源自人皮肤真皮的成体干细胞的制作方法
【专利摘要】本发明提供了从人皮肤真皮衍生的成体干细胞和用于分离所述成体干细胞的方法。本发明进一步提供了从源自人皮肤真皮的成体干细胞分化的成骨细胞和脂肪细胞及其分化方法。本发明进一步提供了用于骨生成或脂肪生成的含有干细胞、成骨细胞或脂肪细胞的组合物。本发明的分离方法能够以容易且简单的方式高产率地获得源自人皮肤真皮的成体干细胞。可以分离、鉴定并且随后使用用所述方法分离的源自人皮肤真皮的成体干细胞中特异性表达的基因和生长因子。
【专利说明】源自人皮肤真皮的成体干细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及人皮肤真皮衍生的成体干细胞。
【背景技术】
[0002]在近些年，一直尝试从组织分离具有多能性的成体干细胞。尽管这些成体干细胞是不利的，因为它们与全能性胚胎干细胞不同，不能分化成所有细胞类型，但由于它们不存在胚胎干细胞的伦理问题，它们在研究和应用中是有用的。然而，由于与胚胎干细胞不同，成体干细胞的数量非常少(预测低于相应组织中约1-5%的细胞)，因此在从成体组织收集和分离它们时存在困难。
[0003]最后，干细胞研究的主要目的是用于治疗。期望通过细胞移植或替换提供新的基于干细胞的细胞，来恢复特定器官或组织患病的病人的健康。研究人皮肤成体干细胞的期望在于，它们可以用于治疗皮肤损伤如，烧伤或创伤，或皮肤疾病，如，溃疡、特应性过敏等。人皮肤由表皮、真皮、皮下组织和附器组成。已经从表皮分离了表皮干细胞，并 且从附器毛发分离了毛囊干细胞。并且，已经通过称为悬浮培养的特殊培养系统从啮齿动物和人分离了真皮衍生的成体干细胞。已经发现了这些真皮衍生的成体干细胞(也称为皮肤衍生的前体(SKP))作为中胚层细胞(如，脂肪、骨和肌肉细胞)是可分离的(Toma et al., 2001;Tomaet al., 2005)。
[0004]皮肤成体干细胞在皮肤组织中占据非常少的数量。据估计，表皮干细胞占据的数量小于角化细胞数量的1-5%,而真皮衍生的干细胞的数量也估计仅为2-3%。因此,在分离它们时存在困难，但已经报道了几种用于分离皮肤成体干细胞的特异性标志物(或生物标志物)。目前，已知整联蛋白α-6、⑶71、整联蛋白β-1和ρ63是作为表皮干细胞的标志物(Webb et al., 2004; Yi et.，2008)，并且已知仅有CD200是用于毛囊干细胞(Garza etal.，2011)。
[0005]最近，据观察，使用真皮成纤维细胞培养系统从人真皮分离的真皮衍生的成体干细胞具有分化成脂肪、骨和软骨细胞的多能性，并且发现它们是波形蛋白+/巢蛋白-(ChenFG et al.，2007)。然而，由于该方法与普通成纤维细胞培养系统没有太大差异，因此不能有效分离所述细胞。
【发明内容】
[0006]技术问题
[0007]本发明涉及提供从人皮肤分离的人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其表达特定的基因和生长因子作为生物标志物。
[0008]技术方法
[0009]在一个概括方面中，本发明提供了人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，一种或多种选自Sox2 (SRY (性别决定区Y)-盒2)和SlOOb(S100钙结合蛋白B)的基因是超表达的。[0010]在本发明的示例性实施方案中，通过传代培养人皮肤真皮衍生的成纤维细胞，将细胞与明胶或4型胶原蛋白反应，并且分离粘附于明胶或4型胶原蛋白的细胞，从而获得干细胞。
[0011]在本发明的示例性实施方案中，通过将成纤维细胞与明胶或4型胶原蛋白反应1-5分钟来获得干细胞。
[0012]在本发明的示例性实施方案中，明胶可以溶解于蒸馏水中至0.l-lwt%的浓度，而4型胶原蛋白可以溶解于蒸馏水中至10-30 μ g/mL的浓度。
[0013]在本发明的示例性实施方案中，明胶或4型胶原蛋白可以在0-10°C下在基质上涂覆16-24小时。
[0014]在本发明的示例性实施方案中，干细胞可以是其中与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比选自EGF (表皮生长因子)、FGF4 (成纤维细胞生长因子4)、TOGF-AA (血小板衍生的生长因子-AA)、VEGFR-2 (血管内皮生长因子受体2)、VEGFR-3 (血管内皮生长因子受体3)和VEGF-D (血管内皮生长因子D)的一种或多种生长因子超表达的干细胞。
[0015]在本发明的示例性实施方案中，干细胞可以是保藏号No:KCTCl 1995BP的干细胞。
[0016]在另一个概括方面中，本发明提供了从人皮肤真皮衍生的成体干细胞分化的成骨细胞或脂肪细胞。
[0017]在本发明的示例性实施方案中，成骨细胞可以是其中与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比选自OGN (骨甘氨酸(osteoglycin))和ACAN (聚集蛋白聚糖(aggrecan))的一种或多种基因超表达的成骨细胞。
[0018]在本发明的示例性实施方案中，脂肪细胞可以是其中与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比选自PPARG (过氧化物酶体增殖因子激活受体Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂联素，含ClQ和胶原蛋白结构域)和FABP4 (脂肪结合蛋白4，脂肪细胞)的一种或多种基因超表达的脂肪细胞。
[0019]在另一个概括方面中，本发明提供了用于骨生成或脂肪生成的组合物，其含有人皮肤真皮衍生的成体干细胞、成骨细胞或脂肪细胞，作为活性组分。
[0020]在本发明的示例性实施方案中，组合物可以提供预防和治疗骨质疏松、预防和治疗皮肤老化、治疗皮肤创伤、改善皮肤血液循环、增强皮肤体积或植皮的作用。
[0021]在另一个概括方面中，本发明提供了用于分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，包括传代培养人皮肤真皮衍生的成纤维细胞，将细胞与明胶或4型胶原蛋白反应，并且分离粘附于明胶或4型胶原蛋白的细胞。
[0022]在本发明的示例性实施方案中，在分离方法中，可以将成纤维细胞与明胶或4型胶原蛋白反应1-5分钟。
[0023]在本发明的示例性实施方案中，在分离方法中，明胶可以溶解于蒸馏水中至0.l_lwt%的浓度，而4型胶原蛋白可以溶解于蒸馏水中至10-30 μ g/mL的浓度，然后与成纤维细胞反应。
[0024]在本发明的示例性实施方案中，在分离方法中，可以将明胶或4型胶原蛋白在0-10°C下涂覆于基质上16-24小时，然后与成纤维细胞反应。
[0025]在本发明的示例性实施方案中，所述分离方法可以进一步包括确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，选自Sox2 (SRY (性别决定区Y)-盒2)和SlOOb (S100钙结合蛋白B)的一种或多种基因是否超表达。
[0026]在本发明的示例性实施方案中，所述分离方法可以进一步包括确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，选自EGF (表皮生长因子)、FGF4 (成纤维细胞生长因子4)、TOGF-AA(血小板衍生的生长因子-AA)、VEGFR-2 (血管内皮生长因子受体2)、VEGFR-3 (血管内皮生长因子受体3)和VEGF-D (血管内皮生长因子D)的一种或多种生长因子是否超表达。
[0027]在另一个概括方面中，本发明提供了用于分化人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，包括将通过分离方法分离的人皮肤真皮衍生的成体干细胞分化成成骨细胞或脂肪细胞。
[0028]在本发明的示例性实施方案中，所述分化方法可以包括:在成骨分化培养基中分化分离的干细胞；并确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，分化的细胞是否超表达选自OGN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一种或多种基因。
[0029]在本发明的示例性实施方案中，所述分化方法可以包括:在脂肪细胞分化培养基中分化分离的干细胞；并确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，分化的细胞是否超表达选自PPARG (过氧化物酶体增殖因子激活受体Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂联素，含ClQ和胶原蛋白结构域)和FABP4 (脂肪结合蛋白4，脂肪细胞)的一种或多种基因。
[0030]有益效果
[0031]含有本发明的人皮肤真皮衍生的成体干细胞、由干细胞分化的成骨细胞或由干细胞分化的脂肪细胞的组合物可以用作用于骨生成和脂肪生成的组合物。此外，根据本发明的分离方法允许容易且简单地以高产量获得皮肤真皮衍生的成体干细胞，并且还允许利用在分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞中特异性表达的基因和生长因子。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1显示了作为干性(sternness)测量，使用明胶分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞和皮肤真皮衍生的成纤维细胞的集落形成能力的比较结果。
[0033]图2显示了与真皮衍生的成纤维细胞相比，分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞中的Sox2 (a)和SlOOb (b)的表达各自提高2倍和3倍。研究了干细胞是否与通过现有方法分离的人真皮衍生的成体干细胞(波形蛋白+/巢蛋白_)相同或相似。波形蛋白(c)和巢蛋白(d)与真皮衍生的成纤维细胞中的表达一样，表明本发明的人真皮衍生的成体干细胞不同于通过现有方法分离的人真皮衍生的成体干细胞(波形蛋白+/巢蛋白_) (Chen FGet al., 2007)。
[0034]图3显示了分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞分化成成骨细胞，并且表达了成骨细胞代表性的遗传标志物，OGN (a)和ACAN (b)。
[0035]图4显示了分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞分化成脂肪细胞，并且表达了脂肪细胞代表性的遗传标志物，PPARG (a), AdipoQ (b)、瘦素(c)和FABP4⑷。
[0036]图5显示了与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞中的细胞生长因子EGF (a)和FGF4 (b)以及血管生成因子PDGF-A (C)、VEGFR-2 (d)、VEGFR-3 (e)和 VEGF-D (f)是超表达的。
[0037]图6显示了皮肤真皮中存在的血管。
[0038]图7显示了血管生成因子的谱系。[0039]最佳方式
[0040]在下文中，详细描述本发明。
[0041]本发明的发明人努力研发了一种以高产量分离与表皮干细胞或毛囊干细胞相比尚未得到充分阐明的人真皮衍生的成体干细胞的方法。在研发过程中，他们发现，细胞与明胶或4型胶原蛋白的粘附随着时间而变化，并且基于该发现已经完成了本发明。
[0042]本发明提供了人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，选自Sox2 (SRY (性别决定区Y)-盒2)和SlOOb (S100钙结合蛋白B)的一种或多种基因是超表达的。
[0043]在各种类型的人成体干细胞的遗传标志物中，Sox2 (SRY (性别决定区Y)-盒2)和SlOOb (S100钙结合蛋白B)在本发明的皮肤真皮衍生的成体干细胞中特异性地显示出提高的表达，并且由本发明的发明人首次进行了鉴定。
[0044]已知之前已知的皮肤真皮衍生的成体干细胞是巢蛋白-(无表达)，波形蛋白+ (表达)。由于本发明分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，在巢蛋白和波形蛋白的表达中无差别，因此它们不同于现有的皮肤真皮衍生的成体干细胞。
[0045]在各种类型的皮肤成体干细胞中，已知使用4型胶原蛋白分离皮肤成体干细胞仅是针对表皮干细胞的。本发明的皮肤真皮衍生的成体干细胞是新的干细胞，其不同于现有的皮肤真皮衍生的成体干细胞，并且首次由本发明的发明人发现。
[0046]本发明还提供了用于分离皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，包括将人皮肤真皮衍生的成纤维细胞传代培养2或3代，将细胞与明胶或4型胶原蛋白反应，并且分离粘附于明胶或4型胶原蛋白的细胞，`并且通过分离方法分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞。
[0047]反应可以进行1-5分钟，特别是4-5分钟。如果反应时间短于I分钟，则不能以良好的产量获得干细胞。并且，如果反应时间长于5分钟，其他成纤维细胞可能混入干细胞中。也就是说，如果反应时间为约5-30分钟，那么粘附于4型胶原蛋白或明胶的细胞中的约50-60%是由于重力而粘附的其他成纤维细胞。
[0048]明胶或4型胶原蛋白的浓度可以为0.1-1% (对于明胶，重量/溶剂体积)或10-30 μ g/mL (对于4型胶原蛋白)。溶剂可以是蒸馏水，特别是三重蒸馏水。可以将胶原蛋白在0.25%乙酸中制成lmg/mL母液,然后用三重蒸懼水稀释,供使用。
[0049]此外，明胶或4型胶原蛋白可以在0-10°C，特别是4°C下，在基质上涂覆16-24小时。
[0050]基质可以选自聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯-聚丙烯共聚物、金属、硅和玻璃，但不限于此。金属可以是镍、金或银，但不限于此。特别是，基质可以是常用的培养容器。基质的形状没有特别限制。例如，基质可以是球形颗粒、平板、管等形式。可以根据已知方法来进行涂覆。
[0051]所述分离方法可以进一步包括确认与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，分离的细胞是否超表达选自Sox2 (SRY (性别决定区Y)-盒2)和SlOOb (S100钙结合蛋白B)的一种或多种基因。
[0052]所述分离方法可以进一步包括，确认与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，分离的细胞是否超表达一种或多种生长因子，所述生长因子选自EGF (表皮生长因子)、FGF4 (成纤维细胞生长因子4)、H)GF-AA (血小板衍生的生长因子-AA)、VEGFR-2 (血管内皮生长因子受体2)、VEGFR-3 (血管内皮生长因子受体3)和VEGF-D (血管内皮生长因子D)。与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，本发明分离的皮肤真皮衍生的成体干细胞可以超表达选自EGF(表皮生长因子)、FGF4 (成纤维细胞生长因子4)、PDGF-AA (血小板衍生的生长因子-AA)、VEGFR-2 (血管内皮生长因子受体2)、VEGFR-3 (血管内皮生长因子受体3)和VEGF-D (血管内皮生长因子D)的一种或多种生长因子。
[0053]本发明还提供了用于分化人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，包括将通过分离方法分离的人皮肤真皮衍生的成体干细胞分化成成骨细胞或脂肪细胞，并且提供了由人皮肤真皮衍生的成体干细胞分化的成骨细胞或脂肪细胞。
[0054]在分化方法中，可以将分离的干细胞在成骨分化培养基(hMSC间充质干细胞成骨分化培养基，Lonza PT-3002)中分化14天，同时每2_3天更换一次培养基(参见实施例4)。所述分化方法可以进一步包括，确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，分化的细胞是否超表达选自OGN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一种或多种基因。与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，本发明中分化的成骨细胞可以超表达选自OGN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一种或多种基因。
[0055]在分化方法中，可以将分离的干细胞在脂肪生成分化培养基中分化7天，所述培养基特别是DMEM培养基，更特别是含有10%胎牛血清、0.1%胰岛素、I μ M地塞米松、0.5mMIBMX和I μ M曲格列酮的DMEM培养基，同时以2_3天的间隔更换培养基(参见实施例5)。所述分化方法可以进一步包括，确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，分化的细胞是否超表达选自PPARG (过氧化物酶体增殖因子激活受体Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂联素，含ClQ和胶原蛋白结构域)和FABP4 (脂肪结合蛋白4，脂肪细胞)的一种或多种基因。与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，本发明分化的脂肪细胞可以超表达选自PPARG、LEP、AdipoQ和FABP4的一种或多 种基因。
[0056]本发明还提供了用于骨生成或脂肪生成的组合物，其含有皮肤真皮衍生的成体干细胞、由皮肤真皮衍生的成体干细胞分化的成骨细胞或由皮肤真皮衍生的成体干细胞分化的脂肪细胞，作为活性成分。
[0057]本发明组合物的组合物提供了预防和治疗骨质疏松、预防和治疗皮肤老化、治疗皮肤创伤、促进皮肤血液循环、增强皮肤体积或植皮的作用。组合物可以是通常施用于皮肤的任何形式。特别是，其可以是外部施用于皮肤上的组合物，如化妆品组合物或药物组合物。
[0058]化妆品组合物可以是例如基础化妆品组合物、彩妆化妆品组合物、头发化妆品组合物、身体化妆品组合物等，并且配方类型没有特别限制。
[0059]例如，化妆品组合物可以配制成溶液、悬浮液、乳剂、糊状物、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、肥阜、含表面活性剂清洁剂、油、粉底(powder fundation)、乳液底妆(emulsionfoundation)、腊质底妆(wax foundation)、喷雾剂等,但不限于此。更特别是,可以配制成基础化妆品，如软化洗剂、营养洗剂、牛奶洗剂、身体洗剂、营养霜、按摩霜、保湿霜、护手霜、精油、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、洁肤水、粉饼(pack)、凝胶、贴剂、水包油型(0/W)乳剂、油包水型(0/W)乳剂等，彩妆，如唇膏、隔离霜、粉底等，清洁剂，如洗发水、漂洗剂、身体清洁剂、牙膏、漱口水等，或头发护理化妆品，如生发油、头发定型剂，例如，凝胶或摩丝，染发剂等。
[0060]化妆品组合物可以含有化妆品可接受的介质或基质，并且可以作为任何局部施用制剂来提供，例如，溶液、凝胶、无水固体或糊状物、水包油型乳剂、悬浮液、微乳剂、微胶囊、微粒、离子囊泡分散体(脂质体)和/或非离子囊泡分散体、霜剂、护肤洗剂、牛奶洗剂、粉剂、膏剂、喷雾剂或遮瑕棒(conceal stick)。可以根据本领域常用的方法来制备这些组合物。
[0061]当本发明的制剂是溶液或乳剂时，可以将溶剂、溶解剂或乳化剂用作载体。例如，可以使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、甘油脂族酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。
[0062]当本发明的制剂是悬浮液时，液体稀释剂，如水、乙醇或丙二醇，悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、斑脱土、琼脂、黄苗胶等,可以用作载体。
[0063]当本发明的制剂是糊状物、霜剂或凝胶时，动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、斑脱土、硅石、滑石、氧化锌等，可以用作载体。
[0064]当本发明的制剂是粉末或喷雾剂时，乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末可以用作载体。特别是，当制剂是喷雾剂时，其可以进一步含有推进剂，如氯氟烃、丙烷/ 丁烷或二甲醚。
[0065]当本发明的制剂是含表面活性剂的清洁剂时，脂族醇硫酸酯、脂族醇醚硫酸酯、磺基琥拍酸单酯、轻乙基磺酸酯(isethionate)、咪唑啉(imidazolinium)衍生物、甲基牛磺酸酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜碱、脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等，可以用作载体。
[0066]在本发明的示例性实施方案中，本发明的化妆品组合物可以进一步含有增稠剂。本发明的化妆品组合物中所含的增稠剂可以是甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基羟基鸟嘌呤、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧基乙烯基聚合物、聚季铵盐、鲸蜡硬脂醇、硬脂酸、卡拉胶等。特别是，可以使用选自羧甲基纤维素、羧基乙烯基聚合物和聚季铵盐中的一种或多种。最特别是，可以使用羧基乙烯基聚合物。
[0067]在本发明的示例性实施方案中，所述化妆品组合物可以按照需要含有各种适当的基质和添加剂，它们的种类和含量是本领域技术人员容易确定的。所述化妆品组合物可以含有本领域常用的可接受的添加剂，如防腐剂、着色剂等。
[0068]特别是，防腐剂可以是苯氧乙醇、1，2-己二醇等，并且可以使用合成香精。
[0069]此外，本发明的化妆品组合物可以含有选自水溶性维生素、油溶性维生素、多肽、多糖、鞘脂和海藻提取物的物质。此外，其可以进一步含有油、脂肪、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机或无机色素、有机粉末、UV吸收剂、防腐剂、消毒剂、抗氧化剂、植物提取物、pH控制剂、醇、着色剂、香精、血液循环刺激剂、冷却剂、止汗剂、纯水等。
[0070]然而，可以包含在化妆品组合物中的成分不限于此。并且，可以在没有不利地影响本发明的目的和作用的范围内确定成分的含量。
[0071]在本发明的示例性实施方案中，可以通过将常用的无机或有机载体、赋形剂或稀释剂加入作为活性成分的皮肤真皮衍生的成体干细胞中，将药物组合物制成用于非肠道给药的固体、半固体或液体制剂。用于非肠道给药的制剂可以是用于经皮给药的选自滴剂、膏剂、洗剂、凝胶剂、霜剂、贴剂、喷雾剂、悬浮剂和乳剂的制剂，但不限于此。
[0072]可以包含在组合物中的载体、赋形剂或稀释剂可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、寡糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
[0073]组合物的每种制剂可以进一步含有本领域技术人员考虑到制剂类型、使用目的等而毫无困难地选择的上述成分。
[0074]此外，当本发明的组合物用作药物组合物时，其可以进一步含有药物佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿或乳化促进剂、用于控制渗透压的盐或缓冲剂等，或其他治疗上有用的物质，并且可以根据常用方法制成用于口服或非肠道给药的各种制剂。
[0075]将考虑相关因素来确定活性成分的实际给药剂量，所述相关因素如病症的严重程度、选择的给药途径、个体的年龄、性别、体重和身体状况等。
[0076]活性成分的一般给药剂量为约0.001-2000mg/kg/天，更特别为0.5-2.5mg/kg/天。皮肤上的外部应用可以一天进行一次或几次。
实施例
[0077]下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，以下实施例只是用于说明性的目的，并且本领域技术人员将清楚本发明的范围不受实施例的限制。
[0078][实施例1]使用明胶或4型胶原蛋白从人真皮衍生的成纤维细胞分离RA/SA细胞
[0079]人真皮衍生的成纤维细胞(正常人真皮成纤维细胞，NHDF)购自Lonza，Inc.(ffalkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511)。将人真皮衍生的成纤维细胞在CO2培养箱中，在37°C和5%C02的条件下，在75-cm2T-烧瓶上进行传代培养。
[0080]将5mL0.1-1%明胶或10-30 μ g/mL4型胶原蛋白涂覆在IOOim培养皿上，在4°C下持续16-24小时。使用0`.25%胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA)从100-mm培养皿中分离人真皮衍生的成纤维细胞后，将细胞在1200rpm下离心5分钟。除去培养基后，将细胞加入5mLDMEM培养基中，然后悬浮。然后,将细胞在培养皿上孵育,所述培养皿上已经用明胶或4型胶原蛋白涂覆了 5分钟，并且按照粘附于培养皿的细胞(RA ;快速粘附)和在5分钟内没有粘附于培养皿但在4小时内粘附的细胞(SA:缓慢粘附)进行分离。
[0081][实施例2]分离的RA/SA细胞的集落形成试验
[0082]进行集落形成试验来比较使用明胶或4型胶原蛋白分离的RA/SA细胞的集落形成能力(干性)。
[0083]将分离的RA/SA细胞接种于6-孔培养皿上，I X IO2个细胞/孔。培养14天后，用含有10%乙醇和0.1%结晶紫的溶液将细胞在室温下染色5分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤4次，并且在显微镜下观察。
[0084]结果显示于图1中。如从图1中可以看到的，分离的RA细胞显示出提高的集落形成能力(下文中，将RA细胞称为人真皮衍生的成体干细胞，而将SA细胞称为人真皮衍生的成纤维细胞)。本发明的发明人已经将本发明中分离的人真皮衍生的成体干细胞在2011年8月8日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为 KCTCl 1995BP。
[0085][实施例3]通过测量mRNA表达选择人真皮衍生的成体干细胞的遗传标志物
[0086]用2mL PBS洗涤实施例1中分离的人真皮衍生的成体干细胞和真皮衍生的成纤维细胞，并且使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlasbad, CA, USA)从细胞分离RNA。使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen, Valencia, CA),将分离的RNA再纯化一次，并且使用Agilent2100 生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)分析 RNA 的质量° 使用 Superscript Reverse Transcriptase (RT)试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)由RNA合成cDNA，并且通过实时逆转录聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)定量分析。
[0087]使用TaqMan 基因表达试验试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA)(Sox2基因引物:Hs01053049_sl，SlOOb基因引物:Hs00389217_ml)分析了分离的人真皮衍生的成体干细胞和真皮衍生的成纤维细胞中Sox2和SlOOb基因的表达模式的变化，已知Sox2和SlOOb基因是成体干细胞的特征性遗传标志物。结果显示于图2的a和b中。与人真皮衍生的成纤维细胞相比，分离的人真皮衍生的成体干细胞显示出基因的表达高约2-3倍。此外，研究了巢蛋白(Hs00707120_sl)和波形蛋白(Hs00185584_ml)基因的表达，用于与之前已知的呈现出巢蛋白_/波形蛋白+的人真皮衍生的成体干细胞进行比较。在本发明分离的人真皮衍生成体干细胞中巢蛋白(Hs00707120_sl)和波形蛋白(Hs00185584_ml)都得到了表达，并且与真皮衍生的成纤维细胞相比，发现表达水平没有差异(图2的c和d)。因此，可以看出，本发明分离的人真皮衍生的成体干细胞是之前没有鉴定过的新的真皮衍生的成体干细胞。
[0088]使用P < 0.05,通过成对斯氏t检验(Student’s t_test)测试时,表达的增加是统计学显著的。
[0089][实施例4]人真皮衍生的成体干细胞分化能力的确认
[0090]为了确认使用明胶或4型胶原蛋白分离的人真皮衍生的成体干细胞的分化能力，诱导细胞分化成成骨细胞和脂肪细胞。
[0091]使用Lonza, In c.(ffalkersville, MD, USA)的成骨分化培养基(hMSC间充质干细胞成骨分化培养基，PT-3002)来诱导向成骨细胞的分化。将分离的人真皮衍生的成体干细胞和真皮衍生的成纤维细胞接种于6-孔培养皿上，20 X IO4个细胞/孔，并且使用成骨分化培养基诱导分化14天，通过基因表达试验来证实这一情况。
[0092]使用含有10%胎牛血清、0.1%胰岛素、I μ M地塞米松、0.5mMIBMX和I μ M曲格列酮的DMEM培养基诱导向脂肪细胞的分化。将分离的人真皮衍生的成体干细胞和真皮衍生的成纤维细胞接种于6-孔培养皿上，20 X IO4个细胞/孔，并且使用脂肪生成分化培养基诱导分化7天，通过基因表达试验来证实这一情况。
[0093][实施例5]测量由分离的人真皮衍生的成体干细胞和真皮衍生的成纤维细胞分化的成骨细胞和脂肪细胞中的分化生物标志物的表达
[0094]诱导分离的人真皮衍生的成体干细胞和真皮衍生的成纤维细胞各自分化成成骨细胞和脂肪细胞后，使用TaqMan基因表达试验试剂盒(Applied Biosystems, Foster City,CA) (0GN 基因引物:Hs00247901_ml, ACAN 基因引物:Hs00153936_ml, PPARG 基因引物:Hs01115513_ml，瘦素基因引物:Hs00174877_ml, AdipoQ 基因引物:Hs00605917_ml, FABP4基因引物:Hs01086177_ml)，以与实施例3中的相同方式评价了 OGN和ACAN(它们是成骨细胞的生物标志物)以及PPARG、瘦素、AdipoQ和FABP4 (它们是脂肪细胞的生物标志物)的表达模式的变化。结果显示于图3和图4中。与真皮衍生的成纤维细胞相比，分离的人真皮衍生的成体干细胞显示出基因的表达高约2倍。使用P < 0.05，通过成对斯氏t检验测试时，表达的增加是统计学显著的[0095][实施例6]分离的人真皮衍生的成体干细胞中特异性分泌的生长因子的选择
[0096]使用生长因子阵列(Raybio, Norcross, GA, USA),研究了从分离的人真皮衍生的成体干细胞的培养物分泌的生长因子的表达模式。
[0097]将分离的人真皮衍生的成体干细胞和真皮衍生的成纤维细胞接种于6-孔培养皿上，20X 104个细胞/孔。培养细胞后，使用生长因子阵列测试培养物。用2mL阻断缓冲剂在室温下将细胞培养物处理30分钟，然后将ImL培养物在室温下孵育2小时。随后，用2mL洗涤缓冲液洗涤5分钟5次后，将培养物在室温下与生物素化抗生长因子抗体反应2小时。用2mL洗涤缓冲液进一步洗涤5分钟5次后，用2mL HRP缀合的链霉抗生素处理培养物，孵育2小时，用洗涤缓冲液洗涤，用检测缓冲液孵育并用LAS-3000 (Fuji Film)显影。
[0098]分析了总共41种生长因子。与人真皮衍生的成纤维细胞的培养物相比时，人真皮衍生的成体干细胞的培养物显示出生长因子EGF、FGF4、PDGF-AA, VEGFR-2、VEGFR-3和VEGF-D有10%或更高的增加(图5)。特别是，由于EGF和FGF4是表皮和成纤维细胞生长的重要生长因子，因此预期本发明分离的人真皮衍生的成体干细胞有助于治疗和恢复老化或受损的真皮。此外，由于VEGFR-2、VEGFR-3和VEGF-D是参与血管生成的重要生长因子，因此本发明中分离的人真皮衍生的成体干细胞可以通过允许毛细血管的生长或移动确保将营养物供应给真皮(参见图6和图7)。
[0099]使用P ( 0.05，通过成对斯氏t检验测试时，生长因子表达的提高是统计学显著的。
`[0100]尽管已经显示和描述了示例性实施方案，但本领域技术人员将理解，在没有脱离本发明所附权利要求限定的精神和范围的情况下，可以对其进行形式和细节的各种变化。
[0101]此外，可以进行许多改变，使得特定的情况或材料适用于本发明的教导，而没有脱离其基本范围。因此，确定本发明不限于预期作为实施本发明的最佳方式公开的特定示例性实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求范围内的所有实施方案。
[0102][保藏号]
[0103]保藏机构:韩国生物科学与生物技术研究所
[0104]保藏号:KCTC11995BP
[0105]保藏日:2011年8月8日
[0106]国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
[0107]国际表
[0108]原始保藏情况收条
[0109]按照Rule7.1
[0110]至:沈重炫
[0111]株式会社爱茉莉太平洋技术研究院
[0112]大韩民国446-729京畿道龙仁市器兴区甫罗洞
[0113]314-1
[0114]
【权利要求】
1.人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，选自Sox2 (SRY (性别决定区Y)-盒2)和SlOOb (S100钙结合蛋白B)的一种或多种基因是超表达的。
2.根据权利要求1所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞,其中通过传代培养人皮肤真皮衍生的成纤维细胞、将所述细胞与明胶或4型胶原蛋白反应以及分离粘附于所述明胶或4型胶原蛋白的所述细胞来获得所述干细胞。
3.根据权利要求2所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中通过将所述成纤维细胞与明胶或4型胶原蛋白反应1-5分钟来获得所述干细胞。
4.根据权利要求2所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中所述明胶溶解于蒸馏水中至0.l-lwt%的浓度，而所述4型胶原蛋白溶解于蒸馏水中至10-30 μ g/mL的浓度。
5.根据权利要求2所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中所述明胶或4型胶原蛋白在0-10°C下在基质上涂覆16-24小时。
6.根据权利要求1所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中所述干细胞是与人皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比选自EGF (表皮生长因子)、FGF4 (成纤维细胞生长因子4)、PDGF-AA (血小板衍生的生长因子-AA)、VEGFR-2 (血管内皮生长因子受体2)、VEGFR-3 (血管内皮生长因子受体3)和VEGF-D (血管内皮生长因子D)的一种或多种生长因子超表达的干细胞。
7.根据权利要求1所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞，其中所述干细胞是保藏号为KCTCl 1995BP的干细胞。
8.由权利要求1所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞分化的成骨细胞或脂肪细胞。·
9.根据权利要求8所述的成骨细胞，其中所述成骨细胞是与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比选自OGN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一种或多种基因超表达的成骨细胞。
10.根据权利要求8所述的脂肪细胞，其中所述脂肪细胞是与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比选自PPARG (过氧化物酶体增殖因子激活受体Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂联素，含ClQ和胶原蛋白结构域)和FABP4 (脂肪结合蛋白4，脂肪细胞)的一种或多种基因超表达的脂肪细胞。
11.一种用于骨生成或脂肪生成的组合物，其包含权利要求1至10中任一项所述的人皮肤真皮衍生的成体干细胞、成骨细胞或脂肪细胞作为活性成分。
12.根据权利要求11所述的用于骨生成或脂肪生成的组合物，其中所述组合物提供预防和治疗骨质疏松、预防和治疗皮肤老化、治疗皮肤创伤、促进皮肤血液循环、增强皮肤体积或植皮的作用。
13.一种用于分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，包括传代培养人皮肤真皮衍生的成纤维细胞，将所述细胞与明胶或4型胶原蛋白反应，以及分离粘附于所述明胶或4型胶原蛋白的所述细胞。
14.根据权利要求13所述的用于分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，其中将所述成纤维细胞与明胶或4型胶原蛋白反应1-5分钟。
15.根据权利要求13所述的用于分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，其中将所述明胶溶解于蒸馏水中至0.l-lwt%的浓度，而将所述4型胶原蛋白溶解于蒸馏水中至10-30 μ g/mL的浓度，然后与所述成纤维细胞反应。
16.根据权利要求13所述的用于分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，其中将所述明胶或4型胶原蛋白在0-10°C下在基质上涂覆16-24小时，然后与所述成纤维细胞反应。
17.根据权利要求13所述的用于分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，其进一步包括确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，选自Sox2 (SRY (性别决定区Y)-盒2)和SlOOb (S100钙结合蛋白B)的一种或多种基因是否超表达。
18.根据权利要求13所述的用于分离人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，其进一步包括确认与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比，选自EGF (表皮生长因子)、FGF4 (成纤维细胞生长因子4XF1DGF-AA (血小板衍生的生长因子-AA)、VEGFR_2 (血管内皮生长因子受:体2)、VEGFR-3 (血管内皮生长因子受体3)和VEGF-D (血管内皮生长因子D)的一种或多种生长因子是否超表达。
19.一种用于分化人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，包括将通过根据权利要求13至18中任一项的所述方法分离的所述人皮肤真皮衍生的成体干细胞分化成成骨细胞或脂肪细胞。
20.根据权利要求19所述的用于分化人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，其包括: 在成骨分化培养基中分化所述分离的干细胞；和 确认所述分化的细胞与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比是否超表达选自OGN (骨甘氨酸)和ACAN (聚集蛋白聚糖)的一种或多种基因。
21.根据权利要求19所述的用于分化人皮肤真皮衍生的成体干细胞的方法，其包括: 在脂肪生成分化培养基中分化所述分离的`干细胞；和 确认所述分化的细胞与皮肤真皮衍生的成纤维细胞相比是否超表达选自PPARG (过氧化物酶体增殖因子激活受体Y)、LEP (瘦素)、AdipoQ (脂联素，含ClQ和胶原蛋白结构域)和FABP4 (脂肪结合蛋白4，脂肪细胞)的一种或多种基因。
【文档编号】C12N5/077GK103827294SQ201280041267
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年8月24日 优先权日:2011年8月24日
【发明者】沈重铉, 梁承夏, 李泰龙, 姜鹤熙, 申东旭 申请人:株式会社爱茉莉太平洋