专利名称：一种定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法
技术领域：
本发明涉及一种定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法，属于生物医学技术领 域。
背景技术：
人工皮肤是一种能够在人体实现无损伤修复的皮肤组织。与传统的皮肤修复不 同，人工皮肤修复既不是自体皮肤修复，也不是异体皮肤移植式手术，其原理是将真皮成纤 维细胞与细胞外基质替代物混合制成人工皮肤，或单纯使用多孔的细胞外基质替代真皮植 入创面，上面移植上皮细胞覆盖或待自身上皮覆盖取代病损的皮肤。对于烧伤整形外领域 来说，由于运用组织工程皮肤来进行修复皮肤缺损和瘢痕，重建功能形态，不必考虑自身皮 源缺乏的问题，因此是一种解决大面积创面修复的理想方法。随着组织工程的发展，目前已经生产出了在组织学和功能上完全接近天然皮肤的 人工皮肤，虽然它并不完全具备所有的成分，但它具备角质层，它是皮肤的最外层，对皮肤 能够起到屏障保护、自我提供皮肤养分和支持性的作用，因此人工皮肤角质层的屏障功能 对于人工皮肤的功能具有非常重要的影响。但是，目前人工皮肤角质层的屏障功能只能根据对细胞的形态观察来进行评价， 属于主观性评价，准确度不高，而目前尚未有能够定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方 法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种能够定量评价人工皮肤角质 层屏障功能的方法。本发明的定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法，包括下列步骤(1)从人工 皮肤中分离出角质层；(2)获得角质层细胞层数；(3)获得角质层脂类含量；(4)获得角质 层对SDS屏障作用的定量数值；(5)根据(2)至(4)项的总体结果，计算出人工皮肤角质层 屏障功能的定量数值。优选地，本发明的定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法，包括下列步骤(1)从人工皮肤中分离出角质层；(2)获得角质层细胞层数电镜观察并记录角质层细胞层数；(3)获得角质层脂类含量提取角质层总脂质成分，用高效薄层色谱法进行分析 定量并计算出磷脂、游离脂肪酸和胆固醇含量之和占总脂含量的相对百分数；(4)获得角质层对SDS屏障作用的定量数值将不同浓度的SDS作用于人工皮肤 的角质层15小时，MTT检测细胞相对数量，计算出各浓度下细胞半数致死率；(5)根据(2)至(4)项的总体结果，计算出人工皮肤角质层屏障功能的定量数值。本发明的评价标准，在对第(1)至(3)项的数值进行评价时，第(1)项中的细胞层数可以分为5种等级，其中15-25层为4分，9-14层为3分，5_8层或者大于25层为2分， 1-4层为1分，O层为O分；第(2)项中的磷脂、游离脂肪酸和胆固醇含量之和占总脂含量的 相对百分数也分为5种等级，其中75-85%为4分，65-74%为3分，50-64%或者大于85% 为2分，11-50%为1分，0-10%为0分；第(3)项中的各浓度下细胞半数致死率(IC50，单 位mg/ml)也分为5种等级，其中2. 1-2. 5为4分，2. 6-3. 0为3分，1. 6-2. 0为2分，1-1. 5 为1分，小于1.0或者大于3.0为0分；最后根据第(1)至(3)项的得分结果，计算出人工 皮肤角质层屏障功能的定量数值，分为四种等级其中11-12分为优等，9-10分为良好，6-8 分为合格，小于6或者任一单项为0分为不合格。本发明的定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法具有如下技术效果1、本方法属于定量评价，相对于只根据表面形态进行评价的方法，更加准确严 谨；2、本发明的方法简单，便于操作。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
来对本发明作进一步的详细说明。本发明的所有实施例中的人工皮肤总脂质成分的提取是按照参考文献(Bligh， Ε. G, Dyer, W. J. ,1959. A rapid method of total lipidextraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37，911-917.)的方法进行。实施例1本实施例中，定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法，包括下列步骤(1)从人工皮肤中分离出角质层将人工皮肤放入0.01%蛋白酶K的PBS溶液 37°C,5% CO2的培养箱培养2小时，用镊子机械分离出角质层；(2)获得角质层细胞层数电镜观察并记录角质层细胞层数，有18层，得4分；(3)获得角质层脂类含量提取角质层总脂质成分，用高效薄层色谱(HPLC)进行 分析定量并计算出磷脂、游离脂肪酸和胆固醇含量之和占总脂含量的相对百分数为80%， 得4分；(4)获得角质层对SDS(十二烷基硫酸钠)屏障作用的定量数值将不同浓度的 SDS作用于人工皮肤的角质层15小时，四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞相对数量，计 算出各浓度下细胞半数致死率，为2. 8，得3分；(5)根据⑵至(4)项的总体结果，计算出人工皮肤角质层屏障功能的定量数值， 得12分，表明人工皮肤角质层屏障功能是优等。实施例2实施例2的步骤与实施例1相同，其结果如下电镜观察出细胞层数有10层，得3分；HPLC分析定量并计算出磷脂、游离脂肪酸 和胆固醇含量之和占总脂含量的相对百分数为71%，得3分；MTT检测细胞相对数量，计算 出各浓度下细 半数致死率，为2. 6，得3分；按照上述的总体结果，计算出人工皮肤角质层 屏障功能的定量数值，得9分，表明人工皮肤角质层屏障功能是良好。实施例3实施例3的步骤与实施例1相同，其结果如下
电镜观察出细胞层数有8层，得2分；HPLC分析定量并计算出磷脂、游离脂肪酸和 胆固醇含量之和占总脂含量的相对百分数为60%，得2分；MTT检测细胞相对数量，计算出 各浓度下细胞半数致死率，为1.6，得2分；按照上述的总体结果，计算出人工皮肤角质层屏 障功能的定量数值，得6分，表明人工皮肤角质层屏障功能是合格。实施例4 实施例4的步骤与实施例1相同，其结果如下电镜观察出细胞层数有3层，得1分；HPLC分析定量并计算出磷脂、游离脂肪酸和 胆固醇含量之和占总脂含量的相对百分数为70%，得3分；MTT检测细胞相对数量，计算出 各浓度下细胞半数致死率，为1. 5，得1分；按照上述的总体结果，计算出人工皮肤角质层屏 障功能的定量数值，得5分，表明人工皮肤角质层屏障功能是不合格。
权利要求
一种定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法，其特征在于，包括下列步骤(1)从人工皮肤中分离出角质层；(2)获得角质层细胞层数；(3)获得角质层脂类含量；(4)获得角质层对SDS屏障作用的定量数值；(5)根据(2)至(4)项的总体结果，计算出人工皮肤角质层屏障功能的定量数值。
2.根据权利要求1所述的定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法，其特征在于，包 括下列步骤(1)从人工皮肤中分离出角质层；(2)获得角质层细胞层数电镜观察并记录角质层细胞层数；(3)获得角质层脂类含量提取角质层总脂质成分，用高效薄层色谱法进行分析定量 并计算出磷脂、游离脂肪酸和胆固醇含量之和占总脂含量的相对百分数；(4)获得角质层对SDS屏障作用的定量数值将不同浓度的SDS作用于人工皮肤的角 质层15小时，MTT检测细胞相对数量，计算出各浓度下细胞半数致死率；(5)根据(2)至(4)项的总体结果，计算出人工皮肤角质层屏障功能的定量数值。
全文摘要
本发明提供了一种定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法，包括下列步骤(1)从人工皮肤中分离出角质层；(2)获得角质层细胞层数；(3)获得角质层脂类含量；(4)获得角质层对SDS屏障作用的定量数值；(5)根据(2)至(4)项的总体结果，计算出人工皮肤角质层屏障功能的定量数值。本发明的定量评价人工皮肤角质层屏障功能的方法具有如下技术效果1、本方法属于定量评价，相对于只根据表面形态进行评价的方法，更加准确严谨；2、本发明的方法简单，便于操作。
文档编号C12Q1/06GK101865899SQ20101020402
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者曹玉萍, 蒋明军, 邹运动 申请人:邹运动