T114V、R116S、S117D、S117E、S117G、S1171、S121A、S122G、S122H、S122K、S122N、R138E、R138Q、S141Q、Q142E、Q1421、Q142L、Q142M、P144K、P151G、L152M、L157F、L157M、L157R、L157V、N158H、N160E、S162E、S163E、S163N、S163T、T165K、T165M、T165Q、T165R、T165Y、I171F、G172A、L175A、L175H、L175S、T177K、T177R、T177V、V181P、A182H、A182N、A182Q、A182S、T183A、T1831、T183K、T183R、T183Y、H184F、K186R、P187K、P187Q、P187T、S195D、S195E、S195H、S195N、S195T、E202G、E2021、E202L、E202Q、G205Q、T207N、F209W、N212A、N212Y、I213L、I213M、G219Q、Y221F、S222C、S222T、V230Q、N232D、N232G、N232K、N232L、T234A、T234D、T234E、T2341、T234Q、`T234S、T237N、T237S、R245A、R245C、R245E、R245G、R245H、R245K、R245L、R245M、R245Q、R245S、R245T、D246G、D2461、D246K、D246Q、D246S、D246V、G247K、L248A、L248D、L248E、L248K、L248M、L248Q、L248S、F249C、F249H、F249L、F249M、F249Q、F249R、F249S、F249T、F249V、F249Y、E251G、V2521、E254C、R256C、R256D、R256E、R256H、R256M、R256Q、R256T、R256V 和 R256W，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。在一个实施例中，本发明满足a)，或者满足b)和c)两项，但不满足全部三项，并且修饰选自 A001C、A001P、A001Q、Y004W、E005W、N009C、N009F、N009G、N0091、D012V、A013H、A0131、S018F、S018M、S018P、S018T、S019G、S0191、S019Q、S019Y、S023R、S023V、V024K、S025F、S0251、L032D、L032V、S033E、S033F、S0331、S033L、S033R、S035A、S035M、Y043W、R046C、R046F、R046H、R046M、E047C、E047H、N048S、N048V、N048W、N049C、T050Q、V0541、T061H、T0611、T061V、T063S、E064G、E0641、E064L、E064N、A065C、A065L、A065M、1067V、A068H、A068K、A068T、E072K、E072N、R073F、T0831、1087Y、T089M、T089W、L090K、L090V、Q092K、Q092M、Q092T、S095C、E098D、E098T、N101W、A102C、N105Y、M107V、I108Q、R110K、R110T、S113W、T114P、S117A、S117C、S117M、S117N、S117P、S117T、S121G、S121K、S121N、S121P、S121R、S121T、S122A、S122C、S122D、S122E、S122R、S122T、M127S、R138T、Q142R、Q142V、A149C、P151T、L157E、L157P、N158V、S163D、S163M、T165L、T165V、D174N、L175K、T177H、T177Q、T177Y、I178V、V181T、T183C、T183F、T183M、T183N、P187L、P187S、S194M、S194Q、S194T、S195C、S195W、S197E、S197K、E202C、G205N、P211V、N212C、I213A 、I217T、G219T、N232A、N232E、N232F、N232H、N232Y、T234K、T234L、T234N、T234R、T234V、Q238E、Q238P、Q238R、F239Y、D246E、D246M、D246R、D246W、L248C、L248P、L248V、F249W、G250K、G250R、E253M、E254K和R256K，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。在一个实施例中，本发明满足b)但不满足a)或者C)，并且修饰选自 N002A、N002L、P003A、P003E、P003G、P003H、P0031、P003K、P003L、P003M、P003Q、P003S、P003T、P003V、T011H、D012E、D012S、A013G、A013P、L014Y、S018L、S019E、F022E、F022M、V024C、V024Q、E026P、N028C、N028D、L032F、L032P、S033Y、T041R、1042V、Y043K、E047F、E047L、E047M、E047P、E047S、E047V、E047W、N049E、N049F、N049L、N049Y、T050E、T050V、Y060G、Y060M、G062Q、G062S、T063A、T063G、E064T、A065D、A065E、A065H、A065T、E072D、E072V、E072W、D085C、1087E、T088G、T089Y、L090R、Q092V, N101S、N1051、N105K、N105L、N105R、H106F、I108M、I108N、N109R、S112G、S112P、S112T、T114F、T114G、T114Y、R1161、R116K、R116T、R116V、S117H、D120L、S122L、S122Q、S122V、S122Y、L124A、L124M、L124P、M127V、G135A、T136S、R138A、S141A、Q142D、Q142K、Q142N、S163A、S163G、T165H、I171V、T177M、T177N、A182C、K186L、P1871、N190H、N190Y、S194C、S197Y、F209D、F209N、N212S、I217V、V223T、V230A、T234G、T234M、T234Y、Y236F、Q238C、Q238D、Q238G、Q238M、Q238S、R245N、R245P、D246Y、G247R、L248R、F249A、F249E 和 R256N，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。在一个实施例中，本发明满足c)但不满足a)或者b)，并且修饰选自 N009W、D0121、D012L、A013R、A017N、S018Y、P021D、P021T、P021Y、F022H、F022K、S023N、V024N、S025H、S025Y、E027N、S030C、S030K、R031Q、R031V、S033C、S035C、S035W、1042Q、P045A、P045T、R046P、R046Y、E047Q、A053L、A053V、1056M、S057T、P058G、Y060A、Y060F、Y060S、Y060W、T061C、T061K、T061L、T061N、T061Q、T061R、T061W、G062D、T063E、T063P、E064H、E064S、E072F、E072G、E072R、R0731、R073T、R073V、R073W、1074A、1074C、1074G、1074T、A075S、G078A、G078S、F079G、V081G、1082G、1082K、1082Q、T083M、T083N、D085G、T086G、T086N、1087Q、1087S、1087T、1087W、T088C、L090C、L090D、L090G、L090H、L090N、D091E、D091Y、Q092C、Q092P、S095A、S095L、S095V、S095Y、R096Y、A102Y、N105C、N105F、N105V、N105W、M107S、I108K、I108P、N109Q、R110Y、S112F、S1121、S112L、S112W、S112Y、S113M、V126T、M131G、M1311、M131S、M131V、T136C、R138D、R138M、Q142A、A1491、T153N、L157D、L157G、N158C、N158D、N1581、N158W、K159T、S163C、T177C、T177E、T177S、I178F、I178Y、A182G、A182Y、T183L、P187C、N190S、S195F、S195Q, S195Y、D204Y、A210S、K216N、K216Q、K216Y、G219L、N232R、N232W、R2451、L248F、F249D、G250S、G250T、E251Q、E253D和E253P，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0010]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性或者电荷表面修饰位置，其中该具有有利的表面修饰位置的脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、PH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ;
b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ;c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5，并且该残基位置选自 1、4、9、12、18、19、23、25、26、28、32、35、64、88、89、95、107、110、113、114、117、136、141、157、162、163、174、182、187、195、197、202、204、213、219 和 246，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0011]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修`饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性修饰位置，其中该具有有利的表面修饰位置的脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ；b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5，并且该残基位置选自1、4、
9、12、18、19、23、25、26、28、32、35、64、88、89、95、107、110、113、114、117、136、141、157、162、163、174、182、187、195、197、202、204、213、219和246，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0012]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的电荷表面修饰位置，其中该具有有利的表面修饰位置的脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ；b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5，并且该残基位置选自1、
9、12、18、19、23、26、28、32、35、88、110、113、114、117、136、141、162、163、174、202、204、213和246，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0013]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性或者电荷表面修饰位置，其中该具有有利的表面修饰位置的脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、PH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ;c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5，并且其中该修饰选自 A001E、A001V、Y004F、N009D、D012H、S018A、S018T、S018V、S018W、S019C、S019H、S019K、S019L、S019M、S019R、S023A、S023E、S025A、S025G、E026F、E0261、E026K、E026L、E026M、E026R、E026V、E026Y、N028H、N028K、N028Q、N028S、N028V、L032A、L032H、L032K、L032N、L032S、L032T、S035D、S035E、E064Q、T088N、T088S、T0891、T089L、T089M、T089V、S095Q、M107V、R110A、S113F、S113P、T114Q、S117D、S117E、S117M、T136A、S141E、L157M、L157T、L157Y、S162E、S163D、D174A、D174K、D174Q、D174S、A182H、A182N、P187V、S195N、S195T、S197A、E202V、D204K、D204R、I213F、G219A 和 D246E，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0014]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性修饰位置，其中该具有有利的表面修饰位置的脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、PH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ；b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5，并且其中该修饰选自 A001E、A001V、Y004F、N009D、D012H、S018A、S018T、S018V、S018W、S019C、S019H、S019K、S019L、S019M、S023A、S025A、S025G、E026F、E0261、E026K、E026L、E026M、E026R、E026V、E026Y、N028H、N028Q、N028S、N028V、L032A、L032H、L032K、L032N、L032S、L032T、S035D、S035E、E064Q、T088N、T088S、T0891、T089L、T089M、T089V、S095Q、M107V、RlIOA、S113F、S113P、T114Q、S117D、S117E、S117M、T136A、S141E、L157M、L157T、L157Y、S162E、S163D、D174A、D174K、D174Q、D174S、A182H、A182N、P187V、S195N、S195T、S197A、E202V、D204R、I213F、G219A和D246E，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0015]在一个实施例中，本发明是一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中该修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的电荷表面修饰位置，其中该具有有利的表面修饰位置的脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项:a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、PH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其 中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ；b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5，并且其中该修饰选自 A001E、N009D、D012H、S018A、S018T、S018V、S018W、S019K、S019R、S023A、S023E、E026K、E026R、N028H、N028K、N028Q、N028S、N028V、L032K、S035D、S035E、T088N、T088S、Rl 10A、S113F、S113P、T114Q、S117D、S117E、T136A、S141E、S162E、S163D、D174K、E202V、D204K、D204R、I213F和D246E，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0016]在一个实施例中，本发明是一种包含至少一种以上所列的脂肪分解酶变体的清洁组合物。在一些实施例中，本发明还包括选自以下的另外的酶:另外的脂肪酶、角质酶、蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、氧化还原酶、还原酶、氧化酶(例如漆酶)、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶。
[0017]在一个实施例中，本发明是一种清洁方法，该方法包括使表面或者物品与包含至少一种以上所列的脂肪分解酶变体的清洁组合物接触。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1显示pBN-TfuIII质粒的图谱。
[0019]图2A-G显示TfuLip2与同源序列的比对。
[0020]图3显示为TfuLip2创建的系统树。
【具体实施方式】
[0021]本发明提供改进的脂肪分解酶，尤其是可用于洗涤剂组合物的脂肪分解酶。具体地讲，本发明提供与亲本脂肪分解酶相比具有一个或者多个修饰(如置换)的脂肪分解酶变体。这可通过以如下方式对该酶作出改进来实现:改进洗涤性能、该酶在洗涤剂组合物中的稳定性、该酶的热稳定性和/或改进的底物水解、和/或电荷/疏水性状况，这些方面可改进该酶在洗涤循环中的有效性。本发明提供特别适合于并可用于多种清洁应用的变体脂肪分解酶，包括但不限于变体脂肪酶脂肪分解酶。本发明包括包含至少一种本文所提出的变体脂肪分解酶(例如变体脂肪酶)的组合物。一些此类组合物包括洗涤剂组合物。本发明提供嗜热裂孢菌属(Thermobifida species)变体脂肪分解酶和包含一种或者多种此类变体脂肪酶的组合物。本发明的脂肪分解酶变体可与其他可用于洗涤剂组合物的酶进行组合。本发明还提供与已知的脂肪分解酶(如已知的脂肪酶脂肪分解酶)相比具有相当的或者改进的洗涤性能的酶组合物。本发明还提供使用本发明的脂肪分解酶变体进行清洁的方法。
[0022]本发明包括脂肪分解酶的酶变体，其较之亲本脂肪分解酶具有一个或者多个修饰。所述酶变体因在洗涤性能、底物水解、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性方面具有最低性能指数，同时这些特性中的至少一项较之亲本脂肪分解酶得到改进，从而可用于洗涤剂组合物中。
[0023]另外，本发明提供在脂肪分解酶的一个或者多个氨基酸位置处的、可用于洗涤剂组合物的修饰(如置换)，其中有利的修饰导致在洗涤性能、底物水解、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性方面的最低性能指数，同时这些特性中的至少一项较之亲本脂肪分解酶得到改进。这些修饰被认为是本发明的合适修饰。这些氨基酸位置可被认为是可用于对亲本脂肪分解酶作出组合修饰的有用位置。被发现是有用位置的脂肪分解酶氨基酸位置，可通过作出多个适用于洗涤剂组合物的修饰来进一步进行表征。对于每个位置，可能的合适修饰数目越大，则表示特定位置的高产性(productivity)越高。
[0024]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。本文中只描述了一些方法和材料，不过与本文描述的方法和材料相似或等同的多种方法和材料均可用于本发明的实施。相应地，接下来定义的术语通过整体参照本说明书来更完整地描述。藉此将本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都明确以引用的方式并入本文。
[0025]另外，如本文 所用，除非上下文明确指明，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5’至3’取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
[0026]在本说明书通篇中给出的每一个上限值意在包括每一个下限值，就如同此类下限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个下限值将包括每一个上限值，就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
[0027]“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的多聚序列。在本文中，术语“蛋白质”与“多肽”可互换使用。本说明书通篇中使用遵照国际纯化学及应用化学联合会-国际生物化学联合会的生物化学命名委员会(IUPAC-1UB Joint Commission on BiochemicalNomenclature, JCBN))所定义的氨基酸的单字母和三字母代码。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。突变可按以下方式命名:亲本氨基酸的单字母代码，后跟一个数字，然后是变体氨基酸的单字母代码。例如，将位置87处的甘氨酸(G)突变成丝氨酸(S)可表示为“G087S”或者“G87S”。多个突变可通过在各突变之间插入
来表示。例如，位置87或者90处的突变可表示为“G087S-A090Y”或者“G87S-A90Y”或者“G87S+A90Y” 或者 “G087S+A090Y”。
[0028]术语“衍生自”和“得自”不仅指由所考虑的生物菌株所产生或可产生的脂肪分解酶，还指由从此类菌株分离的DNA序列所编码的以及在包含此类DNA序列的宿主生物中所产生的脂肪分解酶。另外，该术语指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列所编码的、并且具有所考虑的脂肪分解酶的鉴别特性的脂肪分解酶。举例说，“衍生自嗜热裂孢菌属(Thermobifida)的脂肪分解酶”指那些由嗜热裂孢菌属所天然产生的具有脂肪分解活性的酶，以及指与嗜热裂孢菌属源所产生的那些脂肪分解酶相似、但通过使用遗传工程技术由转化了编码脂肪分解酶的核酸的非嗜热裂孢菌属生物体所产生的脂肪分解酶。
[0029]如本文所用，“同源性”指序列相似性或同一性，优选同一性。同源性可以使用本领域已知的标准技术测定(参见例如Smith和Waterman, Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)，2:482(1981) ;Needleman 和 Wunsch，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，48:443 (1970)；Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (《美国国家科学院院刊》)，85:2444(1988)；软件程序，如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ；以及 Devereux 等人，Nucl.Acid Res.(《核酸研究》)，12:387-395(1984))。可用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法(参见Feng和Doolittle, J.Mol.Evol.(《分子进化杂志》),35:351-360(1987))的简化版本。该方法与Higgins和Sharp描述的方法(参见Higgins和Sharp, CABIOS (《计算机在生物科学中的应用》)，5:151-153(1989))类似。可用的PILEUP参数包括:默认空位权重=3.00，默认空位长度权重=0.10,以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子是Altschul等人描述的BLAST算法(参见 Altschul 等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，215:403-410 (1990)；以及 Karlin和 Altschul’Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (《美国国家科学院院刊》)，90:5873-5787 (1993))。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见Altschul等人，Meth.Enzymol.(《酶学方法》)，266:460-480 (1996))。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，大部分参数设定为默认值。可调参数设定为如下值:重叠跨度(overlap span) =1,重叠分数(overlap fraction) =0.125,字串阈值(word threshold) (T)=ll。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序自身根据特定序列的组成和被用来搜索所关注的序列的特定数据库的组成来确定。然而，可以调整所述值来增加灵敏度。
[0030]参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分数可由本领域技术人员容易地测定。多核苷酸或多肽序列共有的同一性百分数通过分子之间序列信息的直接比较测定，所述比较通过进行序列比对并使用本领域已知的方法确定同一性来进行。适用于确定序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，215:403-410 (1990))。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高打分序列对(high scoring sequencepair, HSP)，该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在如下情况会停止:累积比对分数从最大获得值下降达数量X ;累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值是字长(W)为11、BL0SUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (《美国国家科学院院刊》)，89:10915 (1992))，比对数(B)为 50，期望值(E)为10，M’ 5，N’ -4，以及对两条链的比较。
[0031]BLAST算法然后对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul,出处同上)。 BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sumprobability，P(N))，其指示两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在试验核酸与脂肪分解酶核酸的比较中最小合计概率低于约0.1、更优选低于约0.01、最优选低于约0.001，则该核酸被认为与本发明的脂肪分解酶核酸相似。在试验核酸编码脂肪分解酶多肽的情况中，如果比较得到低于约0.5、更优选低于约0.2的最小合计概率，则其被认为与指定的脂肪分解酶核酸相似。
[0032]在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中，“相同”或“同一性”百分数是指，当比较和比对以达到最大相似性时，两条或更多条序列是相同的或分别具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基，如使用序列比较算法或通过目测所确定的。主题氨基酸序列与参照(即查询)氨基酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性％”或“序列同一性％”或“氨基酸序列同一性％意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题氨基酸序列与查询氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸计)达指定的百分数。因此，就两条氨基酸序列而言，80%氨基酸序列同一性或80%同一性意指两条最佳比对的氨基酸序列中80%氨基酸残基是相同的。
[0033]主题核酸序列与参考(即查询)核酸序列的”序列同一性百分数“或”同一性％ “或”序列同一性％ “或”核苷酸序列同一性％意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题核酸序列与查询序列相同(即以多核苷酸序列的核苷酸比核苷酸计)达指定的百分数。因此，就两条核酸序列而言，80%核苷酸序列同一性或80%同一性意指两条最佳比对的核酸序列中80%核苷酸残基是相同的。
[0034]“最佳比对”或“最佳比对的”指两条(或更多条)序列的给出最高同一性百分比分数的比对。例如，可通过将两条蛋白质序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同氨基酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。可通过将两条核酸序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同核苷酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。
[0035]在一些实施例中，当用限定的参数，例如限定的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分来比对两条多肽序列，以实现该对序列可能的最高相似性分数时，这两条多肽序列被认为是“最佳比对的”。在多肽序列比对算法(如BLASTP)中，BL0SUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，出处同上)通常用作默认的打分置换矩阵。施加空位存在罚分以在被比对的序列之一者中引入单个氨基酸空位，并为该空位中的每一个残基位置施加空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是:BL0SUM62打分矩阵，空位存在罚分=11，空位延伸罚分=1。比对分数由每条序列的该比对开始和结束的氨基酸位置(如比对窗口)，以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的插入来限定，以实现可能的最高相似性分数。
[0036]两条或更多条序列之间的最佳比对可通过目测手动来确定，或通过使用计算机，例如但不限于如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)确定(参见例如 Altschul 等人，Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)，25 (17): 3389-3402 (1997);另参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))网站)。
[0037]如果所关注的多肽包含与亲本多肽的氨基酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的序列同一性的氨基酸序列，则可称所关注的多肽与亲本多肽“基本上相同”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两个多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中，这两条多肽是实质上相同的。
[0038]如果所关注的核酸包含与亲本核酸的核苷酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约 95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的序列同一性的核苷酸序列，则可称所关注的核酸与亲本核酸“基本上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列实质上相同的一个指示是这两条核酸分子在严格条件(例如，在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。[0039]当核酸或多核苷酸从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。相似地，当多肽、蛋白质或肽从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔浓度计，在组合物中，分离的物质的丰度比其他物质更高。例如，分离的物质可以占所有存在的大分子物质的至少约50%、约70%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%(以摩尔浓度计)。优选地，将所关注的物质纯化为基本上均一的(即通过常规检测方法在组合物中检测不到污染物)。纯度和均一性可以使用本领域熟知的多种技术测定，例如对蛋白质或核酸样品进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在染色后进行目测观察。如果需要，可采用高分辨率技术，如高效液相色谱法(HPLC)或类似的方法来纯化该材料。
[0040]应用于核酸或多肽的术语“纯化的” 一般表示核酸或多肽基本上不含其他组分，如本领域熟知的分析技术所测定的(如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经密度梯度离心的介质中形成离散的条带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽的纯度为至少约50%，通常纯度为至少约75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99%、约99.5%、约99.6%、约99.7%、约99.8%或更大(例如以摩尔浓度计的重量％)。在相关的意义上，本发明提供对组合物富集一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽或多核苷酸的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。基本上纯的本发明的多肽或多核苷酸(例如，分别为基本上纯的本发明变体脂肪分解酶或编码本发明变体脂肪分解酶的多核苷酸)通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度计)的至少约55%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98、约 99%、约 99.5% 或更高。
[0041]在本文中，给定氨基酸序列中氨基酸残基的位置通常利用SEQ ID N0:4中所示褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶Tfulip2氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置的编号方式进行编号。SEQ ID N0:4的褐色嗜热裂孢菌脂肪酶Tfulip2氨基酸序列因此充当参比亲本序列。可利用本文所述的比对算法将给定氨基酸序列(例如本文描述的变体脂肪分解酶氨基酸序列)与Tfulip2序`列(SEQ ID NO:4)比对，该给定氨基酸序列中与Tfulip2序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的氨基酸残基可通过参照该脂肪酶Tfulip2序列中的对应氨基酸残基便利地进行编号。
[0042]本发明的脂肪分解酶
[0043]本文所用的脂肪分解酶包括展现出降解脂质的能力(如降解甘油三酸酯或磷脂的能力)的酶、多肽或蛋白质。脂肪分解酶可为例如脂肪酶、磷脂酶、酯酶或角质酶。脂肪分解酶可以是具有α/β水解酶折叠的脂肪分解酶。这些酶通常具有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸残基的催化三联体。α/β水解酶包括脂肪酶和角质酶。角质酶显示出极少的(如果有的话)界面活化，而脂肪酶往往在脂质-水界面的存在下发生构象变化(Longhi和Cambillau，(1999),Biochimica et Biophysica Acta(《生物化学与生物物理学学报》)，1441:185-96)。脂肪分解酶的活性片段是脂肪分解酶的保持降解脂质的能力的部分。活性片段保持该催化三联体。本文所用的脂肪分解活性可按照本领域知道的任何程序来测定(参见例如Gupta等人，Biotechnol.Appl.Biochem.(《生物技术与应用生物化学》),37:63-71，2003 ;美国专利 N0.5，990，069 ；以及国际专利公布 N0.W096/18729A1 )。
[0044]在一些实施例中，本发明的脂肪分解酶是α/β水解酶。在一些实施例中，本发明的脂肪分解酶是脂肪酶。在一些实施例中，本发明的脂肪分解酶是角质酶。
[0045]脂肪分解酶的高产位置
[0046]本发明提供脂肪分解酶中的可用于洗涤剂组合物的氨基酸位置，其中有利的修饰导致在洗涤性能、底物水解、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性方面的最低性能指数，同时这些特性中的至少一项较之亲本脂肪分解酶得到改进。这些修饰被认为是本发明的合适的修饰。
[0047]可将本发明的脂肪分解酶的稳定性与标准品例如SEQ ID Ν0:4的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶Tfulip2的稳定性进行比较。
[0048]术语“热的稳定性”和“热稳定度”是指本发明的这样的脂肪酶，其在本文所公开的脂肪分解、水解、清洁或其它处理期间(例如当暴露于改变的温度时)常见的条件下暴露于确定的温度达指定的时间段后，保留指定量的酶活性。变化的温度包括增加或降低的温度。在一些实施例中，脂肪酶在暴露于改变的温度达指定时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保留至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的脂肪分解活性。
[0049]本文所用的变体脂肪分解酶的改进的性质，包括相对于相应的亲本脂肪分解酶(例如野生型或者天然存在的脂肪分解酶)而言具有改进的或增强的洗涤或清洁性能、和/或改进的或增强的稳定性并任选保持着洗涤或清洁性能的变体脂肪分解酶。变体脂肪分解酶的改进的性质，可包括改进的洗涤或清洁性能和/或改进的稳定性和/或改进的底物水解和/或改进的表达。在一些实施例中，本发明提供表现出以下性质中的一项或多项的本发明变体脂肪分解酶:相对于参比亲本脂肪分解酶(例如野生型脂肪分解酶如野生型脂肪酶)而言，改进的手动洗涤性能、改进的手动或手工盘碟洗涤性能、改进的自动盘碟洗涤性能、改进的洗衣性能、和/或改进的稳定性。
[0050]被发现是有用位置的脂肪分解酶氨基酸位置，可具有不同的适用于洗涤剂组合物的修饰。修饰可包括在特定位置处的插入、缺失或者置换。在一个实施例中，修饰是置换。对于每个位置，可能的合适修饰数目越大，则导致该位置的高产性分数越高。例如，氨基酸位置可具有在高产位置处测试的修饰中至少75%、40%或15%为合适的修饰，其中该修饰满足以下适宜性标准中的至少一项:
[0051]a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、PH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ;
[0052]b)这样的位置， 其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、PH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PI)大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ;或者
[0053]c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、PH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5。[0054]本发明的具有所测试的修饰中至少75%为合适修饰的脂肪分解酶位置包括位置1、9、13、18、19、23、25、26、28、32、33、46、47、48、61、64、89、90、92、105、113、114、157、183、204、234、245、246、249和253，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0055]本发明的具有所测试的修饰中至少40%但小于75%为合适修饰的脂肪分解酶位置包括位置 3、12、24、30、35、49、60、63、65、72、73、87、95、98、108、109、110、112、117、121、122、131、142、151、163、165、174、175、177、182、187、194、195、212、213、232、238、248 和256，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0056]本发明的具有所测试的修饰中至少15%但小于40%为合适修饰的脂肪分解酶位置包括位置 4、5、11、14、17、21、22、31、43、50、53、57、62、68、74、78、82、83、85、88、101、102、106、107、116、124、126、136、138、141、149、152、153、158、178、190、197、202、207、209、216、219和250，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0057]本发明的具有所测试的修饰中至少一个修饰但小于15%为合适修饰的脂肪分解酶位置包括位置 2、27、41、42、44、45、51、54、56、58、66、67、75、79、81、86、91、96、104、111、120、125、127、135、144、156、159、160、162、171、172、181、184、186、188、205、210、211、217、221、222、223、230、236、237、239、247、251、252和254，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0058]这些氨基酸位置可被认为是可用于对亲本脂肪分解酶作出组合修饰的有用位置。因此，本发明包括在任何上述位置处具有一个或者多个修饰的脂肪分解酶。
[0059]脂肪分解酶的合适修饰
[0060]本发明包括脂肪分解酶的酶变体，其较之亲本脂肪分解酶具有一个或者多个修饰。所述酶变体因在洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性方面具有最低性能指数，同时这些特性中的至少一项较之亲本脂肪分解酶得到改进，从而可用于洗涤剂组合物中。
[0061]本发明的满足全部三项适宜性标准的脂肪分解酶修饰包括A001D、A001M、Y004N、N009D、N009L、N009M、N009Q、N009Y、A013F、A013Q、A013Y、S018E、S018H、S023A、S023E、S023Q、S025A、S025C、S025D、S025E、S025N、E026A、E026C、E026F、E026H、E0261、E026K、E026M、E026Q, E026R、E026S、E026T、E026V、E026W, E026Y、N0281、N028K、N028P、N028Q,N028T、N028Y、S030D、L032A、L032E、L032Q、S033Q、S035E、S0351、S035Q、S035V、Y043R、R046D、R0461、R046N、R046Q、R046T、S057C、Y060C、T061D、T061M、T061P、G062A、T063C、E064A、E064K、E064Q、E064R、A065G、A065K、A065Y、E072H、R073L、R073Y、T083V、D085E、1087L、T088D、T088E、T0 89A、T089C、T089D、T089E、T089G、T089L、T089P、T089V、L090E、L090Q、L090S、L090T、Q092D、Q092E、Q092G、Q092H、Q092N、Q092S、Q092Y、S095D、S095E、S095Q、N101E、N105A、N105D、N105E、N105G、N105M、N105Q、N105S、M107L、I108L、I108Y、N109T、R110H、S113C、S113D、S113E、S113H、S113P、T114D、T114E、S117Q、A125S、V126A、M131A、M131F、M131L、T136A、T136V、S141E、P151A、P151C、P1511、P151L、P151S、P151V、L1521、T153C、T153L、H156D、L157A、L157C、L157H、L1571、L157K、L157N、L157Q、L157S、L157T、L157W、L157Y、N158E、N160D、D174A、D174C、D174E、D174G、D174H、D174K、D174M、D174Q、D174R、D174S、D174T、D174V、L175C、L175D、L175E、L175G、L175N、L175Q、T177D、I178L、A182D、A182E、T183D、T183E、T183H、T183Q、T183S、H184Y、P187A、P187E、P187M、P187V、F188M、N190E、S194D、S194E、S197A、E202V、D204A、D204C、D204E、D204F、D204G、D204H、D2041、D204K、D204L、D204M、D204N、D204P、D204Q、D204R、D204S、D204T、D204V、D204W、T207D、T207G、F209C、F209E、A210T、N2121、N212L、N212M、N212T、N212V、I213C、I213E、I213F、I213H、I213K、I213Q、I213R、I213S、I213Y、G219A、N232C、N232M、T234H、R245V、D246A、D246C、D246H、D246P、D246T、L2481、F249G、F249K、F249N、F249P、G250P、E253A、E253C、E253F、E253G、E253H、E2531、E253K、E253L、E253N、E253Q、E253R、E253S、E253T、E253V、E253W、E253Y、R256I和R256L，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0062]本发明的满足适宜性标准中的a)和b)两项、但不满足c)的脂肪分解酶修饰包括 A001E、A001F、A001G、A001H、A001K、A001L、A001N、A001R、A001S、A001T、A001V、A001W、A001Y、Y004F、E005A、E005L、N009A、N009E、N009H、N009S、N009T、N009V、TOlIN、D012A、D012H、A013C、A013D、A013E、A013K、A013L、A013M、A013S、A013T、L014F、L0141、L014M、A017G、A017K、A017M、A017Q、A017S、S018A、S018G、S0181、S018N、S018Q、S018R、S018V、S018W、S019A、S019C、S019F、S019H、S019K、S019L、S019M、S019N、S019R、S019T、S019V、S019W、P021L、F022Y、S023C、S023D、S023F、S023G、S023H、S0231、S023K、S023L、S023M、S023P、S023T、S023Y、V024F、V0241、V024L、V024M、V024T、V024W、V024Y、S025G、S025K、S025L、S025M、S025Q、S025R、S025T、S025V、E026G、E026L、E026N、N028A、N028E、N028F、N028G、N028H、N028L、N028M、N028S、N028V、N028W、S030A、S030E、S030N、S030P、S030T、R031K、L032G、L032H、L0321、L032K、L032M、L032N、L032R、L032S、L032T、L032Y、S033A、S033D、S033H、S033K、S033M、S033N、S033V、S035D、S035H、S035L、S035N、S035R、S035Y、T041K、Y044F、R046A、R046E、R046K、R046L、R046S、R046V、E047D、N048A、N048C、N048D、N048E、N048G、N048H、N0481、N048K、N048L、N048M、N048P、N048Q、N048R、N048Y、N049A、N049D、N049G、N049M、N049Q、T050L、Y051F、A053G、S057A、S057V、Y060L、Y060V、T061A、T061G、T061S、T061Y、G062T、T063D、T063H、T063K、T063N、E064M、E064V、E064W、E064Y、A065N、A065Q、A065R、A065S、S066D、S066T、1067L、A068Q、E072A、E072L、E072M、E072Q、E072S、1074V、1082F、1082M、T083C、D085N、1087C、1087M、T088N、T088S、T089H、T0891、T089K、T089N、T089Q、T089S、L090A、L090F、L090M、L090W、L090Y、Q092A、Q092L、E098Q、N101A、N101D、N101Q、A102H、L104V、N105H、H106W、I108C、I108T、I108V、N109E、N109F、N109H、N109K、N109M、N109S、N109Y、RllOA、R110C、R110E、R110F、R110G、R110L、R110M、R110N、R110Q、R110S、A111T、S113A、S113F、S113G、S113K、S113L、S113N、S113Q、S113T、S113V、S113Y、T114A、T114C、T114H、T1141、T114K、T114M、T114N、T114Q、T114R、T114S、T114V、R116S、S117D、S117E、S117G、S1171、S121A、S122G、S122H、S122K、S122N、R138E、R138Q、S141Q、Q142E、Q1421、Q142L、Q142M、P144K、P151G、L152M、L157F、L157M、L157R、L157V、N158H、N160E、S162E、S163E、S163N、S163T、T165K、T165M、T165Q、T165R、T165Y、I171F、G172A、L175A、L175H、L175S、T177K、T177R、T177V、V181P、A182H、A182N、A182Q、A182S、T183A、T1831、T183K、T183R、T183Y、H184F、K186R、P187K、P187Q、P187T、S195D、S195E、S195H、S195N、S195T、E202G、E2021、E202L、E202Q、G205Q、T207N、F209W、N212A、N212Y、I213L、I213M、G219Q、Y221F、S222C、S222T、V230Q、N232D、N232G、N232K、N232L、T234A、T234D、T234E、T2341、T234Q、T234S、T237N、T237S、R245A、R245C、R245E、R245G、R245H、R245K、R245L、R245M、R245Q、R245S、R245T、D246G、D2461、D246K、D246Q、D246S、D246V、G247K、L248A、L248D、L248E、L248K、L248M、L248Q、L248S、F249C、F249H、F249L、F249M、F249Q、F249R、F249S、F249T、F249V、F249Y、E251G、V2521、E254C、R256C、R256D、R256E、R256H、R256M、R256Q、R256T、R256V和R256W，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0063]本发明的满足适宜性标准中的a)、或者满足b)和c)两项、但不满足全部三项适宜性标准的脂肪分解酶修饰包括 A001C、A001P、A001Q、Y004W、E005W、N009C、N009F、N009G、N0091、D012V、A013H、A0131、S018F、S018M、S018P、S018T、S019G、S0191、S019Q、S019Y、S023R、S023V、V024K、S025F、S0251、L032D、L032V、S033E、S033F、S0331、S033L、S033R、S035A、S035M、Y043W、R046C、R046F、R046H、R046M、E047C、E047H、N048S、N048V、N048W、N049C、T050Q、V0541、T061H、T0611、T061V、T063S、E064G、E0641、E064L、E064N、A065C、A065L、A065M、1067V、A068H、A068K、A068T、E072K、E072N、R073F、T0831、1087Y、T089M、T089W、L090K、L090V、Q092K、Q092M、Q092T、S095C、E098D、E098T、N101W、A102C、N105Y、M107V、I108Q、R110K、R110T、S113W、T114P、S117A、S117C、S117M、S117N、S117P、S117T、S121G、S121K、S121N、S121P、S121R、S121T、S122A、S122C、S122D、S122E、S122R、S122T、M127S、R138T、Q142R、Q142V、A149C、P151T、L157E、L157P、N158V、S163D、S163M、T165L、T165V、D174N、L175K、T177H、T177Q、T177Y、I178V、V181T、T183C、T183F、T183M、T183N、P187L、P187S、S194M、S194Q、S194T、S195C、S195W、S197E、S197K、E202C、G205N、P211V、N212C、I213A、I217T、G219T、N232A、N232E、N232F、N232H、N232Y、T234K、T234L、T234N、T234R、T234V、Q238E、Q238P、Q238R、F239Y、D246E、D246M、D246R、D246W、L248C、L248P、L248V、F249W、G250K、G250R、E253M、E254K和R256K，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢`菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0064]本发明的仅满足适合性标准中的b)的脂肪分解酶修饰包括N002A、N002L、P003A、P003E、P003G、P003H、P0031、P003K、P003L、P003M、P003Q、P003S、P003T、P003V、TOl 1H、D012E、D012S、A013G、A013P、L014Y、S018L、S019E、F022E、F022M、V024C、V024Q、E026P、N028C、N028D、L032F、L032P、S033Y、T041R、1042V、Y043K、E047F、E047L、E047M、E047P、E047S、E047V、E047W、N049E、N049F、N049L、N049Y、T050E、T050V、Y060G、Y060M、G062Q、G062S、T063A、T063G、E064T、A065D、A065E、A065H、A065T、E072D、E072V、E072W、D085C、1087E、T088G、T089Y、L090R、Q092V, N101S、N1051、N105K、N105L、N105R、H106F、I108M、I108N、N109R、S112G、S112P、S112T、T114F、T114G、T114Y、R1161、R116K、R116T、R116V、S117H、D120L、S122L、S122Q、S122V、S122Y、L124A、L124M、L124P、M127V、G135A、T136S、R138A、S141A、Q142D、Q142K、Q142N、S163A、S163G、T165H、I171V、T177M、T177N、A182C、K186L、P1871、N190H、N190Y、S194C、S197Y、F209D、F209N、N212S、I217V、V223T、V230A、T234G、T234M、T234Y、Y236F、Q238C、Q238D、Q238G、Q238M、Q238S、R245N、R245P、D246Y、G247R、L248R、F249A、F249E和R256N，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ IDN0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0065]本发明的仅满足适合性标准中的c)的脂肪分解酶修饰包括N009W、D0121、D012L、A013R、A017N、S018Y、P021D、P021T、P021Y、F022H、F022K、S023N、V024N、S025H、S025Y、E027N、S030C、S030K、R031Q、R031V、S033C、S035C、S035W、1042Q、P045A、P045T、R046P、R046Y、E047Q、A053L、A053V、1056M、S057T、P058G、Y060A、Y060F、Y060S、Y060W、T061C、T061K、T061L、T061N、T061Q、T061R、T061W、G062D、T063E、T063P、E064H、E064S、E072F、E072G、E072R、R0731、R073T、R073V、R073W、1074A、1074C、1074G、1074T、A075S、G078A、G078S、F079G、V081G、1082G、1082K、1082Q、T083M、T083N、D085G、T086G、T086N、1087Q、1087S、1087T、1087W、T088C、L090C、L090D、L090G、L090H、L090N、D091E、D091Y、Q092C、Q092P, S095A、S095L、S095V、S095Y、R096Y、A102Y、N105C、N105F、N105V、N105W、M107S、I108K、I108P、N109Q、R110Y、S112F、S1121、S112L、S112W、S112Y、S113M、V126T、M131G、M1311、M131S、M131V、T136C、R138D、R138M、Q142A、A1491、T153N、L157D、L157G、N158C、N158D、N1581、N158W、K159T、S163C、T177C、T177E、T177S、I178F、I178Y、A182G、A182Y、T183L、P187C、N190S、S195F、S195Q、S195Y、D204Y、A210S、K216N、K216Q、K216Y、G219L、N232R、N232W、R2451、L248F、F249D、G250S、G250T、E251Q、E253D 和 E253P，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0066]表面修饰
[0067]本发明包括脂肪分解酶的酶变体，其在暴露于表面的氨基酸处具有一个或者多个修饰。酶变体中的表面修饰因在洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性方面具有最低性能指数，同时这些特性中的至少一项较之亲本脂肪分解酶得到改进，从而可用于洗涤剂组合物中。在一些实施例中，表面修饰改变该位置处的氨基酸的疏水性和/或电荷。疏水性可使用本领域知道的技术进行测定，如White和Wimley描述的那些技术(White, S.H.和 ffimley, ff.C, (1999), Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(《生物物理学与生物分子结构年评》)，28:319 - 65。
[0068]本文所用的“表面性质”可用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。
[0069]本发明的具有至少一个表面修饰为合适修饰的脂肪分解酶位置包括位置1、4、9、12、18、19、23、25、26、28、32、35、64、72、89、110、113、117、121、122、141、157、162、163、174、175、194、202、204、212、213、246和253，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ IDN0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0070]本发明的具有至少一个表面修饰为合适修饰、其中改变为疏水性而非电荷的改变的脂肪分解酶位置包括位置4、18、25、32、89、157、175和212，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0071]本发明的具有至少一个表面修饰为合适修饰、其中改变为电荷而非疏水性的改变的脂肪分解酶位置包括位置204，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0072]本发明的具有至少一个表面修饰为合适修饰、其中改变为疏水性和/或电荷的改变的脂肪分解酶位置包括位置 1、9、12、19、23、26、28、35、64、72、110、113、117、121、122、141、162、163、174、194、202、213、246和253，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0073]满足适宜性标准中的a)、或者满足b)和c)两项、但不满足全部三项适宜性标准的本发明的脂肪分解酶修饰包括A001C、A001P、A001Q、Y004W、E005W、N009C、D012V、A0131、S018P、S018T、S0191、S019Q、S023R、S023V、V024K、S0251、L032V、S033E、S033F、S0331、S033L、S033R、S035A、Y043W、R046C、R046H、E047C、E047H、N048S、N048V、N048W、N049C、T050Q、V0541、T061H、T061V、E064G、E0641、E064L、E064N、A065C、A065L、1067V、A068H、A068K、A068T、E072K、R073F、T0831、1087Y、T089M、T089W、L090K、L090V、Q092K、Q092M、S095C、E098D、E098T、N101W、A102C、M107V、R110K、R110T、S113W、T114P、S117A、S117C、S117M、S117N、S117T、S121G、S121K、S121N、S121P、S121R、S121T、S122A、S122C、S122D、S122E、S122R、S122T、M127S、R138T、Q142R、Q142V、A149C、P151T、L157E、L157P、N158V、S163D、S163M、T165L、T165V、T177H、T177Q、T177Y、I178V、V181T、T183C、T183F、T183N、P187L、 P187S、S194M、S194Q、S194T、S195C、S197E、S197K、E202C、G205N、P211V、N212C、I217T、G219T、N232A、N232E、N232F、N232Y、T234K、T234R、T234V、Q238E、Q238P、Q238R、F239Y、D246E、D246M、D246R、D246W、L248C、L248P、L248V、F249W、G250K、G250R 和E254K，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0074]本发明的多肽
[0075]本发明提供新型多肽，这些多肽可统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的变体脂肪分解酶多肽，包括例如具有酶活性(例如脂肪分解活性)的变体脂肪分解酶多肽在内。在一些实施例中，本发明的多肽可用于清洁应用，并且可掺入到可在清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)的方法中使用的清洁组合物中。
[0076]在一些实施例中，脂肪分解酶变体可以是来自嗜热裂孢菌属(Thermobifida)的亲本脂肪分解酶的变体。在嗜热裂孢菌属中已发现了多种相互间具有高度同一性并且与如SEQ ID N0:4中所示的来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪分解酶(Tfulip2)具有高度同一性的脂肪分解酶。参见例如实例6中的表6.1。在其他实施例中，脂肪分解酶变体可以是来自表6.1中所列举的任何一个属的亲本脂肪分解酶的变体，包括疣抱菌属(Verrucosispora)、糖单抱菌属(Saccharomonospora)、链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、束丝放线菌属(Actinosynnema)、高_菌属(Kribbella)、高温单抱菌属(Thermomonospora)、奇异球菌属(Deinococcus)、动球菌属(Kineococcus)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、弗兰克氏菌属(Frankia)Jl^jfS菌属(Jonesia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、食酸菌属(Acidovorax)或者类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)在内。在各个实施例中，脂肪分解酶变体可以是来自表6.1中描述的任何物种的亲本脂肪分解酶的变体。
[0077]在一些实施例中，脂肪分解酶变体可以是与来自嗜热裂孢菌属的脂肪分解酶有50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或者100%同一性的变体。在各个实施例中，脂肪分解酶变体可以是与来自表6.1中的任何属的脂肪分解酶有50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或者100%同一性的变体。
[0078]在一个具体的实施例中，本发明是衍生自嗜热裂孢菌属的酶。在一个具体的实施例中，本发明是衍生自来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪分解酶的酶。
[0079]本发明描述涉及从褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)克隆的脂肪酶(TfuLip2)的组合物和方法。所述组合物和方法部分基于以下观察结果:克隆并表达的TfuLip2在存在洗涤剂组合物的情况下具有羧酸酯水解酶活性(作用于羧酸酯)。TfuLip2还在洗涤剂组合物中展示出优良的稳定性，甚至在存在脂肪分解酶的情况下也是如此。TfuLip2的这些特征使其非常适用于多种清洁应用，在这些应用中所述酶可在存在于洗涤剂组合物中的表面活性剂和其它组分的存在下水解脂质。
[0080]尽管TfuLip2显示出针对多种天然和合成底物的活性，但这种酶已显示出对C4-C16底物的偏好，对C8底物具有最高活性。这个特异性使得TfuLip2非常适合水解短链、中链和长链甘油三酯和进行涉及短链、中链和长链脂肪酸酯的酯交换反应。
[0081]在一个方面，本发明的组合物和方法提供变体TfuLip2多肽。亲本TfuLip2多肽从褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca) (GenBank登记号YP_288944)分离。该成熟TfuLip2多肽具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。类似地，实质上相同的TfuLip2多肽可存在于自然界中，例如存在于褐色嗜热裂孢菌(T.fusca)的其它菌株或分离株中。本发明组合物和方法涵盖这些和其它重组TfuLip2多肽。
[0082]在一些实施例中，本发明包括分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有脂肪分解活性的变体脂肪分解酶，该多肽包含与本文所提供的亲本脂肪分解酶具有至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%或100%序列同一性的多肽序列。
[0083]在一些实施例中，变体多肽是与所例示的TfuLip2多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性的变体，例如与SEQ ID N0:3或者4的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者甚至至少99%序列同源性。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)通过氨基酸序列比对来测定。
[0084]还提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的编码具有脂肪分解活性的变体脂肪酶的序列，所述变体脂肪分解酶(例如变体脂肪酶)包含与SEQ ID N0:4的氨基酸序列相差不超过50、不超过40、不超过30、不超过35、不超过25、不超过20、不超过19、不超过18、不超过17、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2或不超
过I个氨基酸残基的氨基酸序列，其中该变体脂肪酶的氨基酸位置是根据SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶Tfulip2的氨基酸序列中对应的氨基酸位置的编号方式进行编号，这是通过该变体脂肪分解酶氨基酸序列与褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶Tfulip2氨基酸序列的比对来确定的。
[0085]如上所述，本发明的变体脂肪分解酶多肽具有酶活性(如脂肪分解活性)并因而可用于清洁应用，包括但不限于用于清洁盘碟物品、餐具物品、织物和具有硬质表面的物品(如桌子、桌面、壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。包含一种或多种本发明的变体脂肪分解酶多肽的示例性清洁组合物在下文中进行描述。本发明的变体脂肪分解酶多肽的酶活性(如脂肪分解酶活性)可使用本领域普通技术人员熟知的程序容易地测定。下文给出的“实例”描述了评估酶活性、清洁性能、洗涤剂稳定性和/或热稳定性的方法。本发明的变体脂肪分解酶在移除污溃(例如脂质污溃)、清洁硬质表面或者清洁衣物、盘碟或餐具物品方面的性能，可用本领域所熟知的程序和/或通过使用“实例”中示出的程序容易地测定。
[0086]可对本发明的多肽进行多种改变，如一个或多个氨基酸的插入、缺失和/或置换(保守的或非保守的置换)，包括其中这类改变不会实质上变更该多肽的酶活性的情况。类似地，也可对本发明的核酸进行多种改变，如在一个或多个密码子中对一个或多个核酸进行一种或多种置换使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变异(如，核苷酸序列中的突变可导致氨基酸序列中的沉默突变，例如当所编码的氨基酸未因该核酸突变而变更时)或非沉默变异；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失；序列中一个或多个核酸(密码子)的一种或多种添加或插入；和/或序列中一个或多个核酸(密码子)的切除或一种或多种截短。与原始核酸序列所编码的变体脂肪分解酶相比，核酸序列中的许多此类变化可能不会实质上变更所得的编码的变体脂肪分解酶的酶活性。还可对本发明的核酸进行修饰以包括一个或多个使得能在表达系统(如细菌表达系统)中进行最优表达的密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同氨基酸。
[0087]在一些实施例中，本 发明提供这样一类多肽，其包括具有所需酶活性(例如脂肪分解酶活性或清洁性能活性)的变体脂肪分解酶多肽，所述变体脂肪分解酶多肽包含具有本文所述的氨基酸置换的序列并且还包含一个或多个另外的氨基酸置换，例如保守和非保守置换，其中该多肽表现出、维持或大致维持所需的酶活性(例如脂肪分解酶活性或脂肪酶活性，如该变体脂肪分解酶的清洁活性或性能所反映的)。根据本发明的氨基酸置换可包括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置换通常涉及将一功能类别的氨基酸残基中的成员替换为属于同一功能类别的残基(在计算功能同源性百分数时相同氨基酸残基被视为在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置换通常涉及用功能相似的氨基酸置换氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸是功能相似的，因而可充当彼此的保守氨基酸置换。天冬氨酸和谷氨酸可充当彼此的保守置换。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换。精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸可充当彼此的保守置换。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换。
[0088]可以设想其他的保守氨基酸置换组。例如，可通过相似的功能或化学结构或组成对氨基酸进行分组(如酸性、碱性、脂族、芳族、含硫氨基酸)。例如，脂族组可包括:甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有可视为彼此保守置换的氨基酸的其他组包括:芳族组:苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫组:甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);碱性组:精氨酸(R)、赖氨酸⑷、组氨酸⑶；酸性组:天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；非极性不带电荷的残基的组:半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P);亲水性不带电荷的残基的组:丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知的并在各种标准教科书中有描述。本文的多肽序列的列表，结合上文的置换组，提供了所有经保守置换的多肽序列的明确列表。
[0089]在上文描述的氨基酸残基类别中存在更保守的置换，其也可以是合适的或者其作为另一种选择可以是合适的。用于更保守的置换的保守组包括:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，例如，在一些实施例中，本发明提供分离的或重组的具有脂肪分解活性的变体脂肪分解酶多肽(例如变体脂肪酶)，所述变体脂肪分解酶多肽包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约99.5%序列同一性的氨基酸序列。本发明的变体脂肪分解酶中一个氨基酸保守置换另一个氨基酸预计不会显著变更该变体脂肪分解酶的酶活性或清洁性能活性。所得的脂肪分解酶的酶活性或清洁性能活性可容易地用标准测定法和本文所述的测定法进行测定。
[0090]本发明的多肽序列(例如本发明的变体脂肪分解酶)的保守置换变异包括用相同保守置换组的保守选择氨基酸来置换该多肽序列的少部分的，有时低于约25%、约20%、约15%、约14%、约13%、约12%、约11%、约10%、约9%、约8%、约7%或约6%的氨基酸，或该多肽序列的低于约5%、约4%、约3%、约2%或约1%的氨基酸。
[0091]本发明的 核酸 [0092]本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)，其可统称为“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”，其编码本发明的多肽。本发明的核酸(包括下文描述的全部核酸在内)可用于本发明多肽的重组生产(如表达)，通常是通过表达包含编码所关注的多肽或其片段的序列的质粒表达载体来进行。如上面所论述的，多肽包括变体脂肪分解酶多肽，包括具有酶活性(例如脂肪分解活性)的变体脂肪酶多肽在内，其可用于清洁应用和清洁组合物，以供清洁需要进行清洁的物品或表面(例如物品的表面)。
[0093]在一些实施例中，本发明提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码在以上题为“本发明的多肽”的章节中以及本文其他地方描述的任何本发明多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供分离、重组、实质上纯的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码上文和本文其他地方所述的任何本发明多肽中两种或更多种的组合的核苷酸序列。
[0094]还提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的包含编码具有脂肪分解活性的变体脂肪酶的多核苷酸序列的核酸，所述变体脂肪分解酶(例如变体脂肪酶)包含与SEQID NO:4的氨基酸序列相差不超过50、不超过40、不超过30、不超过35、不超过25、不超过20、不超过19、不超过18、不超过17、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2或不超过I个氨基酸残基的氨基酸序列，其中该变体脂肪酶的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶Tfulip2的氨基酸序列中对应的氨基酸位置的编号方式进行编号，这是通过该变体脂肪分解酶氨基酸序列与褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶Tfulip2氨基酸序列的比对来确定的。
[0095]本发明提供编码前面所描述的嗜热裂孢菌属脂肪酶的脂肪酶变体的核酸，其中该脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(T.fusca)脂肪酶Tfulip2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
[0096]本发明的核酸可通过使用任何合适的合成、操纵和/或分离技术或这些技术的组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可用标准的核酸合成技术，如本领域技术人员所熟知的固相合成技术来制备。还可通过本领域已知的任何合适的方法，包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage等人，Tetrahedron Letters (《四面体通讯》)，22:1859-69(1981));或者Matthes等人描述的方法(参见Matthes等人，EMBO J.(《欧洲分子生物学组织杂志》)，3:801-805 (1984)，这通常在自动合成方法中实施)进行化学合成，来促进(或者完成)本发明核酸的合成。本发明的核酸也可以通过使用自动DNA合成仪来产生。定制的核酸可从多个商业来源订购(如Midland Certified Reagent Company、GreatAmerican Gene Company>Operon Technologies Inc.和 DNA2.0)。其他合成核酸的技术和相关原理是本领域已知的(参见例如Itakura等人,Ann.Rev.Biochem.(《生物化学年评》)，53:323(1984);和 Itakura 等人，Science (《科学》)，198:1056 (1984))。
[0097]制备本发明的经修饰的变体脂肪分解酶的方法
[0098]多种适用于产生编码本发明变体脂肪分解酶的本发明经修饰的多核苷酸的方法是本领域已知的，包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。制备经修饰的多核苷酸和蛋白质(例如变体脂肪分解酶)的 方法包括DNA改组方法、基于基因的非同源重组的方法如ITCHY(参见Ostermeier等人，(《生物有机化学与医药化学》)，7:2139-44 (1999) )、SCRACHY (参见Lutz等人，98:11248-53(2001))、SHIPREC (参见Sieber等人，(《自然生物技术》)，19:456-60(2001))和 NRR (参见 Bittker 等人，(《自然生物技术》)，20:1024-9 (2001)；Bittker等人，101:7011-6(2004))以及依赖于使用寡核苷酸来插入随机的和定向的突变、缺失和/或插入的方法(参见Ness等人，(《自然生物技术》)，20:1251-5(2002) ；Coco等人，(《自然生物技术》)，20:1246-50 (2002) ;Zha等人，(《化学生物化学》)，4:34-9 (2003)；Glaser 等人，(《免疫性杂志》)，149:3903-13(1992))。
[0099]用于产生本发明的变体脂肪分解酶的载体、细胞和方法
[0100]本发明提供分离的或重组的包含至少一种本文所述的本发明多核苷酸(例如编码本文所述的本发明变体脂肪分解酶的多核苷酸)的载体；分离的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒；分离的、实质上纯的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的DNA构建体；分离的或重组的包含至少一种本发明的多核苷酸的细胞；包含细胞的细胞培养物，该细胞包含至少一种本发明的多核苷酸；包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的细胞培养物；和包含一种或多种此类载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或它们的任何组合或混合物的组合物。
[0101]在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的载体(如表达载体或DNA构建体)的重组细胞，所述载体包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸。一些这类重组细胞转化有或转染有所述至少一种载体。这类细胞通常称为宿主细胞。一些此类细胞包括细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞。本发明还提供包含至少一种本发明的变体脂肪分解酶的重组细胞(例如重组宿主细胞)。
[0102]在一些实施例中，本发明提供包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体或表达盒，其中编码本发明变体脂肪分解酶的本发明多核苷酸序列有效连接至为进行有效的基因表达所需的一个或额外的核酸区段(例如与编码本发明变体脂肪分解酶的本发明多核苷酸有效连接的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，如抗生素抗性基因，该抗性基因使得能通过在含有抗微生物剂的培养基中生长而对质粒感染的宿主细胞进行连续的培养维持。
[0103]表达载体可衍生自质粒或病毒DNA，或者在可供选择的实施方案中，含有这二者的元件。示例性的载体包括但不限于pXX、pC194、pJHlOU pE194、pHP13 (参见Harwood和Cutting (编辑)),Molecular Biological Methods for Bacillus (《芽抱杆菌的分子生物学方法》)第3章，John Wiley & Sons (约翰威立出版社)[1990];适于枯草芽孢杆菌的复制型质粒包括第92页列出的那些；另参见Perego, Integrational Vectors for GeneticManipulations in Bacillus subtilis (《用于在枯草芽孢杆菌中进行遗传操纵的整合载体》)，载于 Sonenshein 等人(编辑)，Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics (《枯草芽抱杆菌和其他革兰氏阳性细菌:生物化学、生理学和分子遗传学》)，美国微生物学学会，华盛顿哥伦比亚特区，[1993]，第 615-624 页)。
[0104]为了在细胞中表达和生产所关注的蛋白质(例如变体脂肪分解酶)，将至少一个包含至少一个拷贝、优选包含多个拷贝的编码所述经修饰脂肪分解酶的多核苷酸的表达载体在适于表达该脂肪分解酶的条件下转化进细胞中。在本发明的一些实施例中，将编码变体脂肪分解酶的多核苷酸序列(以及载体中包含的其他序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在其他实施例中，将包含编码变体脂肪分解酶的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核`酸元件以及整合进宿主细胞基因组中的输入核苷酸序列二者。本文所述的载体可用于产生本发明的变体脂肪分解酶。在一些实施例中，编码变体脂肪分解酶的多核苷酸构建体存在于整合型载体上，该整合型载体使得编码变体脂肪分解酶的多核苷酸能整合以及任选扩增进细菌染色体中。整合位点的例子是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本发明变体脂肪分解酶的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子对所选择的前体脂肪分解酶而言是野生型启动子。在一些其他实施方案中，启动子对于前体脂肪分解酶而言是异源的，但在宿主细胞中有功能。具体而言，适用于细菌宿主细胞中的启动子的例子包括但不限于例如amyE启动子、amyQ启动子、amyL启动子、pstS启动子、sacB启动子、pSPAC启动子、pAprE启动子、pVeg启动子、pHpall启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophiIus)产麦芽糖淀粉酶基因启动子、褐色嗜热裂孢菌(T.fusca) (BAN)淀粉酶基因启动子、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)碱性脂肪分解酶基因启动子、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)碱性脂肪分解酶基因启动子、短小芽孢杆菌(B.pumilis)木糖苷酶基因启动子、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis) cryIIIA启动子和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) α -淀粉酶基因启动子。另外的启动子包括但不限于Α4启动子以及噬菌体λ Pk或Plj启动子,和大肠杆菌lac、trp或tac启动子。[0105]本发明的变体脂肪分解酶可在任何合适的革兰氏阳性微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。例如，在一些实施例中，变体脂肪分解酶在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中产生。在一些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、埃希杆菌属(Escherichia sp.)或曲霉菌属(Aspergillus sp.)。在一些实施例中，变体脂肪分解酶由芽孢杆菌属宿主细胞产生。可用于产生本发明变体脂肪分解酶的芽孢杆菌属宿主细胞的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.1entus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.1entus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophiIus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、凝结芽抱杆菌(B.coagulans)、环状芽抱杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，使用枯草芽孢杆菌宿主细胞来产生变体脂肪分解酶。美国专利5，264，366和4, 760,025(RE34, 606)描述了各种可用于产生本发明变体脂肪分解酶的芽孢杆菌宿主菌株，但可以使用其他合适的菌株。 [0106]几种可用于产生本发明变体脂肪分解酶的工业细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌菌株，以及天然存在的菌株的变体和/或重组菌株。在一些实施方案中，宿主菌株是重组菌株，其中编码所关注的多肽的多核苷酸已引入该宿主中。在一些实施方案中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。已知有许多枯草芽孢杆菌菌株，包括但不限于例如1A6(ATCC39085)、168 (IAOl)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753 至 PB1758、PB3360、JH642、1A243 (ATCC39, 087)、ATCC21332、ATCC6051、MI113、DE100 (ATCC39, 094)、GX4931、PBT110 和 PEP211 菌株(参见例如 Hoch 等人，Genetics(《遗传学》)，73:215 - 228 [1973];另参见美国专利 N0.4，450，235h 和 4，302，544 以及 EP0134048，所述文献和专利每一者以引用方式并入本文。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域公知的(参见例如 Palva 等人,Gene (《基因》)，19:81-87 [1982] ；Fahnestock 和 Fischer,J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，165:796 - 804[1986];和 Wang 等人，Gene (《基因》)，69:39 - 47[1988])。
[0107]在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞是在如下基因中的至少一者中包括突变或缺失的芽孢杆菌:degU、degS、degR和degQ。优选地，突变在degU基因中，更优选地突变是degU (Hy) 32 (参见例如 Msadek 等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，172:824-834 [1990]；和Olmos等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)，253:562 - 567[1997])。一种合适的宿主菌株是携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，芽孢杆菌宿主包含在以下基因中的突变或者缺失:scoC4 (参见例如Caldwell等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，183:7329-7340 [2001] );spoIIE (参见例如 Arigoni 等人，Mol.Microbiol(《分子微生物学》)，31:1407-1415 [1999]);和/或oppA或者opp操纵子的其他基因(参见例如Perego等人，Mol.Microbiol.(《分子微生物学》)，5:173-185 [1991])。实际上，设想到opp操纵子中的任何导致与oppA基因中的突变相同的表型的突变将可用于本发明的改变的芽孢杆菌菌株的一些实施方案。在一些实施方案中，这些突变单独地出现，而在其他实施方案中，存在突变的组合。在一些实施例中，可用于产生本发明的变体脂肪分解酶的改变的芽孢杆菌宿主细胞菌株，是已在上述基因中的一者或多者中包含突变的芽孢杆菌宿主菌株。另外，可使用包含内源脂肪分解酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌宿主细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含5个脂肪分解酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含9个脂肪分解酶基因的缺失(参见例如美国专利申请公开N0.2005/0202535,将其以引用方式并入本文)。
[0108]使用本领域已知的任何合适的方法，用至少一条编码至少一种本发明变体脂肪分解酶的核酸转化宿主细胞。无论是将核酸整合进载体中还是在不存在质粒DNA的情况下使用核酸，通常将其引入微生物中，在一些实施方案中，优选引入大肠杆菌细胞或感受态芽孢杆菌细胞中。利用质粒DNA构建体或载体并且将此类质粒DNA构建体或载体转化进芽孢杆菌细胞或大肠杆菌细胞中来将核酸(如DNA)引入此类细胞中的方法是公知的。在一些实施方案中，随后从大肠杆菌细胞分离该质粒并且转化进芽孢杆菌细胞中。然而，使用例如大肠杆菌的中间微生物不是必需的，在一些实施方案中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌宿主中。
[0109]本领域的技术人员十分知道适于将本发明的核酸或多核苷酸引入芽孢杆菌细胞中的方法(例如参见Ferrari等人,“Genetics”(《遗传学》)，载于Harwood等人(编辑)，Bacillus (《芽孢杆菌》)，Plenum Publishing Corp.(普莱南出版公司)，[1989],第57-72 页；Saunders 等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，157:718-726 [1984] ;Hoch 等Α? J- Bacteriol.(《细菌学杂志》),93:1925-1937 [1967] ;Mann 等人,Current Microbiol.(《当前微生物学》)，13:131-135[1986] ；Holubova, Folia Microbiol.，30:97[1985] ；Chang等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)，168:11_115[1979] ;Vorobjeva等人，FEMS Microbiol.Lett.(《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》)，7:261-263 [1980]；Smith 等人，Appl.Env.Microbiol.(《应用环境微生物学》),51:634 [1986] ；Fisher 等人，Arch.Microbiol., 139:213-217 [1981]；以及 McDonald, J.Gen.Microbiol.(《普通微生物学杂志》)，130:203[1984])。实际上，诸如转化(包括原生质体转化和中板集合(congression)、转导和原生质体融合)之类的方法是公知的并且适用于本发明。使用转化方法将包含编码本发明变体脂肪分解酶的核酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。本领域已知的转化芽孢杆菌细胞的方法包括诸如质粒标志补救(marker rescue)转化之类的方法，质粒标志补救转化涉及携带部分同源的内生质粒(resident plasmid)的感受态细胞摄入供体质粒(参见Contente等人，Plasmid (《质粒》)，2:555-571 [1979] ；Haima等人，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与普通遗传学》)，223:185-191 [1990] ；ffeinrauch等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，154:1077-1087[1983]；以及 Weinrauch 等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，169:1205-1211 [1987])。在这个方法中，输入的供体质粒与内生的“辅助”质粒的同源区在模拟染色体转化的过程中发生重组。
[0110]除了通常使用的方法，在一些实施方案中，将宿主细胞直接用包含编码本发明变体脂肪分解酶的核酸的DNA构建体或载体转化(即，在引入宿主细胞之前，未使用中间细胞来扩增或者以别的方式处 理该DNA构建体或载体)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的那些在不插入质粒或载体中的情况下将核酸序列(如DNA序列)弓丨入宿主细胞中的物理和化学方法。这类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法、脂质体法等等。在另外的实施方案中，将DNA构建体或载体与质粒共同转化，而不插入质粒中。在另外的实施例中，通过本领域已知的方法从已变更的芽孢杆菌菌株缺失掉选择标记(参见 Stahl 等人，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，158:411_418[1984];和 Palmeros等人，Gene (《基因》)，247:255-264 [2000])。
[0111]在一些实施方案中，将本发明的转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且在科学文献中很好地进行了描述。在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的变体脂肪分解酶或至少一种本发明的核酸的培养物(如细胞培养物)。还提供的是包含至少一种本发明的核酸、载体或DNA构建体的组合物。
[0112]在一些实施例中，将用至少一条编码至少一种本发明变体脂肪分解酶的多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明脂肪分解酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，此后从该培养物回收所得的脂肪分解酶。用于培养细胞的培养基包含任何适于生长宿主细胞的常规培养基，如含有适当的补充成分的基本培养基和复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公布的配方(参见，例如美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)的目录中公布的配方)制备。在一些实施例中，可通过常规的程序从培养基回收由细胞产生的脂肪分解酶，包括但不限于例如，通过离心或过滤从培养基分离出宿主细胞，借助于盐(硫酸铵)沉淀出上清液或滤液的蛋白质组分，进行色谱纯化(如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等)。任何适于回收或纯化变体脂肪分解酶的方法均可用于本发明。
[0113]在一些实施例中，由重组宿主细胞产生的变体脂肪分解酶被分泌到培养基中。编码利于纯化的结构域的核酸序列可用来利于可溶性蛋白质的纯化。包含编码变体脂肪分解酶的多核苷酸序列的载体或DNA构建体，可还包含编码利于纯化的结构域的核酸序列以利于纯化变体脂肪分解酶(例如参见Kroll，D.J.等人，DNA Cell Biol.(《DNA和细胞生物学》)，12:441-53[1993])。此类利于纯化的结构域包括但不限于例如金属螯合肽，如使得可以在固定化金属上进行纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath,Protein Expr.Purif.(《蛋白质表达和纯化》),3:263-281 [1992])、使得可以在固定化免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域、以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域(如得自华盛顿州西雅图英姆纳克斯公司(Immunex Corp., Seattle, WA)的蛋白A结构域)。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可切割的接头序列如XA因子或肠激酶(如得自加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen, San Diego, CA)的序列)也可用来利于纯化。
[0114]用于检测和测量酶(如本发明的变体脂肪分解酶)的酶活性的测定法是熟知的。各种用于检测和测量脂肪分解酶(例如本发明的变体脂肪分解酶)的活性的测定法也是本领域一般技术人员已知的。具体地讲，可用来测量脂肪分解酶活性的测定法包括实例I中描述的那些测定法。
[0115]有多种方法可用于测定成熟脂肪分解酶(例如本发明的成熟变体脂肪分解酶)在宿主细胞中的产生水平。这类方法包括但不限于例如利用对该脂肪分解酶有特异性的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)和荧光激活细胞分选法(FACS)。这些和其他测定法是本领域所熟知的(参见例如Maddox等人，J.Exp.Med.(《实验医学杂志》)，158:1211 [1983])。
[0116]在一些其他实施例中，本发明提供用于制备或产生本发明的成熟变体脂肪分解酶的方法。成熟变体脂肪分解酶不包含信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞例如芽孢杆菌属细胞(如枯草芽孢杆菌细胞)中制备或产生本发明的变体脂肪分解酶。在一些实施例中，本发明提供产生本发明的变体脂肪分解酶的方法，该方法包括在有利于产生该变体脂肪分解酶的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的变体脂肪分解酶的核酸。一些这类方法还包括从培养物中回收变体脂肪分解酶。
[0117]在一些实施例中，本发明提供用于产生本发明的变体脂肪分解酶的方法，所述方法包括:(a)将包含编码本发明变体脂肪分解酶的核酸的重组表达载体引入一群细胞中(例如细菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)中；以及(b)在有利于产生由该表达载体编码的变体脂肪分解酶的条件下在培养基中培养所述细胞。一些这类方法还包括:(C)从所述细胞或从所述培养基分离所述变体脂肪分解酶。
[0118]织物和家庭护理产品
[0119]在一些实施例中，本发明的脂肪分解酶变体可用于包含辅助材料和脂肪分解酶变体的组合物中，其中该组合物为织物和家庭护理产品。合适的组合物的例子在实例I中描述。
[0120]在一些实施例中，包含至少一种脂肪分解酶变体的织物和家庭护理产品组合物包含以下成分中的一者或多者(基于总组合物重量):约0.0005重量％至约0.5重量％、约0.001重量％至约0.1重量％、或者甚至约0.002重量％至约0.05重量％的所述脂肪分解酶变体；以及以下一者或多者:约0.00003重量％至约0.1重量％的织物调色剂；约0.001重量％至约5重量％的香料囊粒；约0.001重量％至约I重量％的冷水可溶性增白剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的漂白催化剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的细菌清洁纤维素酶；和/或约0.05wt%至约20重量％的Guerbet非离子表面活性剂。
[0121 ] 如本文所用，脂肪分解酶(如本发明的变体脂肪分解酶)的“洗涤性能”是指脂肪分解酶对洗涤的贡献，与未向组合 物中添加该变体脂肪分解酶的洗涤剂相比其为洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。在一些测试系统中，其他相关因素(如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、PH和/或温度)可以以使得在某些细分市场中的家居应用(手动或手用盘碟洗涤、自动盘碟洗涤、盘碟清洁、餐具清洁、织物清洁等)的典型条件得以模拟的方式进行控制。
[0122]在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物是颗粒或粉末衣物洗涤剂。
[0123]在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物是液体衣物洗涤剂或者盘碟洗涤剂。
[0124]意在使织物和家庭护理产品以任何合适的形式(包括流体或固体)提供。织物和家庭护理产品可以是单位剂量小袋的形式，尤其是液体的形式时，并且通常织物和家庭护理产品为至少部分地或甚至完全地被水溶性小袋封闭。此外，在包含至少一种脂肪分解酶变体的织物和家庭护理产品的一些实施例中，织物和家庭护理产品可以具有上面详述的参数和/或特性的任何组合。
[0125]清洁组合物
[0126]清洁组合物和清洁制剂包括任何适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的组合物。这种组合物和制剂包括但不限于例如:液体和/或固体组合物，包括清洁或洗漆剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、条棒、颗粒和/或固体衣物清洁组合物或洗涤剂组合物以及精细织物洗涤剂组合物；硬质表面清洁组合物和制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、洗衣添加剂清洁组合物和衣物预洗剂清洁组合物；盘碟洗涤组合物，包括手动或手工盘碟洗涤组合物(如“手动”或“手工”盘碟洗涤剂)和自动盘碟洗涤用组合物(如“自动盘碟洗涤用洗涤剂”)。
[0127]除非另外指明，否则如本文所用，清洁组合物或清洁制剂包括颗粒或粉末形式的多功能洗涤剂或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂或糊剂形式的多功能洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；手动或手工盘碟洗涤剂，包括高泡类型的那些；手动或手工盘碟洗涤剂、自动盘碟洗涤用洗涤剂或盘碟或餐具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车清洗剂、地毯清洗剂、浴室清洁剂；人和其他动物的洗发剂和/或毛发清洗剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属洗涤剂；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污条”或预处理类型。在一些实施方案中，颗粒组合物为“紧凑”形式；在一些实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。
[0128]如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于洗涤介质中用来清洁染污的或脏的物体(包括特定的织物和/或非织物物体或物品)的组合物。本发明的这类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些方面，本发明的洗涤剂包含至少一种本发明的变体脂肪分解酶，此外还包含一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制齐?、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐为硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。一些本发明的组合物(例如但不限于清洁组 合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
[0129]除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，而且市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂或副产物)不计算在内。酶组分重量是以总活性蛋白质计。除非另作说明，否则所有百分比和比率都以重量计算。除非另作说明，否则所有百分比和比率都是基于总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。
[0130]如本文所指出，在一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含辅助材料，包括但不限于:表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去垢性聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和PH控制剂(参见例如美国专利N0.6，610，642、N0.6，605，458,N0.5，705，464,N0.5，710，115,N0.5，698，504,N0.5，695，679,N0.5，686，014和N0.5，646，101，所有专利都以引用的方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的本发明变体脂肪分解酶不相容的实施例中，则使用合适的方法保持清洁辅助材料与脂肪分解酶分离(即，相互不接触)，直到两种组分适宜进行组合为止。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如明胶胶囊法(gelcap)、包封法、片剂法、物理分离法等)。
[0131]含脂肪酶的洗涤剂组合物
[0132]本发明的洗涤剂组合物可例如配制成手动和机器衣物洗涤剂组合物，包括衣物添加剂组合物和适用于预处理受沾污的织物的组合物在内，漂洗加入的织物软化剂组合物，以及用于一般家用硬表面清洁操作和盘碟洗涤操作的组合物。
[0133]根据本发明的洗涤剂组合物可以为液体、糊剂、凝胶、条棒或者颗粒形式。pH (在水溶液中在使用浓度下测量)将通常为中性或者碱性，例如在7-11、特别是9-11的范围内。根据本发明的颗粒组合物也可为“紧凑形式”，即它们可具有相对高于常规颗粒洗涤剂的密度，即 550-950g/lo
[0134]本发明的组合物可包括一种或者多种助剂(例如能从织物有效去除脂质的表面活性剂)和一种或者多种脂肪分解酶。在一些实施例中，助剂和脂肪分解酶存在于单一组合物中。在其他实施例中，助剂和脂肪分解酶存在于单独的组合物中，所述组合物在接触在织物上的油性污溃之前进行组合，或者在油性污溃上进行组合。
[0135]本发明的清洁组合物可包括一种或多种助剂(表面活性剂)供与脂肪分解酶组合使用。合适的助剂可具有相对较小的不带净电荷的亲水部分和直链的或饱和的疏水部分。在一些实施例中，疏水部分包括至少六、七、八或九个相邻的脂族碳。在一些实施例中，疏水部分是环状的。在一些实施例中，疏水部分是无支链的。合适的表面活性剂包括糖基化合物和两性离子化合物。合适的助剂在W02011078949中有公开，将该专利以引用方式整体并入本文。
[0136]糖基表面活性剂包括吡喃麦芽糖苷、硫代吡喃麦芽糖苷、吡喃葡萄糖苷和它们的衍生物。麦芽糖基表面活性剂通常比葡萄糖基表面活性剂更有效。在一些实施例中，优选的糖基表面活性剂具有至少4、至少5、`至少6甚至至少7个碳的疏水尾链长。疏水尾可以是脂族的或者环状的。疏水尾可以是无分支的，不过在有足够链长的情况下，分支是可接受的。
[0137]糖基表面活性剂的具体例子包括壬基-D-吡喃麦芽糖苷、癸基-β-D-批喃麦芽糖苷、十一烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷、十二烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷、十三烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷、十四烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷、十六烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷等、2，6- 二甲基-4-庚基-β -D-吡喃麦芽糖苷、2-丙基-1-戊基-β -D-吡喃麦芽糖苷、壬基-β -D-吡喃葡萄糖苷、壬基-β -D-吡喃葡萄糖苷、癸基-β -D-吡喃葡萄糖苷、十二烷基-β -D-吡喃葡萄糖苷、蔗糖单十二烷酸酯、某些环己基烷基-β -D-麦芽糖苷(例如CYMALk和CYGLA)以及MEGA?表面活性剂。
[0138]助剂可以是非糖非离子型表面活性剂。示例性的表面活性剂包括具有九个或更少的乙氧基化物重复单元的Triton。具体的Triton是ANAPOE?- X-100和
ANAPOEk-X-1 14。在一些实施例中，助剂是具有含至少约9个碳的疏水尾的非离子型氧
化膦表面活性剂。示例性的表面活性剂包括二甲基癸基氧化膦和二甲基十二烷基氧化膦。
[0139]助剂可以是两性离子表面活性剂如FOS-胆碱。在一些实施例中，FOS-胆碱具有链长为12或更长的疏水尾。疏水尾可以是饱和的及不饱和的，且可以是环状的。示例性的FOS-胆碱表面活性剂包括FOS-ZitI碱κ -12、FOS-
胆碱φ-13、FOS-胆碱?-14、LYSOFOS-胆碱?-14、FOS-胆碱?-15、FOS-胆碱?-16、FOS-MEA l1-12、DODECAFOS、ISO 不饱和 11-10、ISOl 1-6、CYOFO, N0P0L-F0S、CYCLOFOS li (CYMALK)-5、-6.-7、-8 等之类。
[0140]在一些情况中，助剂可以是磺基甜菜碱两性离子型表面活性剂。优选的磺基甜菜碱表面活性剂具有含至少12个碳的疏水尾，例如ANZERGENT? 3-12和ANZERGENTii 3-14。两性离子型氧化物和CHAPS基表面活性剂(例如CHAPS和CHAPS0)通常在比磺基甜菜碱高的剂量下也是有效的。
[0141]在一些情况中，助剂可以是阴离子型洗涤剂，例如肌氨酸。优选的肌氨酸具有含至少10个碳的疏水尾。在一些情况中，助剂也可以是脱氧胆酸盐。
[0142]助剂可以以至少.001%、至少0.005%、至少0.01%、至少0.05%、至少0.1%或更高，或者至少0.01ppm、至少0.05ppm、至少0.lppm、至少0.5ppm、至少lppm、至少5ppm、至少IOppm或更高的量存在于组合物中。在一些情况中，助剂可以以例如约0.001-0.01%、约0.01-0.1%、约0.1-1%或者约0.ΟΙ-lppm、约0.1-1ppm或约1-1Oppm的预先选定的范围存在。在一些情况中，在一定范围内观察到最佳活性，在该范围以上和以下则活性降低。
[0143]洗涤剂的表面活性剂系统可包含非离子型、阴离子型、阳离子型、两性型和/或两性离子型表面活性剂。表面活性剂通常以0.1-60重量％、例如1-40重量％、特别是10-40重量％、优选约3至约20重量％的水平存在。洗涤剂将通常含有0-50%的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AE0S或AES)、仲烷基磺酸盐(SAS)、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或者皂。
[0144]洗涤剂可包含0-40%的非离子型表面活性剂烷基酚的聚环氧烷(例如聚环氧乙烷)缩合物。优选的非离子型表面活性剂是醇乙氧基化物(ΑΕ0或者ΑΕ)、羧化醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷、烷基二甲基氧化胺、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、烷基(N-甲基)_葡萄糖酰胺或者聚羟基烷基脂肪酰胺(例如在W092106154中描述)。
[0145]半极性非离子型表面活性剂是另一类非离子型表面活性剂，其包括含有一个约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自含约I至约3个碳原子的烷基基团和羟基烷基基团的部分的水溶性氧化胺；含有一个约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自含约I至约3个碳原子的烷基基团和羟基烷基基团的部分的水溶性氧化膦；和含有一个约10至约18个碳原子的烷基部分和一个选自约I至约3个碳原子的烷基部分和羟基烷基部分的部分的水溶性亚砜。氧化胺表面活性剂具体包括Cltl-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。
[0146]洗涤剂组合物还可包含阳离子型表面活性剂。所用的阳离子型清洁表面活性剂是那些具有一个长链烃基的阳离子型表面活性剂。这种阳离子型表面活性剂的例子包括铵表面活性剂如烷基三甲基卤化铵。非常优选的阳离子型表面活性剂是水溶性季铵化合物。合适的季铵化合物的例子包括椰油烷基三甲基氯化铵或溴化铵；椰油甲基二羟基乙基氯化铵或溴化铵；癸基三乙基氯化铵；癸基二甲基羟基乙基氯化铵或溴化铵；C12-15 二甲基羟基乙基氯化铵或溴化铵；椰油二甲基羟基乙基氯化铵或溴化铵；肉豆蘧基三甲基甲基硫酸铵；月桂基二甲基苄基氯化铵或溴化铵；月桂基二甲基(乙烯氧基)4氯化铵或溴化铵；胆碱酯、二烷基咪唑啉。
[0147]洗涤剂组合物还可包含阳两性型表面活性剂。这些表面活性剂可广义地描述为仲胺或叔胺的脂族衍生物，或者杂环仲胺和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链的或者支链的。脂族取代基之一含有至少约8个碳原子，通常约8至约18个碳原子，并至少一个含有阴离子型水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。落入这个定义内的化合物的例子有3_(十二烷基氨基)丙酸钠、3_(十二烷基氨基)-丙-1-磺酸钠、2_(十二烷基氨基)乙基硫酸钠、2-( 二甲基氨基)十八烧酸钠、3-(N -羧甲基十二烷基氨基)丙-1-磺酸二钠、十八烷基-亚氨基二乙酸二钠、1-羧甲基-2-1^一烷基咪唑钠和N，N-双(2-羟乙基)-2-硫酸根合-3-十二烷氧基-丙胺钠。优选3-(十二烷基氨基)-丙-1-横酸钠。
[0148]两性离子表面活性剂也可用于洗涤剂组合物中，尤其是在洗衣店内。这些表面活性剂可广义地描述为仲胺和叔胺的衍生物，杂环仲胺和叔胺的衍生物，或者季铵化合物、季鱗化合物或叔锍化合物的衍生物。季化合物中的阳离子型原子可以是杂环的一部分。在所有这些化合物中，存在至少一个含约3-18个碳原子的直链或者支链的脂族基团和至少一个含阴离子型水增溶性基团(例如羧基、磺酸根、硫酸根、磷酸根或膦酸根)的脂族取代基。乙氧基化的两性离子型化合物与两性离子表面活性剂相组合，已在洗衣应用中具体用于去除粘质土。
[0149]洗涤剂可含有1-65%的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸(NTA) 、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如得自赫司特公司(Hoechst)的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。
[0150]洗涤剂助洗剂可细分为含磷和不含磷的类型。含磷的无机碱性洗涤剂助洗剂的例子包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐、多磷酸盐和膦酸盐。不含磷的无机助洗剂的例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐及层状二硅酸盐以及各种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。合适的有机助洗剂的例子包括琥珀酸、丙二酸、脂肪酸丙二酸、脂肪酸磺酸、羧基甲氧基琥珀酸、聚乙酸、羧酸、聚羧酸盐、氨基聚羧酸和聚乙酰基羧酸的碱金属盐、铵盐或取代的铵盐。
[0151]适合掺入在洗涤剂组合物中的螯合剂是乙二胺-N，N’ - 二琥珀酸(EDDS)或其碱金属盐、碱土金属盐、铵盐或取代的铵盐，或者它们的混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式及其钠盐或镁盐。EDDS的这种优选的钠盐的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。EDDS的这种优选的镁盐的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐最优选掺入在组合物中。
[0152]洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子有羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
[0153]洗涤剂组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。漂白剂可以是包衣的或者封装的。无机氯/溴类型的漂白剂的例子是次氯酸和次溴酸的锂、钠或钙盐，以及氯化磷酸三钠。漂白系统还可包含可与形成过酸的漂白活化剂(例如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS))组合的过氧化氢源，如过硼酸盐或过碳酸盐。有机氯/溴类型的漂白剂的例子是杂环N-溴酰亚胺类和N-氯酰亚胺类，例如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)形成的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。漂白系统还可包含过氧酸，例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。
[0154]在盘碟洗涤剂中，优选氧漂白剂，例如为无机过盐的形式，优选与漂白前体一起或者作为过氧酸化合物。合适的过氧漂白化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物二者)、碱金属过碳酸盐、碱金属过娃酸盐和碱金属过磷酸盐。优选的活化剂材料是四乙酰乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)、3，5-三甲基-hexsanoloxy苯磺酸盐(IS0N0BS)或者五乙酰基葡萄糖(PAG)。
[0155]本发明的脂肪酶或者任选地另一掺入在洗涤剂组合物中的酶，通常以按组合物的重量计0.00001%至2%酶蛋白的水平、优选以按组合物的重量计0.0001%至1%酶蛋白的水平、更优选以按组合物的重量计0.001%至0.5%酶蛋白的水平、甚至更优选以按组合物的重量计0.01%至0.2%酶蛋白的水平掺入在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂组合物可包含脂肪酶，其量相当于10-50，000LU/g洗涤剂，优选20-5，000LU/g洗涤剂，例如100-1000LU/g洗涤剂。可将洗涤剂溶解在水中以产生含脂肪分解酶的洗涤液，该脂肪分解酶的量相当于25-15，000LU/1洗涤液，特别是100-5000LU/1洗涤液，例如300-2000LU/1洗涤液。脂肪酶蛋白的量可为0.001-10mg/g洗涤剂或者0.001-100mg/l洗涤液。本发明的脂肪酶变体特别适合于由阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂的组合构成的洗涤剂，其中阴离子型表面活性剂占70-100重量％，非离子型表面活性剂占0-30重量％，特别是阴离子型表面活性剂占80-100重量％，非离子型表面活性剂占0-20重量％。如进一步描述的，本发明的一些优选的脂肪酶也适合于包含40-70%阴离子型表面活性剂和30-60%非离子型表面活性剂的洗涤剂。洗涤 剂组合物除了包含本发明的脂肪酶外，还可包含其他能提供清洁性能和/或织物护理有益效果的酶，例如另外的脂肪酶、角质酶、蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、氧化还原酶、还原酶、氧化酶(例如漆酶)、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶。
[0156]可使用常规的稳定剂(例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如硼酸芳族酯)来稳定洗涤剂组合物的酶。作为酶稳定剂的硼酸或硼酸衍生物包括硼酸、噻吩-3-硼酸、噻吩-2-硼酸、4-甲基噻吩-2-硼酸、5-乙基噻吩-2-硼酸、5-甲基噻吩-2-硼酸、5-溴噻吩-2-硼酸、5-氯噻吩-2-硼酸、二苯并噻吩-1-硼酸、二苯并呋喃-1-硼酸、二苯并呋喃-4-硼酸、甲基吡啶-2-硼酸、二苯基硼酸(乙醇胺络合物)、5_甲氧基噻吩-2-硼酸、硫却(thionaphthrene) _1_硼酸、呋喃_2_硼酸、呋喃_3_硼酸、2，5- 二甲基-噻吩-3-硼酸、苯并呋喃-1-硼酸、3-甲氧基噻吩-2-硼酸、5-正丙基-噻吩-2-硼酸、5-甲氧基呋喃-2-硼酸、3-溴噻吩-2-硼酸、5-乙基呋喃-2-硼酸、4-咔唑乙基硼酸。
[0157]任选的成分是抑泡剂(例如，有机硅-烷基化聚硅氧烷材料，及二氧化硅-有机硅混合物，其中二氧化硅为二氧化硅气凝胶和干凝胶以及各种类型的疏水二氧化硅的形式。抑泡剂可以作为颗粒掺入，其中抑泡剂掺入在水溶性或者水可分散性的、基本上非表面活性的不渗透洗涤剂的载体中，有利地是可释放的。作为另一种选择，可将抑泡剂溶解或者分散在液体载体中并通过喷到一种或者多种其他组分上来进行施加。
[0158]洗涤剂还可含有无机或者有机软化剂。无机软化剂的例子有绿土粘土(5%至15%)。有机织物软化剂(0.5%至5%)包括水不溶性叔胺以及它们与单C12-C14季铵盐和二长链酰胺的组合，或者高分子量聚环氧乙烷材料。
[0159]洗涤剂还可含有其他常规的洗涤剂成分，例如织物调理剂(包括粘土)、抗絮凝剂材料、泡沫促进剂/抑泡剂(在盘碟洗涤剂中为抑泡剂)、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂或分散剂(0-10%)、抗污垢再沉淀剂、染料、脱水剂、杀细菌剂、荧光增白、磨料、晦暗抑制剂、着色剂和/或封装或非封装的香料。
【权利要求】
1.一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在所述脂肪分解酶变体的高产位置处，其中在所述高产位置处测试的修饰中的至少75%满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述高产位置选自 1、9、13、18、19、23、25、26、28、32、33、46、47、48、61、64、89、90、92、105、113、114、157、183、204、234、245、246、249 和 253，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
2.一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在所述脂肪分解酶变体的高产位置处，其中在所述高产位置处测试的修饰中的至少40%但小于75%满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0. 9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述高产位置选自 3、12、24、30、35、49、60、63、65、72、73、87、95、98、108、109、110、112、117、121、122、131、142、151、163、165、174、175、177、182、187、194、195、212、213、232、238、248和256，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
3.一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在所述脂肪分解酶变体的高产位置处，其中在所述高产位置处测试的修饰中的至少15%但小于40%满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述高产位置选自 4、5、11、14、17、21、22、31、43、50、53、57、62、68、74、78、82、`83、85、88、101、102、106、107、116、124、126、136、138、141、149、152、153、158、178、190、197、`202、207、209、216、219和250，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
4.一种包含对亲本脂肪分解酶作出的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在所述脂肪分解酶变体的高产位置处，其中在所述高产位置处测试的修饰中的至少一个修饰但小于15%满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述高产位置选自 2、27、41、42、44、45、51、54、56、58、66、67、75、79、81、86、91、96、104、111、120、125、127、135、144、156、159、160、162、171、172、181、184、186、188、205、210、211、217、221、222、223、230、236、237、239、247、251、252 和 254，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
5.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述脂肪分解酶变体满足全部以下标准: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 A001D、A001M、Y004N、N009D、N009L、N009M、N009Q、N009Y、A013F、A013Q、A013Y、S018E、S018H、S023A、S023E、S023Q、S025A、S025C、S025D、S025E、S025N、E026A、E026C、E026F、E026H、E0261、E026K、E026M、E026Q、E026R、E026S、E026T、E026V、E026W、E026Y、N0281、N028K、N028P、N028Q、N028T、N028Y、S030D、L032A、L032E、L032Q、S033Q、S035E、S0351、S035Q、S035V、Y043R、R046D、R0461、R046N、R046Q、R046T、S057C、Y060C、T061D、T061M、T061P、G062A、T063C、E064A、E064K、E064Q、E064R、A065G、A065K、A065Y、E072H、R073L、R073Y、T083V、D085E、1087L、T088D、T088E、T089A、T089C、T089D、T089E、T089G、T089L、T089P、T089V、L090E、L090Q、L090S、L090T、Q092D、Q092E、Q092G、Q092H、Q092N、Q092S、Q092Y、S095D、S095E、S095Q、N101E、N105A、N105D、N105E、N105G、N105M、N105Q、N105S、M107L、I108L、I108Y、N109T、RllOH、S113C、S113D、S113E、S113H、S113P、T114D、T114E、S117Q、A125S、V126A、M131A、M131F、M131L、T136A、T136V、S141E、P151A、P151C、P1511、P151L、P151S、P151V、L1521、T153C、T153L、H156D、L157A、L157C、L157H、L1571、L157K、L157N、L157Q、L157S、L157T、L157W、L157Y、N158E、N160D、D174A、D174C、D174E、D174G、D174H、D174K、D174M、D174Q、D174R、D174S、D174T、D174V、L175C、L175D、L175E、L175G、L175N、L175Q、T177D、I178L、A182D、A182E、T183D、T183E、T183H、T183Q、T183S、H184Y、P187A、P187E、P187M、P187V、F188M、N190E、S194D、S194E、S197A、E202V、D204A、D204C、D204E、D204F、D204G、D204H、D2041、D204K、D204L、D204M、D204N、D204P、D204Q、D204R、D204S、D204T、D204V、D204W、T207D、T207G、F209C、F209E、A210T、N2121、N212L、N212M、N212T、N212V、I213C、I213E、I213F、I213H、I213K、I213Q、I213R、I213S、I213Y、G219A、N232C、N232M、T234H、R245V、D246A、D246C、D246H、D246P、D246T、L2481、F249G、F249K、F249N、F249P、G250P、E253A、E253C、E253F、E253G、E253H、E2531、E253K、E253L、E253N、E253Q、E253R、E253S、E253T、E253V、E253W、E253Y、R256I 和R256L，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO: 4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
6.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的a)和b)但不满足c): a)这样的位置，其中相对于非经修`饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 A001E、A001F、A001G、A001H、A001K、A001L、A001N、A001R、A001S、A001T、A001V、A001W、A001Y、Y004F、E005A、E005L、N009A、N009E、N009H、N009S、N009T、N009V、T011N、D012A、D012H、A013C、A013D、A013E、A013K、A013L、A013M、A013S、A013T、L014F、L0141、L014M、A017G、A017K、A017M、A017Q、A017S、S018A、S018G、S0181、S018N、S018Q、S018R、S018V、S018W、S019A、S019C、S019F、S019H、S019K、S019L、S019M、S019N、S019R、S019T、S019V、S019W、P021L、F022Y、S023C、S023D、S023F、S023G、S023H、S0231、S023K、S023L、S023M、S023P、S023T、S023Y、V024F、V0241、V024L、V024M、V024T、V024W、V024Y、S025G、S025K、S025L、S025M、S025Q、S025R、S025T、S025V、E026G、E026L、E026N、N028A、N028E、N028F、N028G、N028H、N028L、N028M、N028S、N028V、N028W、S030A、S030E、S030N、S030P、S030T、R031K、L032G、L032H、L0321、L032K、L032M、L032N、L032R、L032S、L032T、L032Y、S033A、S033D、S033H、S033K、S033M、S033N、S033V、S035D、S035H、S035L、S035N、S035R、S035Y、T041K、Y044F、R046A、R046E、R046K、R046L、R046S、R046V、E047D、N048A、N048C、N048D、N048E、N048G、N048H、N0481、N048K、N048L、N048M、N048P、N048Q、N048R、N048Y、N049A、N049D、N049G、N049M、N049Q、T050L、Y051F、A053G、S057A、S057V、Y060L、Y060V、T061A、T061G、T061S、T061Y、G062T、T063D、T063H、T063K、T063N、E064M、E064V、E064W、E064Y、A065N、A065Q、A065R、A065S、S066D、S066T、1067L、A068Q、E072A、E072L、E072M、E072Q、E072S、1074V、1082F、1082M、T083C、D085N、1087C、1087M、T088N、T088S、T089H、T0891、T089K、T089N、T089Q、T089S、L090A、L090F、L090M、L090W、L090Y、Q092A、Q092L、E098Q、N101A、N101D、N101Q、A102H、L104V、N105H、H106W、I108C、I108T、I108V、N109E、N109F、N109H、N109K、N109M、N109S、N109Y、RllOA、RllOC、RllOE、RllOF、RllOG、RllOL、RllOM、RllON、RllOQ、RllOS、A111T、S113A、S113F、S113G、S113K、S113L、S113N、S113Q、S113T、S113V、S113Y、T114A、T114C、T114H、T1141、T114K、T114M、T114N、T114Q、T114R、T114S、T114V、R116S、S117D、S117E、S117G、S1171、S121A、S122G、S122H、S122K、S122N、R138E、R138Q、S141Q、Q142E、Q1421、Q142L、Q142M、P144K、P151G、L152M、L157F、L157M、L157R、L157V、N158H、N160E、S162E、S163E、S163N、S163T、T165K、T165M、T165Q、T165R、T165Y、I171F、G172A、L175A、L175H、L175S、T177K、T177R、T177V、V181P、A182H、A182N、A182Q、A182S、T183A、T1831、T183K、T183R、T183Y、H184F、K186R、P187K、P187Q、P187T、S195D、S195E、S195H、S195N、S195T、E202G、E2021、E202L、E202Q、G205Q、T207N、F209W、N212A、N212Y、I213L、I213M、G219Q、Y221F、S222C、S222T、V230Q、N232D、N232G、N23 2K、N232L、T234A、T234D、T234E、T2341、T234Q、T234S、T237N、T237S、R245A、R245C、R245E、R245G、R245H、R245K、R245L、R245M、R245Q、R245S、R245T、D246G、D2461、D246K、D246Q、D246S、D246V、G247K、L248A、L248D、L248E、L248K、L248M、L248Q、L248S、F249C、F249H、F249L、F249M、F249Q、F249R、F249S、F249T、F249V、F249Y、E251G、V2521、E254C、R256C、R256D、R256E、R256H、R256M、R256Q、R256T、R256V 和 R256W，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
7.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的a)或者满足b)和c)两项，但不满足全部三项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ；c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、PH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 A001C、A001P、A001Q、Y004W、E005W、N009C、N009F、N009G、N0091、D012V、A013H、A0131、S018F、S018M、S018P、S018T、S019G、S0191、S019Q、S019Y、S023R、S023V、V024K、S025F、S0251、L032D、L032V、S033E、S033F、S0331、S033L、S033R、S035A、S035M、Y043W、R046C、R046F、R046H、R046M、E047C、E047H、N048S、N048V、N048W、N049C、T050Q、V0541、T061H、T0611、T061V、T063S、E064G、E0641、E064L、E064N、A065C、A065L、A065M、1067V、A068H、A068K、A068T、E072K、E072N、R073F、T0831、1087Y、T089M、T089W、L090K、L090V、Q092K、Q092M、Q092T、S095C、E098D、E098T、N101W、A102C、N105Y、M107V、I108Q、R110K、R110T、S113W、T114P、S117A、S117C、S117M、S117N、S117P、S117T、S121G、S121K、S121N、S121P、S121R、S121T、S122A、S122C、S122D、S122E、S122R、S122T、M127S、R138T、Q142R、Q142V、A149C、P151T、L157E、L157P、N158V、S163D、S163M、T165L、T165V、D174N、L175K、T177H、T177Q、T177Y、I178V、V181T、T183C、T183F、T183M、T183N、P187L、P187S、S194M、S194Q、S194T、S195C、S195W、S197E、S197K、E202C、G205N、P211V、N212C、I213A、I217T、G219T、N232A、N232E、N232F、N232H、N232Y、T234K、T234L、T234N、T234R、T234V、Q238E、Q238P、Q238R、F239Y、D246E、D246M、D246R、D246W、L248C、L248P、L248V、F249W、G250K、G250R、E253M、E254K和R256K，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
8.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的b)，但不满足a)或者c): a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，`并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 N002A、N002L、P003A、P003E、P003G、P003H、P0031、P003K、P003L、P003M、P003Q、P003S、P003T、P003V、T011H、D012E、D012S、A013G、A013P、L014Y、S018L、S019E、F022E、F022M、V024C、V024Q、E026P、N028C、N028D、L032F、L032P、S033Y、T041R、1042V、Y043K、E047F、E047L、E047M、E047P、E047S、E047V、E047W、N049E、N049F、N049L、N049Y、T050E、T050V、Y060G、Y060M、G062Q、G062S、T063A、T063G、E064T、A065D、A065E、A065H、A065T、E072D、E072V、E072W、D085C、1087E、T088G、T089Y、L090R、Q092V、N101S、N1051、N105K、N105L、N105R、H106F、I108M、I108N、N109R、S112G、S112P、S112T、T114F、T114G、T114Y、R1161、R116K、R116T、R116V、S117H、D120L、S122L、S122Q、S122V、S122Y、L124A、L124M、L124P、M127V、G135A、T136S、R138A、S141A、Q142D、Q142K、Q142N、S163A、S163G、T165H、I171V、T177M、T177N、A182C、K186L、P1871、N190H、N190Y、S194C、S197Y、F209D、F209N、N212S、I217V、V223T、V230A、T234G、T234M、T234Y、Y236F、Q238C、Q238D、Q238G、Q238M、Q238S、R245N、R245P、D246Y、G247R、L248R、F249A、F249E 和 R256N,其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
9.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的C)，但不满足a)或者b): a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 N009W、D0121、D012L、A013R、A017N、S018Y、P021D、P021T、P021Y、F022H、F022K、S023N、V024N、S025H、S025Y、E027N、S030C、S030K、R031Q、R031V、S033C、S035C、S035W、1042Q、P045A、P045T、R046P、R046Y、E047Q、A053L、A053V、1056M、S057T、P058G、Y060A、Y060F、Y060S、Y060W、T061C、T061K、T061L、T061N、T061Q、T061R、T061W、G062D、T063E、T063P、E064H、E064S、E072F、E072G、E072R、R0731、R073T、R073V、R073W、1074A、1074C、1074G、1074T、A075S、G078A、G078S、F079G、V081G、1082G、1082K、1082Q、T083M、T083N、D085G、T086G、T086N、1087Q、1087S、1087T、1087W、T088C、L090C、L090D、L090G、L090H、L090N、D091E、D091Y、Q092C、Q092P、S095A、S095L、S095V、S095Y、R096Y、A102Y、N105C、N105F、N105V、N105W、M107S、I108K、I108P、N109Q, R110Y、S112F、S1121、S112L、S112W、S112Y、S113M、V126T、M131G、M1311、M131S、M131V、T136C、R138D、R138M、Q142A、A1491、T153N、L157D、L157G、N158C、N158D、N1581、N158W、K159T、S163C、T177C、T177E、T177S、I178F、I178Y、A182G、A182Y、T183L、P187C、N190S、S195F、S195Q,S195Y、D204Y、A210S、K216N、K216Q、K216Y、G219L、N232R、N232W、R2451、L248F、F249D、G250S、G250T、E251Q、E253D和E253P，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ IDN0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
10.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性或者电荷表面修饰位置，其中具有所述有利的表面修饰位置的所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ;b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述残基位置选自 1、4、9、12、18、19、23、25、26、28、32、35、64、88、89、95、.107、110、113、114、117、136、141、157、162、163、174、182、187、195、197、202、204、213、219 和.246，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
11.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性表面修饰位置，其中具有所述有利的表面修饰位置的所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9， 并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述残基位置选自 1、4、9、12、18、19、23、25、26、28、32、35、64、88、89、95、107、110、113、114、117、136、141、157、162、163、174、182、187、195、197、202、204、213、219 和246，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
12.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的电荷表面修饰位置，其中具有所述有利的表面修饰位置的所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述残基位置选自 1、9、12、18、19、23、26、28、32、35、88、110、113、114、117、.136、141、162、163、174、202、204、213和246，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
13.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性或者电荷表面修饰，其中具有所述有利的表面修饰的所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 A001E、A001V、Y004F、N009D、D012H、S018A、S018T、S018V、S018W、S019C、S019H、S019K、S019L、S019M、S019R、S023A、S023E、S025A、S025G、E026F、E0261、E026K、E026L、E026M、E026R、E026V、E026Y、N028H、N028K、N028Q, N028S、N028V、L032A、L032H、L032K、L032N、L032S、L032T、S035D、S035E、E064Q、T088N、T088S、T0891、T089L、T089M、T089V、S095Q、M107V、R110A、S113F、S113P、T114Q、S117D、S117E、S117M、T136A、S141E、L157M、L157T、L157Y、S162E、S163D、D174A、D174K、D174Q、D174S、A182H、A182N、P187V、S195N、S195T、S197A、E202V、D204K、D204R、I213F、G219A 和 D246E，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID NO:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
14.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的疏水性修饰，其中具有所述有利的表面修饰的所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值 0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 A001E、A001V、Y004F、N009D、D012H、S018A、S018T、S018V、S018W、S019C、S019H、S019K、S019L、S019M、S023A、S025A、S025G、E026F、E0261、E026K、E026L、E026M、E026R、E026V、E026Y、N028H、N028Q、N028S、N028V、L032A、L032H、L032K、L032N、L032S、L032T、S035D、S035E、E064Q、T088N、T088S、T0891、T089L、T089M、T089V、S095Q、M107V、RllOA、S113F、S113P、T114Q、S117D、S117E、S117M、T136A、S141E、L157M、L157T、L157Y、S162E、S163D、D174A、D174K、D174Q、D174S、A182H、A182N、P187V、S195N、S195T、S197A、E202V、D204R、I213F、G219A和D246E，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
15.一种包含对亲本脂肪分解酶的氨基酸修饰的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述修饰在暴露于表面的残基处并且是有利的电荷表面修饰，其中具有所述有利的表面修饰的所述脂肪分解酶变体满足以下标准中的至少一项: a)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.9，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.0 ; b)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.8，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.2 ； c)这样的位置，其中相对于非经修饰的位置而言，在表达、pH8或pHIO下的CS-61微样本活性、pH8或pHIO下对PNO底物的活性、洗涤剂稳定性或者热稳定性方面的最低性能指数(PD大于或等于PI值0.5，并且其中这些方面中的任何一个的PI值大于或等于1.5 ； 并且其中所述修饰选自 A001E、N009D、D012H、S018A、S018T、S018V、S018W、S019K、S019R、S023A、S023E、E026K、E026R、N028H、N028K、N028Q、N028S、N028V、L032K、S035D、S035E、T088N、T088S、RllOA、S113F、S113P、T114Q、S117D、S117E、T136A、S141E、S162E、S163D、D174K、E202V 、D204K、D204R、I213F和D246E，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置是通过与SEQ ID N0:4中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2的氨基酸序列的对应关系进行编号。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述变体与脂肪分解酶Tfulip2同源物具有至少50%同一性。
17.根据权利要求16所述的脂肪分解酶变体，其中所述脂肪分解酶Tfulip2同源物来自选自以下的属:嗜热裂孢菌属(Thermobifida)、抚孢菌属(Verrucosispora)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、链霉菌属(Streptomyces)、小单抱菌属(Micromonospora)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、束丝放线菌属(Actinosynnema)、高丽菌属(Kribbella)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、奇异球菌属(Deinococcus)、动球菌属(Kineococcus)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、弗兰克氏菌属(Frankia)、琼斯氏菌属(Jonesia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、食酸菌属(Acidovorax)和类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)。
18.根据权利要求17所述的脂肪分解酶变体，其中所述脂肪分解酶Tfulip2同源物来自嗜热裂孢菌属。
19.根据权利要求17所述的脂肪分解酶变体，其中所述脂肪分解酶Tfulip2同源物是SEQ ID N0:4所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)脂肪酶2。
20.根据权利要求16所述的脂肪分解酶变体，其中所述脂肪分解酶Tfulip2同源物来自表6.1中所列的物种。
21.根据权利要求1-15中任一项所述的脂肪分解酶变体或其活性片段，其中所述变体与亲本脂肪分解酶相比具有改进的性质。
22.根据权利要求21所述的脂肪分解酶变体，其中所述改进的性质是清洁性能、洗涤剂稳定性或者热稳定性。
23.根据权利要求1-15中任一项所述的脂肪分解酶变体，其中所述亲本脂肪分解酶来源于嗜热裂孢菌家族。
24.根据权利要求23所述的脂肪分解酶变体，其中所述亲本脂肪分解酶来源于褐色嗜热裂抱囷。
25.根据权利要求1-15中任一项所述的脂肪分解酶变体，其中所述脂肪分解酶变体是脂肪酶脂肪分解酶变体。
26.根据权利要求1-15中任一项所述的脂肪分解酶变体，其中所述脂肪分解酶变体是角质酶脂肪分解酶变体。
27.一种清洁组合物，包含至少一种根据权利要求1-26中任一项所述的脂肪分解酶变体。
28.根据权利要求27所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物是颗粒、粉末、固体、条棒、液体、片剂、凝胶或者糊剂组合物。
29.根据权利要求27或者28所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物是洗涤剂组合物。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物是衣物洗涤剂组合物、盘碟洗涤剂组合物或者硬表面清洁组合物。
31.根据权利要求30所述的清洁组合物，其中所述盘碟洗涤剂是手动盘碟洗涤剂组合物或者自动盘碟洗涤剂组合物。
32.根据权利要求30所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物是衣物洗涤剂组合物。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种漂白剂。
34.根据权利要求27-32中任一项所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物不含磷酸盐。
35.根据权利要求27-32中任一项所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物含有磷酸盐。
36.根据权利要求27-35中任一项所述的清洁组合物，还包含至少一种另外的酶。
37.根据权利要求36所述的清洁组合物，其中所述另外的酶选自另外的脂肪酶、角质酶、蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、氧化还原酶、还原酶、氧化酶(例如漆酶)、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶。
38.一种清洁方法，包括使表面或者物品与包含至少一种根据权利要求1-26中任一项所述的脂肪分解酶变体的清洁组合物接触。
39.一种清洁方法，包括使表面或者物品与根据权利要求27-37中任一项所述的的清洁组合物接触。
40.根据权利要求38或者39所述的方法，还包括在使所述表面或者物品分别与所述清洁组合物接触后将所述表面或者物品进行漂洗。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述物品是盘碟。
42.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述物品是织物。
43.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，还包括在使所述表面或者物品与所述清洁组合物接触后将所述表面或者物品进行漂洗的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法，还包括在所述表面或物品的所述漂洗之后干燥所述表面或物品的步骤。
45.一种清洁表面或者物品的方法，包括:提供根据权利要求27-37中任一项所述的清洁组合物和需要进行清洁的表面或者物品；并使所述清洁组合物与所述需要进行清洁的表面或者物品在适合清洁所述表面或者物品的条件下进行接触，以得到经清洁的表面或者物品O
46.根据权利要求45所述的方法，还包括漂洗所述经清洁的表面或物品以得到漂洗过的表面或物品的步骤。
47.根据权利 要求45或者46所述的方法，还包括干燥所述漂洗过的表面或者物品的步骤。
【文档编号】C12N9/18GK103781903SQ201280041629
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年8月30日 优先权日:2011年8月31日
【发明者】D·A·埃斯特尔, L·B·詹森, K·M·克拉格, R·梅耶达尔, S·普莱斯鲁斯 申请人:丹尼斯科美国公司