产生芳香分子的酵母表达系统的制作方法

专利名称：：产生芳香分子的酵母表达系统的制作方法产生芳香分子的酵母表达系统本发明涉及天然芳香分子的产生。更特别地，本发明涉及酵母的新表达系统，所述表达系统使用表达盒且允许通过生物转化产生酚类衍生物，所述酚类衍生物可能用于产生用作食品调味剂或用于香料(香味或香水)的天然芳香分子。通过这两种途径的一种或另一种获得香草醛。香草醛(3-曱氧基-4-羟基苯曱醛)是对衍生自香草(P^mW"荚的香草提取物的嗅觉和味觉性质负责的主要成分。它是工业上最常用的芳香分子之一。然而，从香草荚或香草提取物产生的天然香草醛只占市场的20%;其应用受限，这首先归因于全球可用荚的潜力，其次是这些荚的高成本，所述成本波动很大(大约从30€/kg到450€/kg,即天然香草醛的潜力至少为1500€/kg)。因此，合成香草醛常用作天然香草醛的廉价替代品(约15€/kg)。然而，尽管合成香草醛适用于香料和化妆品，但是它可以在农业食品业造成管理问题。此外，合成调味剂一般不如天然调味剂为消费者喜爱。因此，寻求通过生物学方法，特别是生物转化方法获得天然芳香分子，特别是香草醛，所述方法利用微生物(细菌、酵母、霉菌)或植物细胞，或其酶系统。为本发明的目的，术语"生物转化"是指底物的生物学转化，所述底物优选衍生自天然来源，以便获得天然调味料、香水或者调味料或香水的前体。香草醛可按照下列反应方案产生只要可获得，提及的每个分子均有可能获得香草醛，所述分子中最重要的是阿魏酸和丁香酚。例如，申请EP453368、PCT申请WO96/08576和PCT申请WO00/61721描述在存在丝状真菌下通过生物转化从阿魏酸产生天然香草醛的方法。这些方法中使用的阿魏酸来源于提取含阿魏酸酯的农副产品玉米、水稻、甜菜或小麦。然而，这些副产品的阿魏酸浓度低及其提取-纯化所需的步骤多，意味着从这些酯提取，产量仍然相当低；从而造成该起始材料的高成本，并且因此造成由其衍生的香草醛的高生产成本。为了使利用微生物的生物方法有可能节省成本，因此优选使用更为广泛可获且廉价的底物。丁香酚便是如此，其可以作为松柏醇或阿魏酸的来源。由J.Overhage等发表的文章说明一个事实，即在大肠杆菌(foc/zen'c/n'aco/z')中表达衍生自简青霉CPem.c/〃&m157'附///(^157'柳"柳)的香草醇氧化酶基因，会使催化丁香酚转化为松柏醇成为可能。为转化松柏醇为阿魏酸，J.Overhage等后来在大肠杆菌中表达其他两个简青霉来源的酶松柏醇脱氢酶和^M白醛脱氢酶(在大肠杆菌重组菌4朱中高效生物转化丁香酚为阿魏酸，并进一步转化为香草醛，2003,AppliedandEnvironmentalmicrobiology(应用和环境微生物学)，6569-6576)。尽管这种方法的确使用了可用的且相对低廉的底物丁香酚，但是，由于转化丁香酚为阿魏酸需要三份克隆，在大肠杆菌中产生阿魏酸的系统仍然难以实施。因此，本发明的主题是以比现有技术低的产生成本，用在工业上实施简单的方法，产生天然香草醛前体或天然香草醛本身的方法。本发明提出的方案是使用或产生廉价可用的天然底物，例如丁香酚和阿魏酸。后者是合成香草醛最常用的底物，通常昂贵而且质量难以控制。因此，本发明的另一主题是产生天然阿魏酸和/或天然松柏醇的简单而有效的方法，其成本在工业上可以接受。尽管阿魏酸可以用作天然香草醛的前体，然而，松柏醇是罕见香水如佳雷花(fleursdetiar6)香水中的脱氢+〉柏醇的来源，并且可通过氧化作为阿魏酸的来源。本发明方法的必不可少的装置是酵母，所述酵母包括至少一个编码香草醇氧化酶的基因，其属于诸如衍生自简青霉的香草醇氧化酶基因(SEQIDNo.l)(GenBank参考号Y15627)或与SEQIDNo.1的序列至少70%，优选80%，非常优选90%—致的任何核苷酸序列的类型。因此，本发明的目的是提出在包括至少一个编码香草醇氧化酶基因的酵母中生物转化^^宜的底物。通过本发明的酵母生物转化丁香酚，一方面可以以低成本产生无杂质的天然阿魏酸和/或天然松柏醇，另一方面，可以产生天然香草醛。根据本发明的一个实施方案，所述酵母包括至少一个包含编码香草醇氧化酶的基因的表达系统。有利的是，该表达系统包括(1)整合该系统到所述细胞基因组中的装置，其包括两个核苷酸序列，(2)选择已经整合了该系统的所述细胞的装置，其包括选择插入片段，该插入片段包括作为启动子、诸如抗生素抗性基因的可选^^标志物以及终止子边界的两个LoxP序列，(3)编码香草醇氧化酶的基因的表达盒，包括允许该基因表达的启动子、允许该基因整合的至少一个克隆位点以及终止子。术语"表达盒"是指核苷酸序列，其包括启动子、克隆目的基因的插入位点或多克隆位点(MCS)和终止子。术语"启动子"是指启动和控制转录所需的DNA序列，术语"克隆插入位点"或"多克隆位点"是指含有一个或多个限制位点的DNA序列，以及术语"终止子"是指转录终止所需的DNA序列。术语"载体"是指任何可能插入外源核酸片段于其中的DNA序列，所述载体使把外源DNA引入宿主细胞成为可能。载体的实例是质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和Pl噬菌体衍生的人工染色体(PAC)，以及病毒衍生载体。术语"可选择标志物"是指基因，其表达赋予含有它的细胞可被选择的特性。它是，例如抗生素抗性基因。根据本发明的优选实施方案，所述克隆位点包括限制性内切酶Notl、BamHI、Mfel和Xhol的限制性位点，其使香草醇氧化酶核苷酸序列插入所述表达盒。有利的是，该克隆位点的序列是序列SEQIDNo.2或与序列SEQIDNo.2至少70%,优选80°/。，非常优选90%同源的任何序列。根据本发明的优选实施方案，可选择标志物以两个LoxP位点为边界，这将使该可选择标志物被CRE/Lox系统切除。CRE酶是特异性识别LoxP位点的重组酶。这两个位点之间的核苷酸序列被称作靶DNA，将在CRE酶存在时被除去。这是因为，在CRE酶与LoxP位点结合时，它切开这两个位点，并在耙DNA^皮除去后又将这两半粘接在一起。有利的是，序列LoxP的序列是序列SEQIDNo.3或与序列SEQIDNo.3至少70%，优选80%，非常优选90%同源的任何序列。根据本发明的优选实施方案，可使所述表达系统整合入该酵母基因组中的序列有多种并选自包括TY序列、端粒序列X和Y'、DUP序列、序列□或在酵母基因组中重复的任何序列的组。有利的是，该序列是酿酒酵母(&cc/zaramyc&scereWWae)的TY1A和TY1B序列，其序列优选分别为序列SEQIDNo.4和SEQIDNo.5或与其至少70%，优选80%,非常优选90%同源的任何序列。根据本发明另一个优选实施方案，用于所述表达系统的启动子是强启动子，即在其控制下，引起所述基因强转录的启动子。强启动子的实例是l)控制基因表达的启动子，其蛋白在酵母中丰富，例如控制糖酵解蛋白或氮代谢蛋白表达的启动子；2)表达特异的启动子，例如其活性受糖或氮的存在调节的启动子；3)转录组实验可见高活性的启动子；或4)设计为使其调节的基因强转录的人工启动子。就用于所述表达系统的终止子允许良好mRNA稳定性的能力，对其选择。有利的是，选择的终止子对应以上选择的强启动子。有利的是，使目的基因在所述表达系统表达的启动子为酿酒酵母TDH3基因的启动子，其序列优选为序列SEQIDNo.6或与序列SEQIDNo.6至少70%，优选80%,非常优选卯％同源的任何序列。有利的是，相关的终止子是酿酒酵母CYC1基因的终止子，其序列优选为序列SEQIDNo.7或与序列SEQIDNo.7至少70%,优选80%，非常优选90%同源的任何序列。有利的是，允许表达所述可选择标志物的启动子及终止子为棉蚜G4W^agowj^z')TEF1基因的启动子及终止子，其序列优选分别为序列SEQIDNo.8和SEQIDNo.9或与其至少70%,优选80%,非常优选90%同源的任何序列。根据本发明另一个优选实施方案，用于所述表达系统的可选择标志物为抗生素抗性基因，其选自包括抗遗传霉素(g6n6ticine)基因、抗诺尔丝菌素(nourseothricine)基因、抗腐草霉素基因或抗z6ocine基因，或抗野生型酵母敏感的支配抗生素的任何其它基因的组。有利的是，用于所述表达系统的可选择标志物为抗遗传霉素的基因，其序列优选为序列SEQIDNo.10或与序列SEQIDNo.10至少70%,优选80%，非常优选90%同源的任何序列。根据本发明另一个优选实施方案，含有香草醇氧化酶基因的表达系统序列为SEQIDNo.11核苷酸序列，或与序列SEQIDNo.11至少70%,优选80%,非常优选90%同源的任何序列。本发明的主题也是包括以上定义的表达系统的载体。根据本发明另一个优选实施方案，包括所述表达系统的载体为质粒，并且有利的是，为pUC57。本发明还包括含至少一个以上定义的载体的转化细菌。这些转化的细菌可能属于允许复制所选载体的任何种。有利的是，这些为大肠杆菌属的细菌。本发明的主题还是用于切除抗生素抗性基因的载体，该切除载体包括(1)选择含有它的细胞的装置，包括棉蚜TEF1基因及诺尔丝菌素抗性基因的启动子及终止子，以及(2)切除所述表达系统中存在的可选择标志物的装置，包括酿酒酵母GAL1基因、CRE基因的启动子和酿酒酵母CYC1基因的终止子。有利的是，所述切除载体包括序列SEQIDNo.12或与序列SEQIDNo.12至少70%，优选80%,非常优选90%同源的任何序列。根据本发明的优选实施方案，上述切除载体选自在细胞分裂期间分离不佳的载体，从而通过这一特性导致在不存在常见选择压力下丢失载体，所述载体例如多拷贝复制型载体。有利的是，所述切除载体是质粒pFL44s。所述切除载体的第一个优点是，它可使存在于酵母基因组的抗生素抗性基因在用所述表达系统转化该酵母后除掉。因此，除了编码香草醇氧化酶的基因外，允许产生根据本发明的芳香分子的酵母不包含源自属于同一属或同一科的菌林的任何DNA。此外，通过所述切除载体消除抗性基因也使酵母转化数次成为可能，从而增加存在于基因组的所述表达系统的拷贝数，并且从而增加香草醇氧化酶蛋白的产量。本发明的主题为包括含有香草醇氧化酶的表达系统的酵母，该表达系统的序列为序列SEQIDNo.11或与序列SEQIDNo.11至少70%,优选80%,非常优选90%同源的任何序列。本发明的主题还是上述酵母和/或上述切除载体转化的酵母。根据本发明的优选实施方案，所述酵母属于能够实现^f艮据已知现有技术方法的香草醛前体(特别是丁香酚、阿魏酸、松柏醇)向香草醛生物转化的酵母的任何种。为本发明的目的，术语"酵母"是指任何二倍体或多倍体酵母或衍生自这些菌林的一种的孢子形成的任何单倍体克隆，或者可选择地衍生自两个单倍体克隆杂交的任何二倍体克隆。有利的是，所述酵母属于半子嚢菌酵母的任何种，优选属于酵母属GS"cc/2ara/7^cey)或其杂种。非常优选地，所述酵母源自酿酒酵母(Cev/w'ae)菌才朱或其杂种。本发明的主题是产生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，包括以下步骤a)将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列克隆入所述表达系统，b)以如此获得的表达系统转化所述酵母，c)在允许表达香草醇氧化酶的条件下培养所述酵母，d)使所述酵母与丁香酚接触。根据本发明的优选实施方案，先将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列和包括所述表达系统的载体以一种或多种限制性酶消化。然后，将编码香草醇氧化酶的基因的序列通过简单的连接或其它任何插入装置插入所述载体携带的表达系统中。为了扩增所述表达系统，用根据任一方法的连接产物(携带含有香草醇氧化酶基因的表达系统的载体)转化细菌。利用存在于载体中的抗生素抗性基因选择已经整合了所述表达系统的细菌，该载体携带含有编码香草醇氧化酶的基因的表达系统。其次，将携带所述表达系统的载体以一种或多种限制性酶，优选PvuII消化，所述酶切割所述表达系统的两边。接着纯化所述表达系统，然后根据任一已知方法将其用于转化所述酵母。利用存在于所述表达系统中的抗性基因选择已经整合了所述表达系统的酵母。最后，以本领域技术人员已知的允许表达香草醇氧化酶的条件培养转化的酵母。当把丁香酚添加至培养基时，香草醇氧化酶使催化生物转化所述丁香酚为松柏醇和/或阿魏酸成为可能。本发明的主题还是产生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，其中存在于酵母基因组中的可选择标志物已切除，该方法包括在步骤b)之后且在步骤c)和步骤d)之前的以下步骤bl)、步骤b2)及步骤b3):b1)以所述切除载体转化所述酵母，b2)在允许所述CRE酶表达的条件下培养所述酵母，b3)分离已丢失所述可选择标志物的酵母。根据本发明的优选实施方案，将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列插入所述表达系统，首先如上所述以该表达系统转化所述酵母。利用第一可选择标志物的存在，选择整合了所述表达系统的酵母，所述第一可选^t爭标志物优选抗生素抗性基因。然后，用任何已知的方法以所述切除载体转化阳性选择的酵母。利用存在于所述切除载体中的诺尔丝菌素抗性基因选择已经整合了所述切除载体的酵母。然后，将已经由此整合了所述表达系统和所述切除载体的酵母，在允许表达CRE酶的条件下培养。活性的CRE酶将使切除所述表达系统中以loxP序列为边界的所述第一可选择标志物成为可能。随后，选4奪已经丟失该可选择标志物的酵母。例如，利用已经丢失该第一抗生素抗性基因的酵母对该抗生素抗性的缺失而对其选择。采用该选择步骤得到的酵母不再具备存在于所述表达系统中的可选择标志物，但仍拥有存在于所述切除载体中的诺尔丝菌素抗性基因。如上所述，所述切除载体选自在细胞分裂期间分离不佳的载体。利用这一特性，所述切除载体在缺乏通常的选择压力下很容易丢失。术语"选4奪压力"是指有助于选择所述细胞的任何方法。例如，在培养中，在抗生素存在下，保持具有该抗生素抗性的基因的酵母，对应于选择压力的方法。因此，将在前一步中获得的酵母在没有选择压力下培养，从而丢失所述切除载体，然后就诺尔丝菌素抗性基因的丟失而对其选择。如此获得的酵母已将允许香草醇氧化酶表达的表达系统整合入其基因组中，而其基因组不再包含任何抗生素抗性基因。然后，将转化的酵母在本领域技术人员已知的允许表达香草醇氧化酶的条件下培养。当将丁香酚添加至所述培养基时，香草醇氧化酶使催化生物转化所述丁香酚为松柏醇和/或阿魏酸成为可能。最后，本发明的主题还是产生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，其中按照所需的所述表达系统的拷贝数，将步骤b)、步骤bl)、步骤b2)及步骤b3)重复许多次，目的在于增加酵母基因组中的表达系统的拷贝数。根据本发明的优选实施方案，首先以该表达系统转化所述酵母，然后如上所述对其选择。接着以所述切除载体转化这些酵母，从而如上所述消除可选择标志物。如此获得的酵母不再拥有其基因组中的可选择标志物，并整合了所述表达系统的至少一个拷贝。其次，为了增加所述表达系统的拷贝数，再次以所述表达系统转化这些酵母。进行同上的选择方法，用切除载体转化的方法和最后选择的方法。如此获得的酵母不再拥有可选择标志物，并且已经整合了至少2个拷贝的所述表达系统至其基因组中。该方法可重复所需的多次。本发明的主题是产生香草醛的方法，其包括上述步骤a)、步骤b)、步骤c)及步骤d)，及随后的将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤。根据本发明的优选实施方案，酵母利用自己的遗传物质，能够将步骤d)中产生的阿魏酸转化为香草醛。根据本发明的另一个优选实施方案，根据专利EP0606441和EP0804606所述的方法，通过酶法或生化方法进行转化阿魏酸和/或+>柏醇为香草醛的步骤。从随后的进一步描述中将更加清楚地了解本发明，参考获得包括香草醇氧化酶的表达系统的实施例，包括该表达系统的载体，切除载体及其在通过丁香酚的生物转化产生松柏醇和阿魏酸上的用途。在后续以说明的方式给出的实施例中，参考附后的图，其中图l展示了所述表达系统的方案，图2展示了所述酵母表达香草醇氧化酶，图3展示了获得切除载体pFL44s-NATl-CRE的方法。实施例l:通过用表达系统转化酵母在酵母中表达香草醇氧化酶1/表达系统的合成表达系统包括SEQIDNo.13中所述的2715bp的核苷酸序列。该核苷酸序列由合成序列(SEQIDNo.14)和选择插入片段(SEQIDNo.15)构建。所述合成序列大小为1225bp,由GenScript公司合成。该序列包括-TYIA序列-LoxP序列-TDH3基因启动子的序列-多克隆位点序列-CYCl基因终止子的序列-TYIB序列。所述选择插入片段分离自克隆入大肠杆菌的载体pUG6(Giildener，U.,Heck，S.,Fiedler,T.，BeinHauer,J.,andHegemann,J.H.1996.Anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeast(—种在芽殖酵母中重复4吏用的新的有效基因中断盒).NucleicAcidsRes.24:2519-2524)。所述选择插入片段包含1500bp并且包括-loxP序列-TEF1基因的启动子序列-]^111"基因的序列-TEFl基因的终止子序列。以Sail及Sacl限制性酶消化pUG6载体，从而分离该插入片段。通过EcoRI及Pstl限制性位点将包括所述合成序列的表达系统克隆入pUC57载体(GenScript公司)。以Sail及Sacl限制性酶消化包含所述表达系统的pUG6载体和pUC57载体。随后，通过简单的连接将所述选择插入片段插入位于Sail及Sacl限制性位点任一侧的TY1A和LoxP序列之间的合成序列中。由此获得的载体称作pM2-KAN(图1)，其包括所述表达系统(合成序列+选择插入片段)。若用户期望，存在于所述选择插入片段中的Xbal及Sacl限制性位点使改变所述可选择标志物及其表达序列成为可能。Sail及Spel限制性位点使除去或代替由以该两个LoxP序列为边界的2/将编码香草醇氧化酶的基因插入表达系统VAO的核苷酸序列衍生自简青霉(GenBank参考号Y15627)。合成实验中使用的VAO序列(SEQIDNo.1)，其在5'位置有NotI位点，在3'位置有Xhol位点，以使其被克隆至pivex载体中，该克隆符合产生具有C末端六组氨酸标签的蛋白的核苷酸序列的读框。以Notl及EcoRI消化包含上述VAO序列的pivex载体，以释放VAO-6His序列。接着，以简单的连接将这个序列克隆至pUC57载体，该载体包含事先以Notl和Mfel消化的表达系统。3/用包括编码香草醇氧化酶的基因的表达系统转化酵母以PvuII限制性酶消化包含所述表达系统的pUC57载体。该酶切割包含目的基因VAO的表达系统的两边。将衍生自所述消化的DNA片段纯化，根据热激方法在PEG/醋酸锂存在下转化酵母。在包含300mg/1遗传霉素的YPD丰富培养基(1%酵母提取物、1%蛋白胨、2。/。葡萄糖)上，利用所述表达系统携带的KANr抗性基因的存在，选择转化的酵母。转化后(克隆92411KANVAO),获得酿酒酵母(菌株9241l)的24个克隆。4/分析所转化酵母的香草醇氧化酶的表达将转化的酵母培养在完全含葡萄糖培养基(YPD)上。随后，使用实施例1中的NiNTA树脂亲和纯化VAO蛋白。将滞留在该树脂上的蛋白以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE凝胶)分析，以考马斯蓝检测。图2表明，就两个克隆而言，产生了VAO蛋白(柱E92411KANVAO)。92411T克隆对应阴性对照，即未转化的菌林92411,并且不产生任何VAO蛋白，而BL21I+F对应阳性对照，其得自pivex载体中的香草基VAO的克隆及其在大肠杆菌中的产生。实施例2:在表达香草醇氧化酶的酵母中通过生物转化丁香酚产生松柏醇和阿魏酸首先，依据上述用包含香草醇氧化酶的表达系统转化的酵母将丁香酚转化为松柏醇的能力，对其选择，然后依据其产生阿魏酸的能力，选择它们中的一些。因此，在预选择其形成松柏醇的能力后，发现93205克隆随后能够通过其衍生物将丁香酚转化为阿魏酸。93207克隆及其子代被选为能够在发酵罐中转化丁香酚为松柏醇的菌抹的实例。1/用93207菌株及其衍生物93334在发酵罐中产生水>柏醇将93207菌林的两个孢子杂交得到二倍体菌抹93334，其因而包括两个拷贝的含有香草醇氧化酶的表达系统。随后，将93334菌抹在100ml麦芽培养基中培养两天，以达到约3xl0、6x108细月包/ml的浓度。随后将所述细胞接种至含有3升麦芽培养基的发酵罐。在30°C和500rpm的振摇下，以预培养的一半体积进行接种。通气为l升空气/分钟。培养20小时后，加入溶于50%葡萄糖的丁香酚(60g丁香酚+120ml以50%溶于水的葡萄糖)。转化18小时后，停止所述发酵。取样。用磷酸酸化，以乙醇稀释2倍并在8000rpm下离心。用HPLC分析上清液。结果表明，在18小时中，丁香酚事实上被完全转化，且合成了22g/1的松柏醇(摩尔产率接近100%)。2/用93205菌抹及其衍生物93342在发酵罐中产生阿魏酸在30。C及150rpm的振摇下，在100ml麦芽培养基中将衍生自93205菌抹孢子形成的单倍体菌林93242培养两天。随后，将所述细胞培养在含有3升麦芽培养基的发酵罐中。在30。C和500rpm的振摇下，以预培养的一半体积进行接种。以0.45升空气/分钟通气24小时。在培养24小时后，以0.25-0.5克丁香酚/小时的流速不断加入丁香酚溶液。定时取样以监测所述底物向酚衍生物的转化。以磷酸酸化各样品并在8000rpm离心。以HPLC分析上清。底物流速2.5毫升/小时浓度为克/升<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在这些条件下，从10g/1丁香酚产生10g/1阿魏酸(摩尔产率=85%)。实施例3:从所转化酵母的基因组中切除可选择标志物1/构建用于切除可选一奪标志物的pFL44s-NATl-CRE载体在本实施例中，切除载体的来源载体是pFL44s载体(GenBank参考号X70266)。该载体长度为4319bp，具有-111^3基因的序列-AmpR抗性基因的序列-多克隆位点-2micron复制原点的序列将包括可选择标志物的插入片段和包括CRE酶序列的插入片段插入该PFL44s载体中。包括可选择标志物的插入片段在此为诺尔丝菌素抗性基因NAT1，自编码诺尔丝菌素的载体(GenBank参考号X73149)获得。以BglII及EcoRI限制性酶消化该载体和pFL44s载体。将包括TEF基因启动子、NAT1基因序列及TEF基因终止子的NAT1插入片段通过简单连接插入pFL44s载体中。由此获得的载体是pFL44s-NATl载体。自psh47载体(GenBank参考号AF298782)获得包括CRE酶序列的插入片段。用PvuII限制性酶消化psh47载体和pFL44s-NATl载体。随后，将包括GAL1基因启动子、CRE基因序列及CYC1基因终止子的CRE插入片段通过简单连接插入pFL44s-NATl载体。由此获得的载体是pFL44s-NATl-CRE载体，其序列为序列SEQIDNo.ll(图3)。2/用切除载体转化酵母以除去存在于酵母基因组的可选择标志物以pFL44s-NATl-CRE切除载体转化包括含有香草醇氧化酶的表达系统的酵母，例如93334菌4朱。在添加clonNAT(lOOmg/ml)的丰富培养基(YPD)上选择转化的酵母。随后，将阳性选择的酵母培养在YP半乳糖培养基中。由于CRE基因的启动子在半乳糖存在下可诱导，因而该培养条件使诱导酵母中CRE酶的表达成为可能。该实验的结果表明，80%的所述克隆已经丟失了KanR标志物。以已经丟失所述可选择标志物的93334菌林进行1/中所述的转化丁香酚为松柏醇的方法。经过18小时的转化后，得到相同的结果，提示丢失了可选择标志物不影响所述菌抹的生物转化能力。权利要求1.包括至少一个编码香草醇氧化酶的基因的酵母，所述基因的序列为序列SEQIDNo.1或是与序列SEQIDNo.1至少70％、优选80％、非常优选90％同源的任何序列。2.如权利要求1所述的酵母，其特征在于，编码香草醇氧化酶的基因包含在表达系统中，所述系统包括(1)将所述系统整合进所述酵母的基因组的装置，其包括两个核苷酸序列，(2)选择已经整合了所述系统的所述酵母的装置，其包括选择插入片段，该选择插入片段包括作为启动子、诸如抗生素抗性基因的可选择标志物以及终止子边界的对应于序列SEQIDNO.3的两个LoxP序列，(3)编码香草醇氧化酶的基因的表达盒，其包括允许所述基因表达的启动子、允许所述基因整合的至少一个克隆位点以及终止子。3.如权利要求2所述的酵母，其特征在于，将所述表达系统整合进所述酵母的基因组的核苷酸序列为酿酒酵母的与序列SEQIDNo.4对应的TYIA序列和与序列SEQIDNo.5对应的TY1B序列，或与其至少70%、优选80%、非常优选90%同源的任何序列。4.如权利要求2或3所述的酵母，其特征在于，允许所述香草醇氧化酶表达的启动子是酿酒酵母TDH3基因的启动子(SEQIDNo.6)或与其至少70%、优选80%、非常优选90%同源的任何序列，并且相关的终止子是对应于序列SEQIDNo.7的酿酒酵母CYC1基因的终止子或与其至少70%、优选80%、非常优选90%同源的任何序列。5.如权利要求2至4中任一项所述的酵母，其特征在于，允许所述可选择标志物表达的启动子和终止子是棉辨TEF1基因的对应于序列SEQIDNo.8的启动子和对应于序列SEQIDNo.9的终止子，或与其至少70%、优选80%、非常优选90%同源的任何序列。6.如权利要求2至5中任一项所述的酵母，其特征在于，所迷可选择标志物为抗生素抗性基因，其选自包括抗遗传霉素基因、抗诺尔丝菌素基因、抗腐草霉素基因或抗z6ocine基因，或抗野生型酵母敏感的支配抗生素的任何其它基因的组，并且优选是对应于序列SEQIDNo.10的遗传霉素抗性基因或与其至少70%、优选80%、非常优选90%同源的任何序列。7.如权利要求2至6中任一项所述的酵母，其中含有香草醇氧化酶的表达系统的序列为核苷酸序列SEQIDNo.H，或与其至少70%、优选80%、非常优选卯％同源的任何序列。8.如权利要求1至7中任一项所述的酵母，其特征在于，其属于能够将香草醛前体生物转化为香草醛的酵母的任何种。9.如权利要求1至7中任一项所述的酵母，其特征在于，其属于半子嚢菌酵母的任何种，优选属于酵母属或其杂种，非常优选属于酿酒酵母菌抹或其杂种。10.包括如权利要求2至7中任一项所述的表达系统的载体。11.包括如权利要求2至7中任一项所述的表达系统的质粒，其优选是pUC57。12.包括如权利要求10和11中任一项所述的载体的细菌，其优选是大肠杆菌。13.切除载体，其特征在于，其选自多拷贝载体，优选pFL44s，并且其包括序列SEQIDNo.l2或与序列SEQIDNo.l2至少70。/。、优选800/。、非常优选90%同源的任何序列。14.产生天然*>柏醇和/或天然阿魏酸的方法，包括以下步骤a)将编码香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列克隆至如权利要求2至7中任一项所述的表达系统，b)用如此获得的表达系统转化酵母，c)在允许所述香草醇氧化酶表达的条件下培养所述酵母，d)使所述酵母与丁香酚接触。15.如权利要求14所述的方法，包括在步骤b)之后且在步骤c)和步骤d)之前的以下步骤bl)、M)及b3):bl)用如权利要求13所述的切除载体转化所述酵母，b2)在允许CRE酶表达的条件下培养所述酵母，b3)分离已丢失所述可选择标志物的酵母。16.如权利要求15所述的方法，其中按照所需的所述表达系统的拷贝数，将步骤b)、步骤bl)、步骤b2)及步骤b3)重复许多次。17.产生香草醛的方法，包括如权利要求14至16中任一项所述的步骤a)、b)、c)及d)，以及随后的将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤。18.如权利要求17所述的产生香草趁的方法，其中将步骤d)中产生的阿魏酸和/或松柏醇转化为香草醛的步骤在酵母中进行，或利用生物化学方法或利用酶法进行。全文摘要包括至少一个编码香草醇氧化酶的基因的酵母，所述基因的序列为序列SEQIDNo.1或与序列SEQIDNo.1至少70％、优选80％、非常优选90％同源的任何序列，以及产生松柏醇、阿魏酸和香草醛的方法。文档编号C12N15/81GK101432429SQ200780015806公开日2009年5月13日申请日期2007年2月28日优先权日2006年3月1日发明者弗雷德里克·内斯,法尼·安贝尔,米歇尔·艾格尔,约瑟夫·卢卡,让·玛奈申请人:玛奈·菲尔萨公司