芳族分子的重组生产系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在原核和真核宿主，如大肠杆菌(E.coli)、酵母、丝状真菌、藻类、微藻、其它植物细胞中生产芳族分子。
【专利说明】芳族分子的重组生产系统
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年6月23日提交的美国临时申请第61/500，518号和2012年I月5日提交的第61/583，325号的权益，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及在原核和真核宿主，如大肠杆菌(E.coli)、酵母、丝状真菌、藻类、微藻、其它植物细胞中生产芳族分子。
[0004]发明背景
[0005]目前存在从可再生资源中生产许多特种化学品和液体燃料的未实现的需要。尽管对地球的海洋和大气环境有很大的负面影响，大部分化学化合物和机动车燃料仍来源于化石燃料如原油、煤焦油、页岩油等。特别注意，简单酚类化合物如甲酚在过程中主要提取自煤焦油，该过程对环境有如此的负面影响以致专门生产甲酚的美国工厂近年来已关闭。然而，这不是全球性的方案，因为该问题可以简单地被转移到另一地理位置。合成生物学提供了制造某些特种化学品如这些的可能方案。
[0006]一般以类似于脂肪酸合成的方式通过缩合二碳单元来合成聚酮化合物。通常，合成包括启动单元和扩展单元；这些“二碳”单元来源于例如酰基硫酯，通常为乙酰基、丙酰基、丙二酰基或甲基丙二酰基辅酶-A硫酯。有四类聚酮化合物合酶(PKS)，其不同之处在于使用催化位点的“方式”(Watanabe and Ebizuka，2004)。I型模块化PKS是有多个“模块”的单个蛋白，其含有以线性“装配线”类型仅使用一次的催化位点。I型迭代PKS是具有重复使用以得到最终聚酮化合物产物的位点的单个蛋白。本发明可从每个类型中采用编码序列，但在优选实施方案中，采用的PKS将主要来源于例如芳族6-甲基水杨酸合酶，或苔色酸合酶，或这些酶的修饰形式的这类PKS。在异源微生物如酵母和大肠杆菌中，编码I型PKS多肽组分的基因已经被用于聚酮化合物的微生物生产。参见例如美国专利N0.6，033，883、N0.6，258，566 和 N0.7，078，233。
[0007]II型PKS包含多个蛋白，其中每个蛋白具有单个单官能活性位点。活性位点可以只用一次或重复使用。最后，III型PKS是具有多个模块的单个蛋白，其中活性位点被重复使用。
[0008]PKS以与脂肪酸合酶(FAS)类似的方式工作。脂肪酸通常由疏水性组分组成，且可用作能源如在生物燃料中。许多真核生物使用共同的或相似的代谢途径合成脂肪酸。在种子中，储存作为甘油三酯一部分的脂肪酸作为能量来源用于进一步的发芽。FAS途径位于质体中。通过冷凝酶β -酮酰-ACP合酶(KAS) III形成乙酰-ACP (酰基载体蛋白)。延长乙酰-ACP至长链脂肪酸包括丙二酰-ACP的2-碳单元的循环缩合作用以形成更长的酮酰-ACP(i3-酮 酰-ACP合酶)、酮基官能团到醇的还原(β-酮酰-ACP还原酶)、形成烯酰-ACP的脱水(β -羟酰-ACP脱水酶)，以及最后还原烯酰-ACP以形成细长饱和的酰基-ACP (烯酰-ACP还原酶)。β -酮酰-ACP合酶I (KAS I)主要负责延伸至棕榈酰_ACP(C16:0)，而β-酮酰-ACP合酶II (KAS II)主要负责最终延伸至硬脂酰ACP(C18:0)。
[0009]类似地，通过示于图1和2的生物合成途径，迭代芳族PKS利用从丙二酰-ACP的
2-碳单元的缩合以形成产物如6-甲基水杨酸出-MSA)，也称为2-羟基-6-甲基苯甲酸(HMBA)和苔色酸(OSA)。通过简单地“敲除”酮还原酶(KR)结构域的催化活性可工程化细菌6-MSAS以合成OSA这一事实,这些途径的灵活性得以强调(Ding等，Chemistry&Biologyl7, 495-503，2010)。
[0010]本发明提供在杀微生物、药物和可再生的液体燃料领域有多用途的分子和前体分子的生产系统。在一些实施方案中，添加用于酰基运载蛋白泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylation)(即，用完整的ACP合酶,也称为PPT酶)的机器可在非必须天然生产此类分子的宽范围的宿主中生产所述分子。
[0011]由此从微生物宿主直接或间接获得的芳族分子，如甲酚、苔黑素、羟甲基苯甲酸及其同源的醚、酯和内酯，生成均相或非均相的化合物制剂，其或可进一步处理以生成适合用作杀微生物剂、药物、维生素、 调味剂或可再生能源(如燃料、燃料添加剂例如含氧化合物、燃料辅助剂即高辛烷值汽油掺合剂等)的化合物。
[0012]附图简述
[0013]图1 描述了 6-MSA 的生物合成途径(Beck 等，Eur J Biocheml92:487-498 (1990))。
[0014]图2描述了 6-MSA和OSA的生物合成途径(Ding等，Chemistry andBiologyl7:495-503(2010))ο
[0015]发明概述
[0016]本发明涉及原核和真核宿主，如大肠杆菌、酵母、丝状真菌、藻类、微藻、其它植物细胞等中芳族分子的生产。一方面，用官能化的芳族聚酮化合物合酶(PKS)获得分子，并且所得的各种分子在体内转化来制造具有杀微生物或药物用途的特种化学品。此外，本发明涉及具有杀微生物或药物用途的化合物前体的生产。一方面，进一步处理前体以生成可以是其它特种化学品和聚合物前体的高辛烷值的芳族或环己烷和环己醇样分子。处理过的前体可与基于石油的和喷射燃料相容，并因此可用作可再生能源。
[0017]本发明涉及在多种宿主中产生和衍生聚酮化合物的重组材料以及所产生的聚酮化合物及其衍生物。如本领域所知，单个或多个载体可用于构建产生化合物的宿主。单个载体允许宿主细胞最小的处理能力，多个载体促进体内进一步转化的能力，并且可以更灵活地设计各种新的合成途径。
[0018]在一个实施方案中，本发明提供修饰的重组宿主细胞以产生酚类化合物，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列。在另一个实施方案中，宿主细胞还包含ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylates)。在另外的实施方案中，宿主细胞还包含iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在一个其它实施方案中，从所述细胞分离的产物是酚类化合物。在另一个实施方案中，芳族PKS是原核生物的6-甲基水杨酸合酶。在一个其它实施方案中，原核生物6-MSAS的表达系统包含存在于相同载体上或独立载体上的官能化脱羧酶。在一个其它实施方案中，芳族PKS由野生型形式的抗生链霉菌(S.antibioticus)的ChlBl基因编码。在一个另外的实施方案中，能被细胞产生并且能从细胞分离的酚类化合物是间甲酚。
[0019]在一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在另一个实施方案中，芳族PKS是真菌的6-甲基水杨酸合酶。在另外的实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在另一个实施方案中，能被细胞产生并且能从细胞分离的酚类化合物是苔黑酚。
[0020]在另一个实施方案中，编码脱羧酶的核苷酸序列选自由展青霉(P.patulum)的6-MSA脱羧酶基因、棒曲霉(Aspergillus clavatus)的PatG基因、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)的OSA脱竣酶基因、曲霉属(Aspergillus)种的2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶基因和少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis) SYK-6的5-羧基香草醒脱羧酶基因组成的组。
[0021]在另一个实施方案中，所述PKS的表达系统和所述完整的ACP合酶的表达系统存在于相同的载体上。在其它实施方案中，所述PKS的表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统存在于独立载体上。在一个其它实施方案中，PKS和所述完整的ACP合酶由双顺反子信使RNA表达。
[0022]在一个其它实施方案中，包含官能化脱羧酶表达系统的修饰的细胞存在于与所述最小PKS的表达系统或所述完整的ACP合酶的所述表达系统的相同载体上，或独立载体上。在另一个实施方案中，所述最小PKS的表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统以及官能化脱羧酶的所述表达系统存在于相同的载体上。在一个实施方案中，一个、两个或所有三个所述表达系统整合到宿主细胞染色体或由酵母人工染色体(YAC)表达。在其它实施方案中，表达的PKS、 完整的ACP合酶和脱羧酶的至少两种来源于多顺反子信使RNA。在另一个实施方案中，宿主生物体选自由毕赤酵母(Pichia pastoris)和曲霉属种组成的组。在一个实施方案中，宿主生物体是黑曲霉(Aspergillus niger)。在另一个实施方案中，黑曲霉不含完整的ACP合酶的异源表达系统。
[0023]另一方面，本发明提供生产酚类化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤:a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸出-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述方法还包括b)在重组宿主细胞中生产酚类化合物中间体。在一个其它实施方案中，该方法还包括c)从酚类化合物中间体合成酚类化合物，其中重组脱羧酶催化酚类化合物中间体脱羧以形成酚类化合物。在一个实施方案中，酚类化合物中间体是6-MSA。在另一个实施方案中，酚类化合物是间甲酚。
[0024]在一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在另一个实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在一些实施方案中，酚类化合物中间体是苔色酸(OSA)。在其它实施方案中，酚类化合物是苔黑酚。
[0025]另一方面，本发明提供生产酚类化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸出-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和?)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化。在一个实施方案中，该方法还包括b)分离产生于重组宿主细胞的酚类化合物中间体。在一个实施方案中，所述方法还包括c)通过用金属催化剂(或其它类型的催化剂)加热然后蒸馏，使步骤b)的酚类化合物中间体脱羧以形成酚类化合物。在另外的实施方案中，酚类化合物中间体是6-MSA。在其它实施方案中，酚类化合物是间甲酚。在一个实施方案中，金属催化剂是粉末形式。在另一个实施方案中，金属催化剂为锌催化剂。
[0026]在一个其它方面，本发明提供修饰的重组宿主细胞以生产烷基化的酚类化合物。在一个实施方案中，所述细胞包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸出-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列，和(iv)第四表达系统，该系统包含至少一个编码O-甲基转移酶(OOMT)的核苷酸序列。在一个实施方案中，能被细胞产生并且能从所述细胞分离的产物是烷基化的酚类化合物。在一个实施方案中，烷基化酚类化合物是3-甲基苯甲醚。
[0027]在一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在另一个实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在一个另外的实施方案中，烷基化的酚类化合物是3，5- 二甲氧基甲苯。
[0028]在另外的实施方案中，OOMT由选自由OOMT1、00MT2、00MT3、00MT4、COMTl组成的组的月季(Rosa chinensis)基因编码。
[0029]另一方面，本发明提供生产烷基化酚类化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该方法还包括b)分离产生于重组宿主细胞的酚类化合物中间体。在一个实施方案中，所述方法还包括c)通过用烷基化试剂进行处理，使步骤b)的酚类化合物中间体烷基化以形成烷基化的酚类化合物。在另一个实施方案中，烷基化试剂是甲醇。
[0030]在一个实施方案中，烷基化的酚类化合物中间体是间甲酚。在另一个实施方案中，烷基化的酚类化合物是3-甲基苯甲醚。
[0031]在另一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在一个实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在一个实施方案中，烷基化的酚类化合物中间体是苔黑酚。在一个其它实施方案中，烷基化的酚类化合物是3，5- 二甲氧基甲苯。
[0032]另一方面，本发明提供生产邻苯二甲酸酐化合物的方法，该方法包括a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸出-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化。在另一个实施方案中，所述方法还包括b)分离产生于重组宿主细胞的邻苯二甲酸酐中间体化合物。在一个其它实施方案中，该方法还包括C)通过用氧化剂进行处理，使步骤b)的邻苯二甲酸酐中间体化合物氧化以形成邻苯二甲酸酐化合物。在一个实施方案中，邻苯二甲酸酐中间体化合物是6-MSA。在另一个实施方案中，邻苯二甲酸酐是
3-羟基邻苯二甲酸酐。
[0033]发明描述
[0034]除非另有定义，否则本文所用的所有领域术语、表示法和其它科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为清楚和/或便于参考起见，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文此类定义的包括不必被解释为与本领域通常所理解的相比表示出显著不同。本文所描述或引用的技术和程序通常被很好地理解，且通过使用常规方法被本领域技术人员通常采用，诸如，例如，广泛使用的分子克隆技术描述于 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 2 版(1989) ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.。视情况，涉及使用可商购的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的协议和/或参数来实施，除非另外说明。在本方法之前，描述了试剂盒和其使用，应当理解本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建体和试剂，这些当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并非旨在限定本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求限定。
[0035]必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“和”以及“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确指出。
[0036]本说明书和权利要求中，词语“包含(comprise) ”或变体如“包含(comprises) ”或“包含(comprising) ”将被理解成意指包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其它整数或整数的组。
[0037]〃PKS〃是指聚酮化合物合酶(例如，6-MSAS或0SAS)。
[0038]〃ACP〃是指酰基载体蛋白。
[0039]"ACPS"是指酰基载体蛋白合酶(例如完整的ACP合酶)。
[0040]〃DC 〃是指脱羧酶。
[0041]〃PKS*〃是指修饰的聚酮化合物合酶或PKS变体(例如，具有失活的酮还原酶结构域的PKS)。
[0042]〃6_MSAS〃是指6_甲基水杨酸合酶。
[0043]"0SAS"是指苔色酸合酶。
[0044]"00ΜΤ"是指苔黑酚O-甲基转移酶。
[0045]"6-MSA"是指6-甲基水杨酸。
[0046]〃0SA〃是指苔色酸。
[0047]〃HMBA〃是指2_羟基_6_甲基苯甲酸。
[0048]本说明书中引用的所有专利、专利申请和文献参考资料在此通过引用整体并入本文。
[0049]本发明提供以快速、廉价和有效的方式生产所关注的有机化合物的方法和材料。因此，本发明满足了许多商业和工业需要。术语“有机分子”是指例如主要由碳和氢原子组成的任何分子，诸如，例如，芳香族化合物。所关注的有机化合物包括但不限于酚类或酚类化合物，如6-MSA/HMBA、0SA、间甲酚、苔黑酚、3-甲基苯甲醚、3，5-二甲氧基甲苯，和邻苯二甲酸酯如邻苯二甲酸酐(例如，3-羟基邻苯二甲酸酐)。
[0050]特别地，本发明涵盖从可再生资源中微生物生产所关注的化合物(例如，间甲酚，苔黑酚、甲基苯甲醚)及其衍生物。使用官能化芳族聚酮化合物合酶(PKS)获得芳族化合物，且将得到的各种分子在体内转化来制备特种化学品用于杀微生物或药物使用，或者制备化合物前体用于杀微生物或药物使用，或者进一步处理以得到能作为其它特种化学品和聚合物前体的高辛烷值的芳族或环己烷和环己醇样分子，或与基于石油和喷射的燃料相容，并因此能用作可再生能源。
[0051]一方面，本发明涉及酚类、酚类化合物和酚类化合物中间体的合成。如本文所用，酚类或酚类化合物是指有机化合物，其包括键合到羟基基团(-0H)的苯基基团(-C6H5)。
[0052]苯酚
[0053]
【权利要求】
1.一种用于生产酚类化合物的修饰的重组宿主细胞，其包含 i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列，和 ?)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化，和 iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列， 使得从所述细胞分离的产物是酚类化合物。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的酚类化合物是间甲酚。
3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的酚类化合物是苔黑酚。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。
5.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是真菌的6-甲基水杨酸合酶。
6.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是原核生物的6-甲基水杨酸合酶。
7.根据权利要求6所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS由野生型形式的抗生素链霉菌的ChlBl基因编码。
8.根据权利要求3所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的细胞，其中编码所述的脱羧酶的所述的核苷酸序列选自由展青霉的所述6-MSA脱羧酶基因、棒曲霉的所述PatG基因、粉红粘帚霉的所述OSA脱羧酶基因、曲霉属物种的所述2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶基因和少动鞘氨醇单胞菌SYK-6的所述5-羧基香草醛脱羧酶基因组成的组。
10.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述PKS的所述表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统存在于相同的载体上。
11.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述PKS的所述表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统存在于独立的载体上。
12.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述PKS和所述完整的ACP合酶表达自双顺反子信使RNA。
13.根据权利要求6所述的修饰的细胞，其中功能化脱羧酶的表达系统存在于相同的载体上，或独立的载体上。
14.根据权利要求7所述的修饰的细胞，其中功能化脱羧酶的表达系统存在于与所述最小PKS的表达系统或所述完整的ACP合酶的所述表达系统相同的载体上，或不同的载体上。
15.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述最小PKS的所述表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统和功能化脱羧酶的所述表达系统存在于相同的载体上。
16.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中一、二或全部三个所述表达系统整合到宿主细胞染色体或表达自酵母人工染色体(YAC)。
17.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中表达的PKS、完整的ACP合酶和脱羧酶中至少两个来源于多顺反子信使RNA。
18.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的宿主生物体选自由巴斯德毕赤酵母和曲霉属物种组成的组。
19.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的宿主生物体是黑曲霉。
20.根据权利要求19所述的修饰的细胞，其不含有完整的ACP合酶的异源表达系统。
21.一种生产酚类化合物的方法，所述方法包括 a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含 i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列； ?)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其 中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和 iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列； b)在所述的重组宿主细胞中生产酚类化合物中间体；并且 c)从所述的酚类化合物中间体合成酚类化合物，其中重组脱羧酶催化所述的酚类化合物中间体的脱羧反应以形成所述的酚类化合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是6-MSA。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物是间甲酚。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是苔色酸(OSA)。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物是苔黑酚。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。
27.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。
28.一种生产酚类化合物的方法，所述方法包括 a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含 i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和 ?)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和 b)分离所述重组宿主细胞中产生的酚类化合物中间体；并且 c)通过用金属催化剂加热然后蒸馏，使步骤b)中所述的酚类化合物中间体脱羧以形成所述的酚类化合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是6-MSA。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述的酚类化合物是间甲酚。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述的金属催化剂是粉末形式的。
32.根据权利要求28或31所述的方法，其中所述的金属催化剂是锌催化剂。
33.一种用于生产烷基化的酚类化合物的修饰的重组宿主细胞，其包含 i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列，和?)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化， iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列，和 (iv)第四表达系统，所述系统包含至少一个编码O-甲基转移酶(OOMT)的核苷酸序列， 使得从所述细胞分离的所述产物是烷基化的酚类化合物。
34.根据权利要求33所述的修饰的细胞，其中所述的烷基化的酚类化合物是3-甲基苯甲醚。
35.根据权利要求33所述的修饰的细胞，其中所述的烷基化的酚类化合物是3，5-二甲氧基甲苯。
36.根据权利要求35所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。
37.根据权利要求35所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。
38.根据权利要求33所述的修饰的细胞，其中所述的OOMT由选自00MT1、00MT2、00MT3、00MT4、COMTI组成的月季基因编码。
39.一种生产烷基化的酚类化合物的方法，所述方法包括 a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含 i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列； ?)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和 iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列，并且 b)分离所述重组宿主细胞中产生的酚类化合物中间体；并且 c)通过用烷基化试剂进行处理，使步骤b)的所述酚类化合物中间体烷基化以形成所述的烷基化的酚类化合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是间甲酚。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是苔黑酚。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。
44.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述的烷基化的酚类化合物是3-甲基苯甲醚。
45.根据权利要求39或41所述的方法，其中所述的烷基化的酚类化合物是3，5-二甲氧基甲苯。
46.根据权利要求39所述的方法，其中烷基化试剂是甲醇。
47.一种生产邻苯二甲酸酐化合物的方法，所述的方法包括 a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含 i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列； ?)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；并且 b)分离在所述的重组宿主细胞中产生的邻苯二甲酸酐中间体化合物；并且 c)通过用氧化剂进行处理，使步骤b)的所述邻苯二甲酸酐中间体化合物氧化以形成所述的邻苯二甲酸酐化合物。
48.根据权利要求40所述的方法，其中所述的邻苯二甲酸酐中间体化合物是6-MSA。
49.根据权利 要求40所述的方法，其中所述的邻苯二甲酸酐是3-羟基邻苯二甲酸酐。
【文档编号】C12N9/10GK103764819SQ201280040918
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月22日 优先权日:2011年6月23日
【发明者】P.J.巴尔 申请人:Rho 可再生股份有限公司