专利名称：沉默食管癌细胞HIF-1α基因29ShRNA表达载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是提供一种沉默食管癌细胞HIF-I α基因 29shRNA表达载体的构建。
背景技术：
人类超过一半的中晚期原位癌有缺氧区，氧浓度比周围正常组织大大降低。例如， 人类乳腺癌平均氧分压为IOmmHg,而正常乳腺组织为65mmHg。实体瘤内缺氧不仅因为肿瘤 快速增殖，而且因为血管结构和功能异常使肿瘤得不到足够的营养物和氧。缺氧会给细胞 带来严重的生存压力，氧平衡需要一系列基因的协同调节。在多种类型细胞中，当氧含量降 低时可调控转录复合体缺氧诱导因子1 (HIF-I)的表达，HIF-I活性受细胞水平HIF-I α亚 基调控，它与缺氧诱导因子-1 β (HIF-1 β) 二聚化，形成活性转录因子。HIF-I在常氧细胞 中很难检测到，缺氧的条件下很快被激活，HIF-I活化后其靶基因表达上调，诱导多数编程 性细胞保护反应，如抗缺氧、抗缺血或抗损伤，即诱导促红细胞生成素、血管内皮生长因子 和其它血管生成相关因子的基因表达，诱导糖代谢和葡萄糖转运相关基因的表达，从而有 助于改善细胞营养不良环境，据报道HIF-I可激活多达近百个靶基因。食管癌中不仅存在HIF-I α的活化现象，且HIF_1 α蛋白表达水平和病人存活时 间呈负相关。对利用光动力学(Photodynamic therapy, PDT)治疗的食管早期癌临床标本 研究发现HIF-I α影响PDT疗效。RANi是自然界普遍存在的导致基因沉默的生物现象。1998年，Fire A等首次提 出了 RNA干扰学说。其基本原理是siRNA与互补的mRNA结合形成沉默复合体，导致mRNA 降解而使目的基因表达沉默。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA，然后这种小的干扰RNA分子掺入RNA诱导的沉 默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，引导核酸酶降解靶RNA，从而产生RNA 干扰。这使得构建表达shRNA的干扰载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为 可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沉默食管癌细胞HIF-I α基因29shRNA表达载体的构 建，为以HIF-I α为靶标的食管癌新药开发和基因治疗提供了新材料。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案本发明所述的沉默食管癌细胞HIF-I α基因29shRNA表达载体的构建，包括下述 步骤(1)根据 NCBI 获取 ΝΜ_001530· 3，设计正义链 5，CTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGA G3’的29寡核苷酸干扰序列；(2)以pENTR/Hl/TO为载体，依据质粒的插入位点和接头结构设计编码shRNA的单 链DNA oligos，在正义链序列5’加入链接序列CACCA，中部加入loop环(GAGA)结构，反义链5’端加AAAA连接序列，3’端加T ；设计最终连接的编码shRNA的DNA序列为正向CACCA CTACT CAGGA CACAG ATTTA GACTT GGAGG AGACT CCAAGTCTAA ATCTG TGTCC TGAGT AG，反向 AAAAC TACTC AGGAC ACAGA TTTAG ACTTG GAGTCTCCTC CAAGT CTAAA TCTGT GTCCT GAGTA GT ；(3)单链DNA oligos退火生成双链oligos，双链oligo连接pENTRTM/Hl/TO载体，按照20 μ 1反应体系进行连接反应，室温孵育5min，冰浴并转化感受态E. coli，用含50mg/ 1卡那霉素琼脂平板筛选阳性克隆；扩大培养阳性菌并提取得到pENTRTM/Hl/TOhif-la的 重组质粒。本发明的优点在于利用WHITEHOUSE、SiDirect 和 Rational siRNA Design 软件 获得6条19-23核苷酸长度的HIF-I α靶向siRNA待选序列；通过BLAST分析干扰序列与 人类全基因组的同源性和软件综合评分发现将位于2056-2074的19核苷酸HIF-I α靶向 siRNA C端延伸至2085位，成为29核苷酸HIF-I α靶向RNA干扰序列评分更优；2005年 Dong-Ho Kim等也发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制 目的基因。故将29寡核苷酸RNA干扰序列转换成编码shRNA的DNA序列后加接头克隆入 线性pENTRTM/Hl/TO载体，避免了限制性内切酶消化不完全带来的假阳性，经测序鉴定序 列正确。pENTRTM/Hl/TOhif-1 α重组质粒瞬时转染食管上皮细胞Het-IA并经化学诱导后 western blot法鉴定靶蛋白，结果能有效抑制HIF-1 α的诱导表达。
图1是本发明构建的重组质粒测序图。图2是HIF-I α蛋白的诱导表达抑制效果图。
具体实施例方式本发明所述的沉默食管癌细胞HIF-I α基因29ShRNA表达载体的构建，包括下述 步骤(Ia)细胞培养与HIF-I α的化学诱导HET-IA细胞培养基为含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(含100000U · L—1青 霉素和80000U·!/1链霉素)，于37°C、C02体积分数为5%的培养箱中培养。HIF-Ια的诱 导使用CoCl2,培养液中的终浓度为15(^11101/1，细胞孵育411后检测!1正-10蛋白；(Ib)HIF-Ia干扰序列的设计HIF-I α 基因 M 和mRNA全长序列号从NCBI 获取(NM_001530. 3)，利用 WHITEHOUSE 软件进行预测分析由23个核苷酸组成的干扰序列，GC含量控制在30% -50% ；同时利用 SiDirect在线设计软件，将已获得的mRNA序列全长输入待预测序列框，选择设计方针为雷 诺方程，GC含量控制在30% -50%，运行远程预测程序，获得预测结果。最后利用Rational siRNA Design软件验证设计的序列；以NCBI的Nucleotide Blast对各个预测的核苷酸序 列进行比对，设计得到6条19-23核苷酸的HIF-I α的干扰序列，并最终优化得到一条正义 链为5’ CTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAG3’的29寡核苷酸干扰序列；同时合成一条与人 类基因无同源性的阴性对照序列(neg)；(2)以pENTR/Hl/TO为载体，依据质粒的插入位点和接头结构设计编码shRNA的单链DNA oligos，在正义链序列5’加入链接序列CACCA，中部加入loop环(GAGA)结构，反义 链5’端加AAAA连接序列，3’端加T ；设计最终连接的编码shRNA的DNA序列为正向CACCA CTACT CAGGA CACAG ATTTA GACTT GGAGG AGACT CCAAGTCTAA ATCTG TGTCC TGAGT AG，反向 AAAAC TACTC AGGAC ACAGA TTTAG ACTTG GAGTCTCCTC CAAGT CTAAA TCTGT GTCCT GAGTA GT ；(3)单链DNA oligos退火生成双链oligos，双链oligo连接pENTRTM/Hl/TO载体， 按照20 μ 1反应体系进行连接反应，室温孵育5min，冰浴并转化感受态E. coli，用含50mg/ 1卡那霉素琼脂平板筛选阳性克隆；扩大培养阳性菌并提取得到pENTRTM/Hl/TOhif-la的 重组质粒。(4)重组质粒测序 挑取5个抗性克隆在含50mg/l卡那霉素LB液体培养基中过夜培 养，质粒纯化提取试剂盒提取质粒，测序鉴定定插入序列，测序引物上游Hl 15' -TGTTCTGGGAAATCACCATA-3‘，下游M13:5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3‘，测序由上海生
工完成。(5) Het-IA细胞瞬时转染转染前24h将对数生长期的Het-IA细胞接种于6孔板，待细胞生长到90%融合时 进行细胞转染，空白对照组只加转染试剂，阴性对照组转染pENTRTM/Hl/TOhif-neg，实验组 转染pENTRTM/Hl/TOhif-1 α，每组设3个复孔，转染6h后更换含双抗的10%胎牛血清培养基。(6)HIF-I α蛋白表达测定细胞转染48h后加入化学诱导剂CoCl2,终浓度为150 μ mol/L,培养4h后收集， 用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上裂解细胞，于4°C 12000g离心，上清液以BCA法 测定蛋白浓度，每组样本各取总蛋白40yg，8%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分离蛋白，湿转法将蛋白转至NC膜，经5%脱脂奶封闭Ih后，分别加一抗兔抗 人HIF-la(l 1000)和兔抗人GADPH单克隆抗体(1 5000) 4°C孵育过夜，二抗(HRP标 记的羊抗兔IgG，l 5000)孵育Ih后化学发光法显色。鉴定结果UpENTRTM/Hl/T0hif-l α重组质粒的测序鉴定单链oligos退火生成双链oligos后T4连接酶与pENTRTM/Hl/TO载体连接，转化 感受态细胞T0P10后经卡那霉素琼脂平板筛选，阳性菌落提取DNA，测序法鉴定显示所构建 重组质粒的插入序列与设计序列100 %相同(如图1所示)，BLAST分析表明构建质粒shRNA 特异靶向人类基因组HIF-I α基因。2、HIF-I α基因的诱导表达抑制效果Het-IA细胞分别转染pENTRTM/Hl/TOhif-I α重组质粒和阴性对照质粒后48h， 经CoC12诱导模拟缺氧4h后，以Western blot法测定Het-IA细胞HIF-I α蛋白表达量， 结果转染PENTRTM/Hl/T0hif-1 α载体后蛋白水平明显低于未转染Het-IA细胞和转染阴性 对照质粒的对照组细胞，如图2所示(第1组为CoCl2诱导，未转染质粒，第2组为CoCl2诱 导，转染对照质粒，第3组为CoCl2诱导，转染pENTRTM/Hl/T0hif-l α重组质粒，第4组为 无CoCl2S导，未转染任何质粒)；上述结果表明构建的shRNA载体对HIF-I α的诱导表达有明显的抑制作用.
权利要求
一种沉默食管癌细胞HIF-1α基因29ShRNA表达载体的构建，其特征在于包括下述步骤(1)根据NCBI获取NM_001530.3，设计正义链5’CTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAG3’的29寡核苷酸干扰序列；(2)以pENTR/H1/TO为载体，依据质粒的插入位点和接头结构设计编码shRNA的单链DNA oligos，在正义链序列5’加入连接序列CACCA，中部加入loop环(GAGA)结构，反义链5’端加AAAA连接序列，3’端加T；设计最终连接的编码shRNA的DNA序列为正向CACCA CTACT CAGGA CACAG ATTTA GACTT GGAGG AGACT CCAAGTCTAA ATCTG TGTCC TGAGT AG，反向AAAAC TACTC AGGAC ACAGA TTTAG ACTTG GAGTCTCCTC CAAGT CTAAA TCTGT GTCCT GAGTA GT；(3)单链DNA oligos退火生成双链oligos，双链oligo连接pENTRTM/H1/TO载体，按照20μl反应体系进行连接反应，室温孵育5min，冰浴并转化感受态E.coli，用含50mg/l卡那霉素琼脂平板筛选阳性克隆；扩大培养阳性菌并提取得到pENTRTM/H1/TOhif-1α的重组质粒。
全文摘要
本发明公开了一种沉默食管癌细胞HIF-1α基因29shRNA表达载体的构建，依据NCBI数据库获得的HIF-1α基因ID，利用WHITEHOUSE，SiDirect和RationalsiRNA Design软件预测设计siRNA干扰序列，并利用BLAST分析干扰序列与人类全基因组的同源性；将siRNA序列转换成编码shRNA的DNA序列后克隆入pENTRTM/H1/TO载体，成功构建HIF-1α基因shRNA表达载体，并能有效抑制食管癌细胞HIF-1α的表达，为以HIF-1α为靶标的食管癌新药开发和基因治疗提供了新材料。
文档编号C12N15/113GK101864443SQ20101017861
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者孙蕾, 康巧珍, 张亚冰, 张聚真, 杨小静, 杨观瑞, 汲振余, 裘一兵, 赵立群, 郭欢, 阎红霞 申请人:河南省医药科学研究院